一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法
阅读说明：本技术 一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法 (Mixed fermentation method of four microorganisms for synthesizing mcl-PHA ) 是由 贾晓强 李苏航 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法。四种微生物为重组菌P.putida-acs KT2440；A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心编号3.3928；酿酒酵母为S.cerevisiae L2612；醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。以淀粉为初始底物,先被A.niger水解为含葡萄糖的水解液,然后在S.cerevisiae L2612与A.orientalis混合发酵作用下生成含乙酸发酵液,最后P.putida-acsKT2440以乙酸为底物合成终产物mcl-PHA。通过人工构建混菌体系,将生物反应变成简单模块化工作,减少物质多级流动及能量消耗。(The invention relates to a mixed fermentation method of four microorganisms for synthesizing mcl-PHA. The four microorganisms are recombinant bacteria P.putida-acs KT 2440; niger is China general microbiological culture Collection center number 3.3928; saccharomyces cerevisiae L2612; acetobacter was identified as a. orientalis by sequencing. Starch is used as an initial substrate, hydrolyzed into hydrolysate containing glucose by A.niger, then fermented liquid containing acetic acid is generated under the mixed fermentation action of S.cerevisiae L2612 and A.orientalis, and finally the final product mcl-PHA is synthesized by P.putida-acsKT2440 by using acetic acid as a substrate. The mixed bacteria system is constructed manually, biological reaction is changed into simple modularization work, and multi-stage flowing of materials and energy consumption are reduced.)
技术领域
本发明提供一种合成mcl-PHA的微生物发酵方法。特别是涉及一种合成mcl-PHA的四种微生物混合发酵方法。
背景技术
在几种正在开发的可生物降解的聚合物中，PHA由于其性能和与常规石油化学衍生塑料的相似性而受到了广泛关注[1]。目前正在研究不同的PHA在药物，缝线的控制释放，缝线，在骨板，伤口敷料，医疗辅助设备和治疗设备中的潜在应用，根据其结构特征将其最初分为两组[2,3]，对于中链长度的PHA(mcl-PHA)，是具有6至14个碳原子的单体聚合物，高生产成本是生产PHA的主要缺点之一。因此，已经进行了许多努力来通过改善细菌，有效的发酵和回收过程来降低生产PHA的成本，中链长度的聚羟基链烷酸酯(mcl-PHA)是主要由革兰氏阴性细菌合成的聚酯。他们的大部分研究工作都集中在使用假单胞菌作为微生物细胞工厂。报道了油假单胞菌和其他荧光假单胞菌生物合成mcl-PHA。相关学者投入了大量精力来生产PHA。恶臭假单胞菌是优良的中链长度的PHA产生菌株，并且可以利用多种底物，例如脂肪酸。Chinwetkitvanich,S.等人研究温度和磷限制对活性污泥生物质生产和储存聚羟基链烷酸酯(PHA)的影响，经过10天发酵，测得混合液中的最大PHA浓度分别为1,491、1,294和1,260mg/L[4]。因此它无法与较低的成本的石化塑料竞争。通过开发更好的菌株，制定有效的PHA发酵和回收策略，科研人员也为降低PHA生产成本做出了许多努力，因此使用廉价碳源也是当前的热门话题。
淀粉是一种多羟基聚合物化合物。中国的淀粉产量仅次于美国，其来源广泛。在整个淀粉生产中，玉米淀粉的比例可以达到90％，马铃薯淀粉的比例可以达到7％。近年来，许多研究人员已将淀粉废水用作碳源并将其与活性污泥混合以生产PHA[4,5]。
活性污泥厌氧发酵是目前廉价的碳源生产PHA的常用方法，挥发性脂肪酸(Volatile Fatty Acid，简称VFA)由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等小分子挥发性有机酸组成，而厌氧发酵过程中产生的VFA含量比例高。由于VFA组成种类繁多，使得微生物利用其作为碳源时可合成不同碳链长度的PHA，因为VFA合成比例组分具有不稳定的特性，因此当微生物使用VFA时，它们无法产生单一的目标PHA类。WF Hu[6]仅通过调节使用乙酸钠作为碳源的培养液中加入活性污泥，并通过气体流量来调节和控制氧化还原电位，发现使用乙酸钠被用作唯一的碳源时PHA积累为细胞干重为35％(w/w)，说明乙酸可被用作底物合成PHA，且溶氧量在由EAS合成PHBV共聚物中的3HV亚基中起着非常重要的作用，溶氧量的高低直接决定了发酵周期。
传统活性污泥法合成PHA虽较普遍，但活性污泥发酵周期过长，少则几周，多则数月，在此发酵过程中，反应釜持续运转，消耗大量能源。目前也尚未有学者对活性污泥混合菌群进行分离培养，得到高效快速合成PHA的混合菌群。仅仅证明假单胞菌属为PHA合成优势菌属。而且传统活性污泥合成的PHA为短链PHA的混合物，不适用于合成mcl-PHA。
菌群微生物数量越多，代谢过程越复杂，物质转换效率也会随之下降。通过人工构建混菌体系，将复杂的生物反应变成简单的模块化工作，减少物质多级流动，仅使用几种微生物构建发酵体系合成mcl-PHA有利于提升mcl-PHA的生产效率。
References:
[1].Huang,T.Y.,et al.,Production of polyhydroxyalkanoates frominexpensive extruded rice bran and starch byHaloferax mediterranei.Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology,2006.33(8):p.701-706.
[2].Chen,L.J.and M.Wang,Production and evaluation of biodegradablecomposites based on PHB–PHV copolymer.Biomaterials,2002.23(13):p.2631-2639.
[3].Sudesh,K.,H.Abe and Y.Doi,Synthesis,structure and properties ofpolyhydroxyalkanoates:Biological polyesters.Progress in Polymer Science,2000.25(10):p.1503-1555.
[4].Chinwetkitvanich,S.,C.W.Randall and T.Panswad,Effects ofphosphorus limitation and temperature on PHA production in activatedsludge.Water Science&Technology,2004.50(8):p.135-143.
[5].Chua,A.S.M.,et al.,Production of polyhydroxyalkanoates(PHA)byactivated sludge treating municipal wastewater:Effect of pH,sludge retentiontime(SRT),and acetate concentration in influent.Water Research,2003.37(15):p.3602-3611.
[6].Hu,W.F.,et al.,Synthesis of polyhydroxyalkanoate(PHA)from excessactivated sludge under various oxidation-reduction potentials(ORP)by usingacetate and propionate as carbon sources.Applied Biochemistry&Biotechnology,2005.121-124(1):p.289-301.
发明内容
一种合成mcl-PHA的微生物发酵工艺，即通过联合四种微生物，以淀粉为初始底物水解生成葡萄糖，通过酸化作用生成乙酸，最后合成终产物mcl-PHA，首次实现了从淀粉到mcl-PHA的转化。
本发明涉及的重组菌P.putida-acs是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612，醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
本发明的一种合成mcl-PHA的微生物发酵方法，包括步骤如下：
1)：将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作培养液；
2)：将含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成琼脂小块，将其添加至淀粉原料培养基中，在摇床下进行培养，发酵生成葡萄糖水解液；
3)：使用糖化后的葡萄糖水解液作为底物，同时添加S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液为混合培养液，混合发酵生成含乙酸发酵液；
4)：使用3)中获得的乙酸发酵液作为底物，加入P.putida-acs KT2440培养液，在P.putida-acs KT2440胞内有效地积聚mcl-PHA。
所述步骤1)是将A.niger孢子在平板上画线生长形成黑色菌丝体，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作分别为S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acsKT2440培养液；
所述步骤2)将含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.5-1cm琼脂小块，将其添加至淀粉原料培养基中，在30℃，220r/min摇床下进行培养，发酵生成葡萄糖水解液。
所述步骤3)S.cerevisiae L2612培养液与Aorientalis培养液依照体积比1∶1-60制成混合培养液，取接入步骤2)生成的葡萄糖水解液；并按照混合培养液∶步骤2)生成的含葡萄糖水解液体积比1∶33-200进行摇床混合培养发酵，生成含乙酸发酵液。
所述步骤4)取P.putida-acsKT2440培养液并按照P.putida-acsKT2440培养液∶步骤3)生成的含乙酸发酵液体积比1∶33-200接种至步骤3)含乙酸发酵液中。
具体操作采用通用方法可以实现，本发明可以采用如下具体条件：
所述步骤1)是将A.niger孢子在平板上画线生长形成黑色菌丝体分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养发酵制作培养液。
所述步骤2)将含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.5-1cm琼脂小块，将其添加至淀粉原料培养基中，在30℃，220r/min摇床下进行培养，发酵生成含葡萄糖水解液。
所述步骤3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按照体积比比1∶1-60制成混合培养液，接入步骤2)生成的葡萄糖水解液；并按照混合培养液∶步骤2)生成的葡萄糖水解液体积比1∶33-200进行摇床混合培养发酵，生成含乙酸发酵液。
所述步4)取P.putida-acsKT2440培养液并按照P.putida-acsKT2440培养液∶步骤3)生成的含乙酸发酵液体积比1∶33-200接种至步骤3)含乙酸发酵液中。
所述的方法中将A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.5-1cm琼脂小块，加至100-200ml新鲜淀粉原料培养基中，在30℃、220r/min的摇床下好氧发酵42-60h生成含葡萄糖的发酵液。
所述的方法中分别制作S.cerevisiae L2612培养液、P.putida-acsKT2440培养液、A.orientalis培养液备用，培养24-36h；S.cerevisiae L2612使用YPD培养基，P.putida-acsKT2440使用LB培养基，A.orientalis使用醋酸杆菌培养基。
所述的步骤2)发酵时间42-60h；将S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液制成混合培养液，并取混合培养液1-3ml，接种到步骤2)中100-200ml含葡萄糖水解液中；依照厌氧培养12h，好氧培养12h的顺序于30℃摇床中交替发酵42-60h以生成含乙酸发酵液，其中厌氧培养转速150-220r/min，好氧培养转速200-220r/min。
所述的将P.putida-acsKT2440培养液接种至步骤3)含乙酸发酵液中，摇床发酵30℃，好氧转速220r/min，发酵42-60h，在P.putida-acsKT2440胞内合成mcl-PHA。
淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/LpH5.5-6.0。
P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
本发明研究发现：淀粉原料被A.niger水解为含有葡萄糖的水解液，同时使用高效液相色谱对水解液内葡萄糖进行检测，确定葡萄糖的生成及含量，含葡萄糖的水解液被S.cerevisiae L2612与A.orientali混合培养液发酵生成含乙酸发酵液，使用使用高效液相色谱对发酵液内乙酸进行检测，确定乙酸的生成及含量，如图1为液相色谱对葡萄糖与乙酸出峰情况的检测，putida-acsKT2440以乙酸发酵液中乙酸为底物，在putida-acsKT2440胞内积累生成mcl-PHA，图2为putida-acsKT2440利用乙酸等为碳源合成，mcl-PHA的变化；图3为putida-acsKT2440胞内合成mcl-PHA的产量。乙酸是putida-acsKT2440胞内合成mcl-PHA的直接碳源。因此mcl-PHA的产生不仅取决于P.putida-acsKT2440的性能，而且还取决于乙酸的浓度。
本发明的优点在于：以淀粉为初始底物，第一步先被A.niger水解为含葡萄糖的水解液，然后在S.cerevisiae L2612与A.orientalis混合发酵作用下生成含乙酸发酵液。最后P.putida-acsKT2440以乙酸为底物合成终产物mcl-PHA，实现从淀粉到mcl-PHA的四菌三步发酵工艺。发酵路径明确，实现对淀粉的有效利用，且总发酵时间为126-180h，远远少于传统方法合成PHA的发酵周期。该方法合成的mcl-PHA包含3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体，并无其他成分。本发明通过人工构建混菌体系，将复杂的生物反应变成简单的模块化工作，从而减少物质多级流动及能量消耗。
附图说明
图1：差示液相色谱峰4为葡萄糖，峰7为乙酸
图2：葡萄糖、乳酸、乙酸、甘油变化过程
图3：优化前后P.putida-acsKT2440的mcl-PHA含量和单体组成的优化
具体实施方式
实例1
重组菌P.putida-acs KT2440是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。
酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612。
醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
下面具体描述本发明的微生物合成mcl-PHA的工艺操作。
(1)将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acs KT2440的培养液。
A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/LpH5.5-6.0。
P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
(2)A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.5cm琼脂小块，并添加至100mL淀粉原料培养基发酵。培养基pH 6.4，发酵条件是在30℃和220r/min的转速下摇瓶培养，进行42h发酵；生成含葡萄糖水解液。
所述淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
(3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按1∶1比例混合为培养液，取2.5mL接入100mL含葡萄糖水解液。在摇床中于30℃(120r/min)的温度下进行培养。维持厌氧12h和好氧12h连续发酵，其中厌氧转速150r/min，好氧转速200r/min，发酵48h；生成含乙酸发酵液。
(4)在100mL含乙酸发酵液中加入2.5mL P.putida-acsKT2440培养液，培养液培养基pH 7.0，在30℃摇床(220r/min)下发酵培养6 0h。发酵结束后，使用气相色谱对mcl-PHA合成量进行分析，其中3-羟基癸酸酯含量为0.391g/L，3-羟基辛酸酯为0.12g/L，获得0.512g/L mcl-PHA总量。
目前，醋酸杆菌生产乙酸是获得大量乙酸的最佳方法。通过实验筛选得到高产乙酸的A.orientalis。A.orientalis和S.cerevisiae L2612的发酵方法大大缩短了加工时间。该发明在150h完成发酵，得到3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体组成的mcl-PHA。
实例2
重组菌P.putida-acs KT2440是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。
酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612。
醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
下面具体描述本发明的微生物合成mcl-PHA的工艺操作。
(1)将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acs KT2440培养液。
所述A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
所述S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
所述A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/L pH5.5-6.0。
所述P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
(2)A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.7cm琼脂小块，并添加至120mL淀粉原料培养基发酵。培养基120mL pH 6.5，发酵条件是在30℃和220r/min的转速下摇瓶培养，进行60h发酵。生成含葡萄糖的水解液。
所述淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
(3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按1∶30比例混合为培养液，取1.5mL接种于120mL含葡萄糖水解液。在摇床中于30℃(120r/min)的温度下进行培养。维持厌氧12h和好氧12h连续发酵，其中厌氧转速200r/min，好氧转速220r/min，发酵42h。生成120mL含乙酸发酵液。
(4)在120mL含乙酸发酵液中加入1mL P.putida-acsKT2440培养液，培养液培养基pH 7.1，在30℃摇床(220r/min)下发酵培养48h，发酵结束后，使用气相色谱对mcl-PHA合成量进行分析。其中3-羟基癸酸酯含量为0.388g/L，3-羟基辛酸酯为0.114g/L，获得0.41g/Lmcl-PHA总量。
目前，醋酸杆菌生产乙酸是获得大量乙酸的最佳方法。通过实验筛选得到高产乙酸的A.orientalis。A.orientalis和S.cerevisiae L2612的发酵方法大大缩短了加工时间。该发明在150h完成发酵，得到3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体组成的mcl-PHA。
实例3
重组菌P.putida-acs KT2440是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。
酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612。
醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
下面具体描述本发明的微生物合成mcl-PHA的工艺操作。
(1)将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acs KT2440培养液。
所述A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
所述S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
所述A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/L pH5.5-6.0。
所述P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
(2)A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.75cm琼脂小块，并添加至150mL淀粉原料培养基发酵。培养基pH 6.6，发酵条件是在30℃和220r/min的转速下摇瓶培养，进行42h发酵。生成150mL含葡萄糖的发酵液。
所述淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
(3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按1∶60比例混合为培养液，取2mL接入150mL含葡萄糖水解液。在摇床中于30℃(120r/min)的温度下进行培养。维持厌氧12h和好氧12h连续发酵，其中厌氧转速220r/min，好氧转速200r/min，发酵60h。生成150mL含乙酸发酵液。,
(4)在150mL含乙酸发酵液中加入3mL P.putida-acsKT2440培养液，培养液培养基pH 7.2，在30℃摇床(220r/min)下培养发酵48h，发酵结束后，使用气相色谱对mcl-PHA合成量进行分析，其中3-羟基癸酸酯含量为0.396g/L，3-羟基辛酸酯为0.125g/L，获得0.44g/Lmcl-PHA总量。
目前，醋酸杆菌生产乙酸是获得大量乙酸的最佳方法。通过实验筛选得到高产乙酸的A.orientalis。A.orientalis和S.cerevisiae L2612的发酵方法大大缩短了加工时间。该发明在162h完成发酵，得到3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体组成的mcl-PHA。
实例4
重组菌P.putida-acs KT2440是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。
酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612。
醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
下面具体描述本发明的微生物合成mcl-PHA的工艺操作。
(1)将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acs KT2440培养液。
所述A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
所述S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
所述A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/L pH5.5-6.0。
所述P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
(2)A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为0.75cm琼脂小块，并添加至170mL淀粉原料培养基发酵。培养基pH 6.6，发酵条件是在30℃和220r/min的转速下摇瓶培养，进行60h发酵。生成170mL含葡萄糖的水解液
所述淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
(3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按1∶50比例混合为培养液，1mL接入170mL含葡萄糖水解液。在摇床中于30℃(120r/min)的温度下进行培养。维持厌氧12h和好氧12h连续发酵，其中厌氧转速220r/min，好氧转速210r/min，发酵60h。生成170mL含乙酸发酵液。
(4)在170mL含乙酸发酵液中加入2.5mLP.putida-acsKT2440培养液，培养液培养基pH7.2，在30℃摇床(220r/min)下培养发酵48h，发酵结束后，使用气相色谱对mcl-PHA合成量进行分析，其中3-羟基癸酸酯含量为0.397g/L，3-羟基辛酸酯为0.123g/L，获得0.44g/L mcl-PHA总量。
目前，醋酸杆菌生产乙酸是获得大量乙酸的最佳方法。通过实验筛选得到高产乙酸的A.orientalis。A.orientalis和S.cerevisiae L2612的发酵方法大大缩短了加工时间。该发明在168h完成发酵，得到3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体组成的mcl-PHA。
实例5
重组菌P.putida-acs KT2440是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为2018-20180900753.6，发明名称为“一种提高P.putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
A.niger为中国微生物普通菌种保藏中心，编号为3.3928。
酿酒酵母为天津大学元英进教授实验室惠赠为S.cerevisiae L2612。
醋酸杆菌经测序鉴定为A.orientalis。
下面具体描述本发明的微生物合成mcl-PHA的工艺操作。
(1)将所得到的保存在斜面培养基的A.niger菌种转接到新的试管斜面上，经过培养待长满孢子继续转接到其他试管斜面培养基上以备使用，分别将S.cerevisiae L2612甘油菌、A.orientalis甘油菌、P.putida-acsKT2440甘油菌接种至试管中，进行摇瓶培养制作S.cerevisiae L2612培养液、A.orientalis培养液、P.putida-acs KT2440培养液。
所述A.niger培养液的培养基为蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L pH6.4-6.6。
所述S.cerevisiae L2612培养液的培养基为蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖20.0g/L。
所述A.orientalis培养液的培养基为酵母浸粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，乙醇4ml/L pH5.5-6.0。
所述P.putida-acsKT2440培养液的培养基为蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，pH 7.0-7.2。
(2)A.niger孢子在平板上画线生长14d，形成为黑色成熟菌丝体；含有A.niger黑色菌丝体琼脂平板培养基切成长宽为1cm琼脂小块，并添加至200mL新淀粉原料培养基发酵。培养基pH 6.6，发酵条件是在30℃和220r/min的转速下摇瓶培养，进行42h发酵。生成200mL含葡萄糖的水解液。
所述淀粉原料培养基为淀粉30g/L，酪蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaCl 1g/L，NH4Cl 0.1g/L，大豆豆油3ml。
(3)S.cerevisiae L2612培养液与A.orientalis培养液按1∶40比例混合为培养液取，3mL接入200mL含葡萄糖水解液。在摇床中于30℃(120r/min)的温度下进行培养。维持厌氧12h和好氧12h连续发酵，其中厌氧转速220r/min，好氧转速220r/min，发酵60h。生成200mL含乙酸发酵液。
(4)在200mL含乙酸发酵液中加入2mL P.putida-acsKT2440培养液，培养液培养基pH 7.2，在30℃摇床(220r/min)下培养发酵42h，发酵结束后，使用气相色谱对mcl-PHA合成量进行分析，其中3-羟基癸酸酯含量为0.393g/L，3-羟基辛酸酯为0.125g/L，获得0.45g/Lmcl-PHA总量。
目前，醋酸杆菌生产乙酸是获得大量乙酸的最佳方法。通过实验筛选得到高产乙酸的A.orientalis。A.orientalis和S.cerevisiae L2612的发酵方法大大缩短了加工时间。该发明在156h完成发酵，得到3-羟基癸酸酯和3-羟基辛酸酯两个单体组成的mcl-PHA。