阅读说明：本技术 (r)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的延胡索酸盐、制备方法及其用途 (Fumarate of (R) -3- (1- (2,3-dichloro-4- (pyrazin-2-yl) phenyl) -2,2,2-trifluoroethyl) -1-methyl-1- (1-methylpiperidin-4-yl) urea, preparation method and application thereof ) 是由 西尔维纳·加西亚卢比奥 莫罗·佩尔斯基尼 安吉洛·古埃纳兹齐 克劳迪奥·彼得拉 克劳迪奥·朱 于 2018-12-07 设计创作，主要内容包括：提供了与(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的延胡索酸盐有关的多种实施方式,和产生和使用所述延胡索酸盐来治疗与胃饥饿素水平升高有关的病况和病症,如过食、酒精成瘾和其它病症(例如,普拉德-威利综合征)的方法。还提供了与晶体HM04游离碱、HM04延胡索酸盐的不同晶体形式以及产生它们的方法有关的多种实施方式。(Various embodiments are provided relating to fumarate salts of (R) -3- (1- (2,3-dichloro-4- (pyrazin-2-yl) phenyl) -2,2,2-trifluoroethyl) -1-methyl-1- (1-methylpiperidin-4-yl) urea, and methods of making and using the fumarate salts to treat conditions and disorders associated with elevated ghrelin levels, such as hyperphagia, alcohol addiction, and other disorders (e.g., prader-willi syndrome). Various embodiments are also provided relating to the crystalline HM04 free base, different crystalline forms of HM04 fumarate and methods of producing the same.)

(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙 基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的延胡索酸盐、制备方 法及其用途

本发明申请主张2017年12月11日提交的美国临时专利申请No.62/597,236的权益，该专利申请出于任何目的以其全部内容作为参考并入本文。

技术领域

本发明公开涉及(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲((R)-3-(1-(2,3-dichloro-4-(pyrazin-2-yl)phenyl)-2,2,2-trifluoroethyl)-l-methyl-l-(l-methylpiperidin-4-yl)urea，也称为HM04或H0900)的延胡索酸盐(fumarate salt)，它是在与胃饥饿素(ghrelin)水平失调有关的疾病，如暴食(binge eating)、酒精成瘾(alcohol addiction)和其它病症(例如，普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome))的治疗中有用的有效的胃饥饿素/生长激素促分泌素受体(GHS-R1a)拮抗剂。本发明公开还涉及结晶的HM04游离碱、HM04延胡索酸盐的不同晶体形式和生产它们的方法。

背景技术

胃饥饿素是通过胃肠道中的胃饥饿素能细胞(ghrelinergic cell)所产生的生长激素释放肽，它应被理解为起到通过刺激食欲调节能量代谢的神经肽的作用。通过胃饥饿素/生长激素促分泌素受体(GHS-R1a)的胃饥饿素信号转导(ghrelin signaling)的调节，例如抑制，是与高胃饥饿素水平有关的病症的药理学治疗的有吸引力的靶标。使用胃饥饿素调节剂治疗的潜在病症包括过食(如暴食、肥胖症(obesity)、食欲过盛(hyperphagia，或食欲无法控制))、节食后体重回弹(包括节食后食欲过盛)、酒精成瘾和与胃饥饿素水平升高有关的遗传性疾病(例如，普拉德-威利综合征(PWS))。

在10000次分娩中大约出现1例PWS，并且PWS与亲代染色体15的15q11.2区的缺失或缺乏表达有关。PWS的特征包括身材较矮、低肌张力和食欲过盛。生长激素替代经常用于治疗生长缺陷和张力减退。然而，缺少对无法满足的食欲的治疗，并且PWS儿童可以成长为患有肥胖症和2型糖尿病的成人。在PWS中，胃饥饿素水平通常升高；然而，在PWS中，与胃饥饿素信号转导以及食物摄入的关系仍不清楚。参见Purtell L.等人,In adults withPrader-Willi syndrome,elevated ghrelin levels are more consistent withhyperphagia than high PYY and GLP-1levels.Neuropeptides.2011；45(4):301-7；Cummings D.E.等人,Elevated plasma ghrelin levels in Prader Willisyndrome.Nature Medicine.2002；8(7):643-4；DelParigi A.等人,High circulatingghrelin:a potential cause for hyperphagia and obesity in Prader-Willisyndrome.The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism.2002；87(12):5461-4。

因此，期望发现有效抑制GHSR1a，患者可忍受并且不干扰生长激素的其它功能的治疗。在美国专利No.9,546,157中报道了GHSR1a调节剂，包括抑制剂，如以下所显示的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲(HM04，H0900)。

然而，其中未公开其稳定的盐形式和晶体形式。

发明简述

实施方式1.(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的延胡索酸盐。

实施方式2.根据实施方式1所述的盐，其中所述盐是1:1的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲：延胡索酸盐。

实施方式3.根据以上实施方式中任一项所述的盐，其中所述盐至少50％处于晶体形式。

实施方式4.根据以上实施方式中任一项所述的盐，其中所述盐至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％处于晶体形式。

实施方式5.根据以上实施方式中任一项所述的盐包含选自形式1、形式2、形式3和形式4的至少一种晶体形式。

实施方式6.根据以上实施方式中任一项所述的盐包含具有与图12的XRPD图基本类似的XRPD图的形式1，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

实施方式7.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式2，其特征为XRPD图基本类似于图3的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

实施方式8.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式3，其特征为XRPD图基本类似于图15的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

实施方式9.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式4，其特征为XRPD图基本类似于图16的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

实施方式10.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式1，其特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于7.8±0.2、9.5±0.2、14.3±0.2、16.7±0.2、17.2±0.2、18.5±0.2、18.8±0.2、19.3±0.2、20.0±0.2、20.7±0.2、22.4±0.2、23.2±0.2、25.6±0.2、27.2±0.2、31.7±0.2和32.4±0.2度2θ的峰。

实施方式11.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式3，其特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于7.2±0.2、9.4±0.2、9.7±0.2、10.8±0.2、14.3±0.2、15.1±0.2、16.2±0.2、17.9±0.2、18.7±0.2、18.9±0.2、19.6±0.2、21.5±0.2、22.7±0.2、23.7±0.2、24.3±0.2、25.1±0.2、27.4±0.2、28.7±0.2和34.9±0.2度2θ的峰。

实施方式12.根据实施方式1至5中任一项所述的盐包含形式4，其特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于12.2±0.2、13.2±0.2、15.0±0.2、15.4±0.2、17.6±0.2、18.1±0.2、19.5±0.2、20.2±0.2、20.9±0.2、21.4±0.2、23.0±0.2、23.4±0.2、24.4±0.2、24.8±0.2、25.9±0.2、27.9±0.2、28.9±0.2、29.6±0.2、30.7±0.2度2θ的峰。

实施方式13.晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲具有与图1A的XRPD图基本类似的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

实施方式14.包含根据实施方式1至12中任一项所述的盐或根据实施方式13所述的晶体化合物的药物产品。

实施方式15.包含根据实施方式1至12中任一项所述的盐或根据实施方式13所述的晶体化合物和药物可用的载体的组合物。

实施方式16.制备包含(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲与延胡索酸合并的根据实施方式1至12中任一项所述的盐的方法。

实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中当与延胡索酸合并时，所述(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲处于固体形式。

实施方式18.根据实施方式16所述的方法，其中当与延胡索酸合并时，所述(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲处于溶液中。

实施方式19.根据实施方式16至18中任一项所述的方法，其中在与延胡索酸合并之前，对所述(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲进行酸/碱萃取。

实施方式20.根据实施方式16至18中任一项所述的方法，其中在与延胡索酸合并之前，未对所述(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲进行酸/碱萃取。

实施方式21.降低细胞中胃饥饿素信号转导活性的方法，其包括将所述细胞暴露于根据实施方式1至12中任一项所述的盐、根据实施方式13所述的晶体化合物、根据实施方式14所述的药物产品或者根据实施方式15所述的组合物。

实施方式22.根据实施方式21所述的方法，其中将所述细胞体外暴露于所述盐、所述晶体化合物、所述药物产品或者所述组合物。

实施方式23.根据实施方式21或实施方式22所述的方法，其中通过如经荧光成像板读数器(fluorescence imaging plate reader，FLIPR)测定所检测的胞内钙水平测量所述胃饥饿素信号转导活性。

实施方式24.根据实施方式23所述的方法，其中所述胞内钙水平降低。

实施方式25.降低受试者中胃饥饿素信号转导活性的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方式1至12中任一项所述的盐、根据实施方式13所述的晶体化合物、根据实施方式14所述的药物产品或者根据实施方式15所述的组合物。

实施方式26.治疗患有与胃饥饿素水平升高有关的病况或病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据实施方式1至12中任一项所述的盐、根据实施方式13所述的晶体化合物、根据实施方式14所述的药物产品或者根据实施方式15所述的组合物。

实施方式27.根据实施方式26所述的方法，其中所述病况或病症选自过食、酒精成瘾和普拉德-威利综合征。

实施方式28.根据实施方式26或实施方式27所述的方法，其中所述病况或病症选自暴食、肥胖症、节食后体重回弹和食欲过盛。

实施方式29.根据实施方式25至28中任一项所述的方法，其包括向所述受试者口服施用所述盐、所述晶体化合物、所述药物产品或者所述组合物。

实施方式30.根据实施方式25至29中任一项所述的方法，其中调节所述受试者的循环生长激素水平。

实施方式31.根据实施方式25至30中任一项所述的方法，其中降低所述受试者的循环生长激素水平。

实施方式32.根据实施方式25至31中任一项所述的方法，其中降低所述受试者的食物摄入。

实施方式33.根据实施方式25至32中任一项所述的方法，其中降低所述受试者的体重。

实施方式34.根据实施方式25至32中任一项所述的方法，其中稳定所述受试者的体重。

将在以下描述中部分说明其它目标和优势，并且根据描述另一部分是显而易见的或者可以通过实践学习的。将通过所附权利要求中具体指出的元素和组合实现和获得所述目标和优势。

应理解上述一般说明以及以下详细说明两者仅是示例性和说明性的并且不是对权利要求的限制。

引入本说明书中并构成说明书的一部分的附图显示了一种(几种)实施方式，并且与说明一起用于解释本文所述的原理。

具体实施方式

图1A和图1B(底部部分)显示了如实施例1A中所述，所制备的HM04游离碱晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图1B(顶部部分)显示了如实施例1B中所述，所制备的HM04游离碱晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图1C显示了如实施例2中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图2显示了如实施例3中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图3显示了如实施例3中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式2的代表性XRPD谱图。

图4A显示了在将HM04延胡索酸盐形式1和2以50:50的比例在乙腈：水(95:5)中，在60℃混合48小时之后所观察到的XRPD谱图。

图4B显示了在将HM04延胡索酸盐形式1和2以50:50的比例在乙醇中，在60℃混合48小时之后所观察到的XRPD谱图。

图5提供了HM04延胡索酸盐形式1的放大合成方法的总览并且在实施例5中对其进行了进一步详细描述。

图6显示了如实施例5中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1(在60℃干燥6小时之后)的代表性XRPD谱图。

图7显示了如实施例5中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1(在60℃干燥15小时之后)的代表性XRPD谱图。

图8显示了如实施例5中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1(在60℃干燥72小时之后)的代表性XRPD谱图。

图9显示了如实施例5中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1(在65℃干燥18小时之后)的代表性XRPD谱图。

图10提供了HM04延胡索酸盐形式1的流水线合成方法的总览并且在实施例6中对其进行了进一步详细描述。

图11提供了如实施例6，试验1中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图12提供了如实施例6，试验2中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图13提供了如实施例6，通过试验2的方法放大中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图14提供了如实施例6，试验3中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式1的代表性XRPD谱图。

图15提供了如实施例7中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式3的代表性XRPD谱图。

图16提供了如实施例8中所述，所制备的HM04延胡索酸盐晶体形式4的代表性XRPD谱图。

图17提供了口服剂量施用3mg/kg HM04游离碱和3mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)的大鼠中随时间的HM04血浆浓度(ng/mL)的比较。

图18提供了口服剂量施用2mg/kg HM04游离碱和2mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)的狗中随时间的HM04血浆浓度(ng/mL)的比较。

图19提供了口服剂量施用3、10和30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后，大鼠中随时间的HM04血浆浓度(ng/mL)的比较。

图20提供了口服剂量施用3、10和30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后，狗中随时间的HM04血浆浓度(ng/mL)的比较。

图21A显示了使用表达人GHSR1a受体的HEK293细胞的拮抗剂荧光成像板读数器(FLIPR)测定中HM04的浓度-反应曲线。

图21B显示了使用表达人GHSR1a受体的HEK293细胞的拮抗剂FLIPR测定中R011的浓度-反应曲线。

图21C显示了使用表达人GHSR1a受体的HEK293细胞的激动剂FLIPR测定中HM04的浓度-反应曲线。

图21D显示了使用表达人GHSR1a受体的HEK293细胞的激动剂FLIPR测定中R011的浓度-反应曲线。

图21E显示了肌醇-1-磷酸(IP-1)反向激动剂测定中HM04的浓度-反应曲线。

图21F显示了肌醇-1-磷酸(IP-1)反向激动剂测定中R011的浓度-反应曲线。

图22显示了在以下4个处理组中，在胃饥饿素注射之后0和15分钟时，在大鼠中所观察到的平均血浆生长激素浓度：1)1ml/kg盐水加10ml/kg 0.5％CMC p.o.(n＝6)；2)15μg/kg胃饥饿素i.v.加10ml/kg 0.5％CMC p.o.(n＝6)；3)在15μg/kg胃饥饿素i.v.之前2小时，30mg/kg HM04延胡索酸盐p.o.(n＝6)；4)在15μg/kg胃饥饿素i.v.之前30分钟，10mg/kg胃饥饿素拮抗剂R011 i.p.(n＝6)。

图23A显示了在单次腹膜内(intraperitoneal)施用以下试剂后1小时所测量的7个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和7个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(n＝6)；2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝6)；3)0.5mg/kg卡麦角林(cabergoline)(n＝6)；或者4)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)加0.5mg/kg卡麦角林(n＝6)。在注射前将小鼠禁食16小时并在注射后自由进食。

图23B显示了在单次腹膜内施用以下试剂后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时所测量的7个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和7个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(n＝6)；2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝6)；3)0.5mg/kg卡麦角林(n＝6)；或者4)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)加0.5mg/kg卡麦角林(n＝6)。在注射前将小鼠禁食16小时。

图24显示了在单次腹膜内施用以下试剂后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时所测量的3个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和3个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(n＝6)或者2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝6)。在注射前将小鼠禁食16小时并在注射后自由进食。

图25A显示了在单次腹膜内施用以下试剂后1小时所测量的12个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和12个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(Het n＝4；WT n＝6)或者2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(Het n＝4；WT n＝6)。在注射前将小鼠禁食16小时并在注射后自由进食。

图25B显示了在单次腹膜内施用以下试剂后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时所测量的12个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和12个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(Het n＝4；WT n＝6)或者2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(Het n＝4；WT n＝6)。在注射前将小鼠禁食16小时并在注射后自由进食。

图26显示了在单次腹膜内施用以下试剂后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时所测量的7个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和7个月大的野生型(WT)同窝小鼠中的食物摄入：1)媒介物(n＝5)或者30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝5)。在注射前将小鼠禁食16小时并在注射后自由进食。

图27A显示了连续10天在07.00小时腹膜内施用以下试剂后每天所测量的6个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和6个月大的野生型(WT)同窝小鼠的食物摄入，并且图27B显示了所述小鼠的体重：1)媒介物(n＝10)或者2)10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝10)。

图28A显示了连续5天在07.00小时口服施用以下试剂后每天所测量的8个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和8个月大的野生型(WT)同窝小鼠的食物摄入，并且图28B显示了所述小鼠的体重：1)媒介物(n＝5)或者2)30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝5)。

图29A显示了连续5天在18.00小时口服施用以下试剂后每天所测量的8个月大的Snord116+/-(Het)小鼠和8个月大的野生型(WT)同窝小鼠在光照周期中的食物摄入，并且图29B显示了所述小鼠在黑暗周期中的食物摄入：1)媒介物(n＝5)或者2)30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)(n＝5)。

发明详述

如以上所总结的以及如以下详细说明的，本发明公开涉及(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐、其晶体形式和(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲游离碱的晶体形式。本发明公开还涉及制备所述延胡索酸盐及其晶体形式的方法，和使用它们抑制GHSR1a的方法。

在以下所附描述中说明了本发明公开的详细信息。尽管可以在本发明公开的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等价的方法和材料，但是现将描述说明性方法和材料。根据描述并且根据权利要求，本发明公开的其它特征、目标和优势将是显而易见的。除非上下文明确规定，否则在说明书和所附权利要求中，单数形式还包括复数。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。在本说明书中引用的所有专利和专利公开以其全部内容作为参考并入本文。

本发明公开的一个方面涉及(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐。在本发明公开的至少一个实施方式中，所述盐为1:1的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲：延胡索酸盐。

所述盐可以处于多种形式，如油或固体。所述固体可以是无定形、晶体或两者的混合物。在本发明公开的至少一个实施方式中，所述盐至少50％处于晶体形式。在其它实施方式中，所述盐可以是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％晶体的。

如果所述盐为至少部分晶体的，则所述晶体形式可以选自形式1、形式2、形式3和形式4。

在至少一个实施方式中，所述盐包含晶体形式1，其特征为XRPD图基本类似于图12的XRPD图，如使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。在其它实施方式中，所述盐可以是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％晶体形式1的。

在一些实施方式中，形式1的特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于7.8±0.2、9.5±0.2、14.3±0.2、16.7±0.2、17.2±0.2、18.5±0.2、18.8±0.2、19.3±0.2、20.0±0.2、20.7±0.2、22.4±0.2、23.2±0.2、25.6±0.2、27.2±0.2、31.7±0.2和32.4±0.2度2θ的峰。

在至少一个实施方式中，所述盐包含晶体形式2，其特征为XRPD图基本类似于图3的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。在其它实施方式中，所述盐可以是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％晶体形式2的。

在至少一个实施方式中，所述盐包含晶体形式3，其特征为XRPD图基本类似于图15的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。在其它实施方式中，所述盐可以是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％晶体形式3的。

在一些实施方式中，形式3的特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于7.2±0.2、9.4±0.2、9.7±0.2、10.8±0.2、14.3±0.2、15.1±0.2、16.2±0.2、17.9±0.2、18.7±0.2、18.9±0.2、19.6±0.2、21.5±0.2、22.7±0.2、23.7±0.2、24.3±0.2、25.1±0.2、27.4±0.2、28.7±0.2和34.9±0.2度2θ的峰。

在至少一个实施方式中，所述盐包含晶体形式4，其特征为XRPD图基本类似于图16的XRPD图，如通过使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。在其它实施方式中，所述盐可以是至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％和100％晶体形式4的。

在一些实施方式中，形式4的特征为使用Cu Kα-辐射，XRPD图包含位于12.2±0.2、13.2±0.2、15.0±0.2、15.4±0.2、17.6±0.2、18.1±0.2、19.5±0.2、20.2±0.2、20.9±0.2、21.4±0.2、23.0±0.2、23.4±0.2、24.4±0.2、24.8±0.2、25.9±0.2、27.9±0.2、28.9±0.2、29.6±0.2、30.7±0.2度2θ的峰。

本发明公开的另一个方面涉及晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲游离碱，其特征为XRPD图基本类似于图1A的XRPD图，如使用Cu Kα-辐射的XRPD所确定的。

本发明公开的另一个方面涉及包含药物可用的载体和选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的药物组合物。所述药物可用的载体还可以包括赋形剂、稀释剂或表面活性剂。

可以分别根据常规混合、造粒或涂覆法制备组合物，并且本发明的药物组合物可以含有按重量或体积计约0.1％至约99％，约5％至约90％或者约1％至约20％的所公开的化合物。

本发明公开的另一个方面包括用于制备(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐及其晶体形式的方法，如在以下实施例中详细说明的。

本发明公开的另一个方面包括用于制备如本文所公开的晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的方法。

本发明公开的另一个方面为降低细胞中胃饥饿素信号转导活性的方法，其包括将所述细胞暴露于选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。

术语“胃饥饿素信号转导活性”是指当胃饥饿素结合其受体或受体复合物时所发生的下游活性中的任一种或组合。

本发明公开的另一个方面为抑制细胞中生长激素释放的方法，其包括将所述细胞暴露于选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。

本发明公开的另一个方面为抑制GHRS1a的方法，其包括将所述细胞暴露于选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。

在一些实施方式中，将所述细胞在体外暴露于选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。在一些实施方式中，将所述细胞在体内暴露于选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。

本发明公开的另一个方面为治疗患有与胃饥饿素水平升高有关的病况或病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。通过非限制性实例，与胃饥饿素水平升高有关的病况或病症可以包括过食症，如暴食、肥胖症、食欲过盛(食欲无法控制)、节食后体重回弹(包括节食后食欲过盛)、酒精成瘾和遗传性疾病，如普拉德-威利综合征等。

本发明公开的另一个方面为治疗患有与循环生长激素升高有关的病况或病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体。

“降低”或“抑制”表示与参考相比，减少、降低或终止活性、功能或量。在一些实施方式中，“降低”或“抑制”表示导致整体降低20％或以上的能力。在一些实施方式中，“降低”或“抑制”表示导致整体降低50％或以上的能力。在一些实施方式中，“降低”或“抑制”表示导致整体降低75％、85％、90％、95％或以上的能力。在一些实施方式中，在一段时间内，相对于相同一段时间内的对照剂量(如安慰剂)，抑制或降低以上所提及的量。本文所使用的“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准品或水平。参考可以得自健康或非患病样品。在一些实例中，参考得自一位或多位健康受试者，其不是正在进行测试或治疗的受试者。

术语“显著降低的”表示数值和参考数值之间足够高的降低程度，从而本领域技术人员将认为两个值之间的差异在通过所述值所测量的生物学特征的背景内具有统计显著性。在一些实施方式中，与参考值相比，显著降低的数值降低了大于约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者100％中的任一项。

在一些实施方式中，细胞或受试者对选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的暴露导致胃饥饿素信号转导活性降低。在一些实施方式中，与不存在(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐或晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲的情况下的胃饥饿素信号转导活性相比，细胞中或受试者中的胃饥饿素信号转导活性降低了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。

在一些实施方式中，通过经由荧光成像板读数器(FLIPR)测定所检测的胞内钙水平测量胃饥饿素信号转导活性。在一些实施方式中，对选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的暴露导致胞内钙水平降低。

FLIPR测定是指检测胞内钙流的G-蛋白偶联受体(例如，GHS-R1a等)激活和刺激的技术。可以使用钙敏感染料和荧光板读数器测量胞内钙水平。关于进一步的描述，参见Arkin,Michelle R.等人(2012).FLIPR^TM Assays for GPCR and Ion Channel Targets.InAssay Guidance Manual[Internet]Sittampalam G.S.,等人(主编)。

在一些实施方式中，通过循环生长激素水平测量胃饥饿素信号转导活性。在一些实施方式中，受试者对选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的暴露导致循环生长激素水平降低。

在一些实施方式中，通过食物摄入测量胃饥饿素信号转导活性。在一些实施方式中，受试者对选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的暴露导致食物摄入减少。

在一些实施方式中，通过体重测量胃饥饿素信号转导活性。在一些实施方式中，受试者对选自如本文所公开的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲延胡索酸盐和晶体(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲中的至少一种实体的暴露导致体重降低或者体重稳定。

“治疗”是获得有益或所期望的临床结果的方法。“治疗”覆盖了用于哺乳动物，包括人中疾病的治疗剂的任何施用或应用。出于本发明公开的目的，有益或所期望的临床结果包括(但不限于)以下中的任何一种或多种：一种或多种症状的减轻、病况程度减轻、预防或延迟病况的复发、延迟或减缓病况发展、改善病况状态、抑制病况或病况发展、终止病况发展和病况缓解(部分或完全)。“治疗”还涵盖了病况的病理后果的减轻。本文所提供的方法考虑了治疗的这些方面中的任何一种或多种。与以上一致，术语治疗不要求100％的除去病况或病症的所有方面。

本发明公开的另一个方面是口服施用如本文所公开的组合物以用于治疗与循环胃饥饿素水平升高有关的病况或病症。

本发明公开的另一个方面是口服施用如本文所公开的组合物以用于治疗与循环生长激素水平升高有关的疾病或病症。

使用如本文所公开的盐的用于口服剂量施用的治疗有效量和剂量施用方案将基于多种因素而改变，所述因素包括要治疗的病况或病症以及患者的年龄、体重、可能地性别和其它健康因素，这些因素可以在治疗时确定。治疗有效量可以在1mg至500mg的范围内。通过非限制性实例，口服剂量组合物可以含有1、5、10、15、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg如本文所公开的活性成分。

表1.在以下实施例以及本文其它处所使用的缩写和名称包括：

实施例

实施例1.(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲(HM04)游离碱的晶体形式1的制备和表征

实施例1A：HM04游离碱晶体形式1的晶种的制备

将第一15mg的(R)-3-(1-(2,3-二氯-4-(吡嗪-2-基)苯基)-2,2,2-三氟乙基)-1-甲基-1-(1-甲基哌啶-4-基)脲(也称为HM04或者H0900)的无定形游离碱样品溶于乙腈，并且将第二15mg的无定形游离碱HM04样品溶于丙酮。使溶液在氮气流下在干燥器中缓慢蒸发。通过X射线粉末衍射(XRPD)确认结晶度。在图1A和1B(底部部分)中分别显示了从乙腈溶液和丙酮溶液结晶的游离碱HM04样品的XRPD谱图(形式1)。

实施例1B：HM04游离碱晶体形式1的放大

将无定形HM04游离碱样品溶于0.5mL丙酮并使所述溶液在氮气流下在干燥器中缓慢蒸发。24小时后，获得棕色油状残余物，对其种入从丙酮溶液结晶的少量游离碱形式1的晶体(参见实施例1A)并用刮刀刮取。油固化并将所得产物在真空烘箱中，在50℃干燥24小时以获得95mg得率的晶体游离碱。

通过X射线粉末衍射(XRPD)确认结晶度，参见图1B，顶部部分。同步热分析(STA)表明晶体游离碱不是水合物或溶剂化物。晶体游离碱具有约155℃的估计的熔融起始温度(estimated melt onset)，如通过DSC所确定的。GVS分析表明产物轻微吸湿，其在高达70％的相对湿度(RH)，具有约1.5％的可逆重量增加，并且在高达80％RH，具有约2％的可逆重量增加。晶体游离碱的水溶性估计为小于2mg/mL。

实施例2.HM04延胡索酸盐形式1的小规模制备

将HM04无定形游离碱(100mg)在乙腈(2mL)中混悬。加入延胡索酸(27mg)，用额外的乙腈(0.2mL)将残余的酸冲洗至反应混合物并良好混合。轻轻加热混合物，固体快速沉淀。将所得混悬液在40℃和室温之间温度-循环过夜(18-24小时)。过滤产物，用乙腈(0.2mL)清洗，并在真空烘箱中，在50℃干燥24小时以获得86mg延胡索酸盐产物。

通过核磁共振(NMR)分析，延胡索酸盐产物显示为1:1的盐。通过XRPD确认结晶度并表示为形式1(图1C)。STA显示熔融前无重量损失，表明产物不是水合物或溶剂化物。DSC显示对应于约172℃的熔融起始温度的单一吸热。GVS显示延胡索酸盐是吸湿性的，其在高达70％的相对湿度(RH)，具有约2.8％的重量增加，并且在高达80％RH，具有约4.5％的重量增加。所述延胡索酸盐估计的水溶性大于200mg/mL。

实施例3.HM04延胡索酸盐的晶体形式(形式1和2)

将HM04游离碱(1.5mg)在乙腈(6mL)中混悬并加入延胡索酸(0.4g)。轻轻加热混合物，固体快速沉淀。将所得混悬液在40℃和环境温度之间温度-循环72小时。加入更多的乙腈(1mL)并过滤产物，用乙腈(5×0.2mL)清洗并在真空烘箱中，在50℃干燥至少24小时至恒重以获得1.6g的延胡索酸盐。通过XRPD分析将该结晶的HM04延胡索酸盐表征为形式1(图2)。

图3显示了在将HM04延胡索酸盐在乙醇中溶解并在室温下，在氮气下蒸发溶剂后所获得的HM04延胡索酸盐形式2样品的代表性XRPD图。

通过在加热的情况下，在0.45mL 90/10乙醇/水混合物中溶解150mg起始材料(HM04延胡索酸盐形式1)，将HM04延胡索酸盐形式2放大。将溶液在干燥器中，在氮气流下蒸发96小时并回收固体产物。形式2放大产物的XRPD图一般与小规模的产物一致，尽管不可以排除具有少量形式1的混合物的可能性。NMR分析显示产物与化学计量的单盐一致。STA数据显示在70℃和150℃之间存在约1.9％的重量损失，这表明样品可能是水合物。DSC数据显示了对应于熔融的约164.5℃起始的宽吸热峰(broad endotherm)。GVS显示高达70％RH的情况下，3.5％的重量增加和高达80％RH的情况下，4.9％的重量增加。在GVS之后，或者在将样品在干燥器中，在40℃/75％RH下放置7天之后，未观察到XRPD图的变化。

通过将形式1起始材料和形式2放大材料以约50:50的比例(10mg:10mg)混合来实施竞争性混浆实验(competitive slurry experiments)。将混合物在100μL不同溶剂或溶剂混合物中，在室温下振荡48小时。在溶剂蒸发后，在48小时之后，从每种浆液(slurries)中取出固体样品，并通过XRPD分析以确定是否发生了向一种形式的转化。将浆液在60℃重复，并在48小时之后再次采集样品。下表2显示了在室温和60℃时的研究结果。

表2.

溶剂	48小时/RT	48小时/60℃
			乙腈	形式1	形式1
乙腈：水(95：5)	形式1	未知
			乙醇	形式1&2	未知
乙醇：水(95：5)	形式2	油

在室温下，在乙腈中的竞争性混浆导致完全转化为形式1。在乙醇中的混浆导致产生了几种形式的混合物并且在环境温度下，在乙醇/水中的混浆导致了向形式2的转化。在60℃，在乙腈中的竞争性混浆导致完全转化为形式1。通过在乙腈/水和在乙醇中，在60℃混浆，观察到了未确定的XRPD图(分别为图4A和4B)。未进行对竞争性混浆结果的进一步研究。

实施例4.实施例1-3的分析方法

以下说明了用于表征实施例1-3中所述的产物的分析方法。

使用Perkin-Elmer STA 600TGA/DTA分析仪进行STA。以10℃/min的速率，将样品(5mg)从25℃加热至300℃，在此期间监测重量变化。以20cm³/min的流速，将氮气用作吹扫气体。

对于DSC分析，将5mg样品称量至DSC铝盘中并用铝盖非气密性密封。然后，将样品放入Perkin-Elmer Jade DSC中并保持在25℃直至获得稳定的热-流响应。然后，将样品以10℃/min的扫描速率加热至300℃，并监测所得的热流响应。使用20cm³/min的氦气吹扫气体。分析前，使用铟标准品对仪器进行温度和热流验证。

对于GVS分析，将15-20mg样品加入IgaSorp蒸气吸收天平(Hiden AnalyticalInstruments)。然后，通过维持0％的湿度环境干燥样品直至不再记录到重量变化。然后，对样品进行以10％RH的增量，从0至90％RH的升高谱，在各个步骤维持样品直至获得平衡(99％的步骤完成)。一旦达到平衡，将设备内的％RH升高至下一步，并重复平衡程序。在吸附循环完成后，使用相同程序干燥样品。然后，监测吸附/解吸循环期间的重量变化，从而使得能够确定样品的吸湿性。

使用Bruker Avance III 400仪，在DMSO-d⁶中进行NMR分析。

通过在XRPD零背景单一斜切二氧化硅样品座上轻轻挤压样品(约2mg)来进行XRPD分析。然后，将样品放入Philips X-Pert MPD衍射仪并使用以下实验条件：

管式阳极：Cu

发生器电压：40kV

管电流：40mA

波长α1：

波长α2：

起始角(2θ)：4

终止角(2θ)：40

连续扫描

实施例5.HM04延胡索酸盐形式1的放大合成

图5显示了如本实施例中所述的HM04延胡索酸盐形式1的合成的总览。

步骤1：化合物2A的合成

将2,2,6,6-四甲基哌啶(7.20kg，51.1mol，3.0eq，KF＝0.30％)加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的100L反应器中并在RT，在氮气保护下混合。将THF(50L)加入至所述反应器并搅拌。用氮气吹扫所述容器三次并冷却至0℃。在1小时内，将n-BuLi(20.4L，3.0eq；2.5M己烷溶液)滴加至所述混合物，同时将温度保持在约0℃至约5℃。溶液颜色变为黄色。将混合物在约0℃至约5℃搅拌30分钟。将混合物冷却至约-78℃至约-70℃以形成溶液A。

将化合物1(3.25kg，17.0mol.1.0eq，KF＝0.03％)溶于15L THF以形成溶液B。

在1小时内，将溶液B在约-70℃至约-78℃的温度下滴加至溶液A，然后搅拌30分钟以形成溶液C。将三-异丙基硼酸脂((i-PrO)₃B)(3.52kg，18.7mol.，1.1eq)在10分钟内滴加至溶液C。将反应混合物在约-70℃至约-78℃的温度下搅拌1小时。在30分钟内加入HCl(40L，3M，7.0eq)以使反应淬灭。注意到温度升高了10度。

分离所得水层并用EtOAc(40L)萃取。分离水层并再次用EtOAc萃取两次(35L，30L)。合并有机层以导致产生约160L的液体。用50L NaCl饱和的1M HCl水溶液清洗合并的有机层两次。将有机层在50L旋转蒸发仪中，在约50℃至约55℃的温度下，在30-40mmHg下浓缩约8小时至约5L。

用DME更换残余的EtOAc 3次(10L×3)。将有机层在50L旋转蒸发仪中，在约50℃至约55℃的温度下，在30-40mmHg下浓缩约6小时。每次保留约5L残余。将DME(20L)加入至所述残余物以获得14.2％的化合物2A的深棕色溶液(3.55kg在25kg溶液中；88.8％的得率；97.4％的纯度(通过HPLC获得的AUC，保留时间＝1.6分钟)；0.24％的残余乙酸乙酯)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝8.55(s,2H),7.36(d,1H),7.69(d,1H)。通过相同方法制备第二批化合物2A以产生3.29kg(95.4％的纯度，82.3％的得率，0.11％的残余乙酸乙酯)。

步骤2：化合物3A的合成

将化合物2A(2.91kg在20.5kg溶液中)在室温下，在氮气下加入至100L反应器中。顺序加入DME(45mL)、2-氯吡嗪(1.42kg，12.4mol.，1.0eq)和Pd(dppf)Cl₂(10％w/w，291g)，并在室温下，在氮气下分别混合。将氮气在混合物中鼓泡20分钟，并用氮气吹扫并填充所得混合物(3次)。将混合物在60分钟内加热至48-52℃。将K₂CO₃(2.57kg，18.6mol，1.5eq)在室温下加入至另一个反应器中的22L水中，然后在10分钟内滴加至化合物2A混合物。将混合物在48-52℃搅拌16小时，然后冷却至室温。重复该程序两次，并将所有三个批次混合。

K₂CO₃的水溶液(1.0kg)溶于22L水并添加至所述合并的混合物以将pH调节至9。将TBME(50L)加入至所述混合物并过滤(PET过滤器，3-5μm，205g/m²)以除去约50g的粘稠棕色固体材料(催化剂类似物)。将水层分离并用TBME萃取两次(40L，40L)。

将所述水层与根据以上方法制备的第4批次的水层合并。用HCl将合并的水层的pH调节至pH<3(2N，48L)。随着将混合物在室温下搅拌1小时，缓慢沉淀出固体。在30分钟内过滤混合物(PET过滤器，3-5μm，205g/m²)以获得20kg湿产品。将ACN(40L)在室温下加入至配备有顶置搅拌器的100L反应器。将20kg湿产品加入至所述反应器并将所述反应混合物加热回流并在回流下搅拌4小时。将所述反应混合物在3小时内冷却至室温(约15℃/小时)并过滤以获得8.5kg湿固体。将所述湿固体在50-55℃真空干燥(20-30mmHg)15小时以获得浅白色固体状的化合物3A(6.1kg；97.4％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝3.7分钟)；得率83.8％)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝7.67(d,1H),7.82(d,1H),8.75(d,1H),8.82(t,1H),8.98(d,1H),13.89(bs,1H)。

步骤3：化合物6A的合成

将化合物3A(6.1kg，22.7mol，1.0eq)加入至配备有测温传感器、顶置搅拌器和冷凝器的100L反应器。将甲醇(92L)在室温下加入至所述反应器。将所述混合物冷却至0-10℃并在0-10℃，在30分钟内滴加SOCl₂(5.4kg，45.3mol，2.0eq)。将所述反应混合物加热至回流(65℃)并在回流下搅拌15小时。形成混悬液。真空蒸馏除去大部分溶剂和SOCl₂直至剩余约30L。将混合物在50-55℃真空浓缩(30-40mmHg)约6小时。在-5至15℃，将水(10L)加入至所述残余物。在-5至15℃，用K₂CO₃的水溶液(200g，溶于2L水中)将pH调节至8-9。用乙酸异丙酯萃取所得水层两次(25L，25L)。用20L NaHCO₃水层清洗合并的有机层(约50kg)。分离有机层并用10L NaHCO₃的水溶液清洗。合并全部水层(55.8kg)。通过二氧化硅垫(30cm)过滤有机层并用额外的乙酸异丙酯清洗所述垫直至从硅胶中过滤出化合物6A(约3小时)。将所述有机层浓缩至约5L。将THF(10L)加入至所述残余物并在50-55℃，真空(30-40mmHg)浓缩约3小时至约5L(3次)。将另外10L THF加入至所述残余浓缩物，从而提供了化合物6A的浓缩溶液(15.8kg；32.83％，处于溶液中的5.19kg化合物6A；97.9％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝8.5min)；80.8％的得率)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝3.98(s,3H),7.54(d,1H),7.78(d,1H),8.63(d,1H),8.72(t,1H),8.94(d,1H)。

步骤4：化合物6B的合成

将THF(26L)在氮气下加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的100L

反应器。添加DIBAL-H(26kg，46mol，5.0eq)并用氮气吹扫和填充所述系统3次。将混合物冷却至-78至-70℃以形成溶液A。在-78至-70℃，在30分钟内，在氮气下滴加化合物6A(2.6kg，9.2mol，1.0eq)在52L THF中的室温溶液。将所述混合物在约5-6小时内加热至-30℃。将反应混合物在-40至-30℃搅拌30分钟。将所述混合物在1小时内缓慢加入至42L 2NHCl中，从而达到35℃的最高温度。用26L乙酸异丙酯萃取所述混合物。分离有机层并用30L盐水清洗。重复该程序并将两批有机层合并，并从约100L真空浓缩至约5-10L。浓缩期间缓慢形成固体。将所述混合物冷却至5-15℃并搅拌1小时。在30分钟内过滤混合物(30-50μm)。在50℃真空干燥固体6小时以获得棕色固体状的化合物6B(2.1kg；97.5％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝8.6min)；45.7％的得率)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝4.65(d,2H),5.68(t,1H),7.62(d,1H),7.68(d,1H),8.72(d,1H),8.80(t,1H),8.94(d,1H)。

步骤5：化合物7的合成

将DMSO(10L)在氮气下，在室温下加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的50L烧瓶中。在氮气下，在室温下添加化合物6B(2.05kg，8.04mol，1.0eq)。在氮气下，在RT添加Et₃N(8L)，然后将混合物冷却至15-20℃。将SO₃.吡啶(5.1kg，32.08mol，4.0eq)在5-15℃在单独的烧瓶中溶于10L DMSO，并在3.5小时内，在约20℃滴加至所述混合物。将反应混合物转移至70L冰水中。将混悬混合物在0-10℃搅拌1小时并通过1.5小时的离心过滤(PET，3-5μm，205g/m²)以获得棕色固体状的化合物7。将固体在室温下溶于35L DCM。用5L盐水清洗所得的DCM层。分离有机层并在40-45℃真空浓缩至干燥以获得棕色固体状的化合物7(2.33kg；96.3％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝9.2分钟)；93.5％的得率)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝7.67(d,1H),7.99(d,1H),8.67(d,1H),8.75(s,1H),8.99(d,1H),10.56(s,1H)。

步骤6：化合物8的合成

将THF(23L)在氮气下，在室温下加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的50L烧瓶中。将化合物7(2.3kg，9.1mol，1.0eq)和(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.21kg，10mol，1.1eq)在氮气下顺序添加至烧瓶。在氮气下，在30-35℃，在1小时内将Ti(OEt)₄(6.22kg，27.3mol，3.0eq)滴加至烧瓶。用氮气吹扫系统三次，然后将混合物在室温下搅拌2小时。将乙酸异丙酯(40L)加入至反应混合物。然后，将整个反应混合物加入至20L盐水，同时在RT缓慢搅拌。形成大量固体，未观察到放热。使用离心过滤固体(约18kg)，然后用20L乙酸异丙酯将所述固体再次混浆20分钟，再次过滤，从而获得了稍微减少的固体(17.3kg)。然后合并滤液并用20L盐水清洗。分离有机层并在真空(30-40mmHg)下，在40-50℃在旋转蒸发仪中浓缩约4小时以除去溶剂并获得棕色油(化合物8)。将所述油溶于DMF以获得黑色溶液(7.36kg；40.1％；3.0kg处于溶液中的化合物8；92.1％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝9.7分钟)；>100％的得率)。1H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.30(s,9H),7.59(d,1H),8.11(d,1H),8.64(s,1H),8.73(m,1H),8.97(s,1H),9.10(s,1H)。

步骤7：化合物11的合成

将DMF(26L，10v/w)在氮气下，在15℃加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的50L烧瓶中。将化合物8(7.3kg DMF溶液，含有2.9kg，8.1mol，1.0eq)和TBAA(2.44kg，8.1mol，1.0eq)在氮气下顺序添加至烧瓶。将混合物冷却至0-10℃。然后，将TMSCF₃(2.88kg，20.3mol，2.5eq)在0-10℃，在60min内添加至烧瓶。将反应混合物在0-5℃，在氮气保护下搅拌3小时。将乙酸异丙酯(60L)加入至所述混合物，随后在5-25℃，边搅拌边添加45L NaHCO₃。分离有机层，用NaHCO₃(30L×3)清洗3次，并从60kg浓缩至2.5kg的棕色油。将所述油产物溶于20L TBME，并通过硅胶垫(约40cm高，30cm直径)在2小时内过滤以获得2.14kg处于TBME溶液的化合物11。将溶液在45-50℃浓缩至干燥以获得黑色油状的化合物11(1.85kg；85.2％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝9.1分钟，非对映异构体为9.6分钟)；53.6％的得率)。1H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.33(s,9H),3.82-3.85(d,1H),5.61-5.66(m,1H),7.53-7.60(m,2H),8.63-8.64(d,1H),8.71-8.72(m,1H),8.95(s,1H)。

步骤8：化合物12(游离碱)的合成

将化合物11(1.8kg，4.23mol，1.0eq，粗)在氮气下，在25℃加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的50L反应器。加入无水MeOH(18L)以溶解化合物11。然后，在25-30℃，在10分钟内滴加MeOH/HCl(18L，1N)并且将混合物在25-30℃搅拌1小时。将水(15L)加入至所述反应并将所述混合物在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃浓缩约4小时以除去溶剂。用5LK₂CO₃溶液将混合物的pH调节至10。然后，将20L EtOAc添加至所述混合物并分离有机层，用EtOAc(15L×2)萃取水层两次。合并有机层并用10L盐水清洗。合并的有机层含有处于40kgEtOAc溶液中的996g化合物12(84％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝2.8分钟)。将所述有机层在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃，在旋转蒸发仪中浓缩约3小时至7.5kg的量的化合物12的EtOAc溶液(83％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝2.7分钟)。

在配备有测温传感器和顶置搅拌器的单独的50L反应器中，加入D-CSA(930g，4.0mol，1.0eq，相当于1.26kg的化合物12)并在室温下，在氮气下搅拌。将EtOAc(10L)，然后化合物12的EtOAc溶液(1.26kg，3.9mol，1.0eq)分别顺序添加至所述反应器。将混合物在室温下搅拌1小时并缓慢成为混悬液。通过离心过滤混合物并用EtOAc清洗以产生2.3kg黄白色固体状的化合物12(96.0％的纯度)。

将固体产物、20L的EtOAc，和10L 10％的K₂CO₃水溶液顺序添加至50L烧瓶并在室温下搅拌直至无固体保留(pH＝9-10)。分离有机层并用EtOAc萃取水层两次(10L×2)。合并有机层(约32kg)并用10L盐水清洗。所述有机层含有716g处于31.8kg溶液中的化合物12。

将有机层在45-50℃真空浓缩至约8L。将活性碳(200g)加入至所述有机层并将混合物在60-70℃搅拌1小时，冷却至室温，并使用布氏漏斗和滤纸(孔径：30-50μm)在30分钟内过滤以除去活性碳。将混合物在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃，在旋转蒸发仪中浓缩约3小时以获得710g黄色固体状的化合物12(99.4％的纯度)。

将D-CSA(410g，1.77mol，1.0eq，相当于680g化合物12)、3.4L iPrOH和68mL的水顺序添加至配备有测温传感器和顶置搅拌器的10L反应器并在室温下，在氮气下搅拌。1小时后，将混合物加热至回流(84℃)以形成溶液A。将化合物12(680g)溶于3.4L iPrOH并整体加入至溶液A。形成透明溶液并将温度降低至65℃。将混合物在65℃搅拌约15分钟，然后出现固体。将所述混合物在2小时内冷却至10℃，在10℃搅拌另外30分钟，并通过布氏漏斗和滤纸(孔径：30-50μm)在30分钟内过滤以收集1.1kg白色固体。

将EtOAc(10L)、1.1kg白色固体产物和5L 10％K₂CO₃顺序添加至20L烧瓶并混合5分钟。固体溶解(pH＝9-10)。分离EtOAc层并用EtOAc萃取水层两次(各5L)。合并有机层(约20L)，用5L盐水清洗，并在真空(30-40mmHg)下，在45-55℃，在旋转蒸发仪中浓缩约3小时以除去大部分溶液并直至残余重量达到1kg。将庚烷(1L)加入至所述混合物并在室温下搅拌30分钟。在30分钟内使用布氏漏斗和滤纸(孔径：30-50μm)过滤混合物以获得419g白色固体状的化合物12碱(compound 12base)(99.7％的纯度)。浓缩滤液至135g黄色固体状的化合物12(98.7％的纯度)。1H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝1.85(bs,2H),5.17(m,1H),7.56(d,1H),7.68(d,1H),8.62(d,1H),8.70-8.71(m,1H),8.93(s,1H)。合并产物导致得到了40.7％的化合物12的得率。

步骤9：化合物10的合成

在室温下，在氮气下，将Pd/C(40g，5％w/w)加入至10L高压釜反应器。将THF(2L)、2L甲胺(27％-30％的醇溶液，2.1eq)和800g化合物10A(7mol，1.0eq)顺序加入至所述反应器。用氢气吹扫系统三次。将混合物在氢气压力(50psi)下，在70-75℃搅拌过夜，然后在10分钟内，使用Büchner漏斗和滤纸(孔径：30-50μm)过滤以除去Pd/C。将滤液在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃，在旋转蒸发仪中浓缩约3小时以获得933g的黄色油。在不使用柱(column)的情况下，将混合物在大气压力下蒸馏，收集140-170℃部分以获得763g无色油状的化合物10(98.6％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝4.8分钟)；84.2％的得率；8000ppm的残余乙醇)。使用3cm塔，在大气压力下蒸馏一部分的油(563g)并收集140-170℃部分以获得510g化合物10(75.8％的得率；134ppm的残余乙醇)。1H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝0.82(bs,1H),1.10-1.12(q,2H),1.66(d,2H),1.73-1.81(t,2H),2.05(s,3H),2.08-2.19(m,1H),2.22(s,3H),2.60(d,2H)。

步骤10：HM04延胡索酸盐的合成

将DCM(1L)、200g CDI(1.23mol，2.0eq)和35g DABCO(0.31mol，0.5eq)顺序加入至配备有测温传感器和顶置搅拌器的3L反应器，并且在室温下，在氮气下搅拌。将混合物冷却至-10至-5℃。将化合物12(200g)溶于1L DCM并在1小时内滴加至所述混合物，然后在-10至-5℃搅拌16小时。在-10至0℃，在10分钟内添加化合物10(159g，1.24mol，2.0eq)。然后，将混合物加热至0至5℃并保持2小时。将混合物在真空下，在40-45℃浓缩至约1L。将HCl(1L的1N)加入至残余物并在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃，在旋转蒸发仪中浓缩约2小时以除去DCM。将另外3L的1N HCl加入至所述残余物并用TBME萃取3次(4L，2L，2L)。用20％的K₂CO₃水溶液(约1.5L)，将水层缓慢调节至pH＝9-10并用DCM萃取(2L×3)。合并有机层(约4L)并用0.25N KH₂PO₄清洗3次(1.2L×3)。用2L盐水清洗有机层以使pH达到中性，并在真空(30-40mmHg)下，在45-50℃，在旋转蒸发仪中浓缩约2小时至450g(335mL)。将MTBE(1.5L)加入至残余物并蒸馏直至收集500mL液体。通过添加500mL TBME并收集500mL馏出物，将该步骤重复4次，但例外是在最终蒸馏时收集了330mL的液体。约1至1.2L残余物保留在烧瓶中。使残余物缓慢冷却至室温并在室温下搅拌过夜。过滤混合物，用TBME清洗2次(400mL×2)，并干燥以获得192g浅黄色固体状的HM04游离碱(99.3％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝11.0分钟))。将壁上的产物溶于DCM并真空浓缩以获得22g棕色粘性油状的HM04游离碱(97.6％的纯度)。真空浓缩滤液以获得22.5g黄色固体(94.0％的纯度)。

将HM04游离碱(187g，0.39mol，1.0eq，99.3％的纯度)和1.9L ACN顺序添加至配备有测温传感器和顶置搅拌器的3L烧瓶中并在15℃，在氮气下搅拌以获得淡黄色混悬液。将延胡索酸(45.6g，0.39mol，1.0eq)加入至烧瓶并在1分钟后产生白色混悬液。将反应混悬液在室温下搅拌过夜，过滤(15-20μm，灰分<0.15)，用ACN清洗2次(50mL×2)并在50℃真空干燥6小时以获得207g浅黄色固体状的HM04延胡索酸盐(99.4％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝11.1分钟)；57.8％的得率；3100ppm的残余ACN)。真空浓缩滤液以获得20.1g浅黄色固体状的HM04延胡索酸盐(97.3％的纯度)。

将部分产物(117g)在真空烘箱(20-40mmHg)中进一步干燥以降低残余的乙腈含量。在60℃干燥6小时、15小时和72小时；和在65℃干燥18小时后，残余乙腈含量分别测量为3100ppm、2570ppm、1300ppm和256ppm。干燥处理后，分离了98g HM04延胡索酸盐(99.4％的纯度(通过HPLC的AUC，保留时间＝11.0分钟))；¹H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝1.49-1.58(m,2H),1.81-1.92(m,2H),2.44-2.53(m,5H),2.78(s,3H),3.12(m,2H),4.06-4.13(m,1H),6.36-6.41(m,1H),6.55(s,2H),7.47(d,1H),7.73(d,1H),8.11(d,1H),8.75(d,1H),8.81-8.82(m,1H),8.99(d,1H)。将部分批次干燥后分离的98g HM04延胡索酸盐的得率外推至整个批次以计算步骤10的48％的近似得率。

对在60℃干燥6小时、15小时和72小时；和在65℃干燥18小时后获得的HM04延胡索酸盐产物进行XRPD分析(分别参见图6-9)。XRPD谱图显示HM04延胡索酸盐产物与形式1一致。

实施例6.HM04延胡索酸盐形式1的流水线合成

使用实施例5的步骤10所产生的HM04延胡索酸盐的总得率计算为约48％。为了提高总得率，研究了无需分离HM04游离碱的步骤的流水线合成。具体地，改变了图5中所示的实施例5的方法的步骤10。图10显示了在实施例5的步骤9之后开始的流水线合成的总览。

HM04延胡索酸盐流水线试验1：将DCM(121.4g)、CDI(20.0g，123mmol，2eq)和DABCO(3.5g，31mmol)顺序加入至惰化的(inertized)1L反应器。将混合物冷却至-10℃。单独地，将DCM溶液(132.5g)和化合物12(20.0g，62.1mmol)加入至容器并搅拌直至获得溶液。通过将内部温度保持在-10至-5℃，将该溶液在33分钟内滴入1L反应器中。在添加结束时，用DCM(7.0g)漂洗容器，然后加入至反应混合物。搅拌过夜之后(19小时)，在15分钟内添加阳性IPC化合物10(15.9g，124mmol，2eq)并用DCM(9.0g)漂洗所述容器。在0℃加热，搅拌1小时，加入阳性IPC并另外搅拌1.5小时后，将混合物在室温下加热并加入水(200.1g)。分离水层，并用1N HCl(201，200g)萃取有机层2次。用TBME(148g)清洗含有产物的合并水层。除去有机层后，向水层中加入DCM(265.0g)和50％的K₂CO₃溶液(约240ml)直至达到pH 9.61。

同时，在水(240g)中制备KH₂PO₄(8.2g)的溶液。向含有产物的有机层中加入KH₂PO₄溶液直至达到pH 7.12(142.2g)。在分离水层后，用水(200g)清洗有机层。分离水层后，在50℃蒸发有机层。加入ACN(314.4g)，在70-75℃，在真空下再次蒸馏溶剂。加入ACN(235.8g)，在真空下再次蒸馏溶剂。加入ACN(141.5g)，将所得溶液深度过滤(polish filtered)并用ACN(16g)清洗过滤器。在60℃加热后，将延胡索酸(7.2g，62mmol)加入至所述溶液，导致产生了白色沉淀。在1小时内冷却至20℃后，过滤所述混悬液并用TBME清洗两次(2×30g)。在用氮气流在过滤器上干燥之后，获得了70.7g湿的粗产物。将其与TBME(177.0g)混浆1小时，过滤并用TBME(70g)清洗。在氮气流下在过滤器上干燥后，获得了33.0g湿产物。在真空下，在50℃加热提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物(21.1g；通过HPLC，99.8％的纯度；57％的得率)。XRPD分析确认产物为形式1(参见图11)。

使用X’Pert PRO PANalytical衍射仪以及以下实验条件进行实施例6、7和8中所述的XRPD分析：

管式阳极：Cu

管电压：40kV

管电流：40mA

波长α1：

波长α2：

起始角(2θ)：3

终止角(2θ)：40

计数时间：12,700秒

扫描方式：连续扫描

HM04延胡索酸盐流水线试验2：进一步优化如上所述的流水线法以利用HM04延胡索酸盐的优良结晶性质。除了省略了游离碱的分离和在添加ACN和延胡索酸之后直接分离HM04延胡索酸盐产物外，在该试验中还省略了游离碱的酸/碱萃取工序。与TBME中的浆液一起除去过量的延胡索酸。

将DCM(120g)、CDI(20.1g，124mmol，2eq)和DABCO(3.5g，31mmol)顺序加入至惰化的1L反应器。将混合物冷却至-10℃。单独地，将DCM溶液(133.8g)和化合物12(20.1g，62.4mmol)加入至容器并搅拌直至获得溶液。通过将内部温度保持在-10至-5℃，将该溶液在39分钟内滴入1L反应器中。在添加结束时，用DCM(7g)漂洗容器，然后加入至反应混合物。搅拌过夜之后(18小时)，在15分钟内添加阳性IPC化合物10(15.9g，124mmol，2eq)并用DCM(7g)漂洗所述容器。在0℃加热，搅拌1小时和加入阳性IPC后，向混合物中加入水(200g)并在室温下加热。

同时，在水(402g)中制备KH₂PO₄(13.8g)的溶液。分离水层，向含有产物的有机层中加入KH₂PO₄溶液直至达到pH 7。分离水层后，用水(200g)清洗有机层。分离水层后，深度过滤有机层并用ACN(64g)清洗过滤器。将延胡索酸(7.2g，62mmol)加入至所述溶液，从而导致产生了白色沉淀，将其过滤并用ACN(2×31.5g)清洗两次。在用氮气流在过滤器上干燥之后，获得了44.5g湿的粗产物。将其与TBME(266.8g)混浆1小时，过滤并用TBME(2×30g)清洗两次。在氮气流下在过滤器上干燥后，获得了45.0g湿产物。在真空下，在60℃干燥提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物(25.2g；通过HPLC，99.6％的纯度；68％的得率)。XRPD分析确认产物为形式1(参见图12)。

通过试验2的方法的HM延胡索酸盐的放大：将DCM(418g)、CDI(70.5g，435mmol，2eq)和DABCO(12.4g，111mmol)顺序加入至惰化的2L反应器。将混合物冷却至-10℃。单独地，将DCM溶液(465g)和化合物12(70.0g，217mmol)加入至容器并搅拌直至获得溶液。通过将内部温度保持在-10至-5℃，将该溶液在24分钟内滴入2L反应器中。在添加结束时，用DCM(25g)漂洗容器，然后加入至反应混合物。搅拌过夜之后(20小时)，在15分钟内添加阳性IPC化合物10(55.7g，434mmol，2eq)并用DCM(24g)漂洗所述容器。在0℃加热，搅拌1.5小时和加入阳性IPC后，向混合物中加入水(700g)并在室温下加热。

同时，在水(1401g)中制备KH₂PO₄(48.3g)的溶液。分离水层，向含有产物的有机层中加入KH₂PO₄溶液直至达到pH 7.03。分离水层后，用水(700g)清洗有机层。分离水层后，深度过滤有机层并用ACN(220.5g)清洗过滤器。将延胡索酸(25.3g，218mmol)加入至所述溶液，从而导致产生了白色沉淀，将其过滤并用ACN(111g)清洗。在用氮气流在过滤器上干燥之后，用TBME(933g)将产物混浆80分钟，过滤并用TBME(2×104g)清洗两次。在氮气流下在过滤器上干燥后，获得了80.8g湿产物。在真空下，在60℃干燥提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物(78.0g；通过HPLC，99.5％的纯度；61％的得率)。XRPD分析确认产物为形式1(参见图13)。

HM04延胡索酸盐流水线试验3：将DCM(120g)、CDI(20.2g，125mmol，2eq)和DABCO(3.5g，31mmol)顺序加入至惰化的1L反应器。将混合物冷却至-20℃。单独地，将DCM溶液(133g)和化合物12(20.0g，62.1mmol)加入至容器并搅拌直至获得溶液。通过将内部温度保持在-20至-15℃，将该溶液在35min内滴入1L反应器中。在添加结束时，用DCM(7.2g)漂洗容器，然后加入至反应混合物。搅拌过夜之后(24小时)，在10分钟内添加阳性IPC化合物10(15.9g，124mmol，2eq)并用DCM(7.0g)漂洗所述容器。在0℃加热，搅拌1小时和加入阳性IPC后，向混合物中加入水(200g)并在室温下加热。

同时，在水(402g)中制备KH₂PO₄(13.7g)的溶液。分离水层，向含有产物的有机层中加入KH₂PO₄(311.1g)溶液直至达到pH 7。分离水层后，用水(200g)清洗有机层。分离水层后，深度过滤有机层并用ACN(63g)清洗过滤器。将延胡索酸(7.2g，62mmol)加入至所述溶液，从而导致产生了白色沉淀，将其过滤并用ACN(32g)清洗。在用氮气流在过滤器上干燥之后，获得了53.7g湿的粗产物。将其与TBME(267.0g)混浆40分钟，过滤并用TBME(2×30g)清洗两次。在氮气流下在过滤器上干燥后，获得了41.8g湿产物。在真空下，在60℃干燥提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物(28.1g；通过HPLC，99.7％的纯度；76％的得率)。XRPD分析确认产物为形式1(参见图14)。

实施例7.HM04延胡索酸盐形式3的合成

将HM04游离碱(16.0g，33.6mmol)在惰化的1L反应器中溶于ACN(251g)。在60℃加热后，将延胡索酸(3.9g，33.6mmol)和具有ACN(2.6g)的漂洗液加入至溶液，从而导致产生了白色沉淀。在2小时内冷却至20℃后，过滤产物。在用氮气流在过滤器上干燥之后，获得了6.4g湿产物。在60℃真空干燥提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物。通过XRPD分析鉴别了不同的晶体形式，形式3(参见图15)。

实施例8.HM04延胡索酸盐形式4的合成

将DCM(120g)、CDI(20.0g，123mmol，2eq)和DABCO(3.5g，31mmol)顺序加入至惰化的1L反应器。将混合物冷却至-10℃。单独地，将DCM溶液(133g)和化合物12(20.0g，62.1mmol)加入至容器并搅拌直至获得溶液。通过将内部温度保持在-10至-5℃，将该溶液在35分钟内滴入1L反应器中。在添加结束时，用DCM(7.0g)漂洗容器，然后加入至反应混合物。搅拌过夜之后(18.5小时)，在10分钟内添加阳性IPC化合物10(15.8g，123mmol，2eq)并用DCM(6.8g)漂洗所述容器。在0℃加热，搅拌1小时，加入阳性IPC并另外搅拌20分钟后，将混合物在室温下加热并加入水(200g)。分离水层，并用1N HCl(2×200g)萃取有机层2次。用TBME(148g)清洗含有产物的合并水层。除去有机层后，向水层中加入DCM(265.0g)和50％的K₂CO₃溶液(约240ml)直至达到pH 9.66。

同时，在水(240g)中制备KH₂PO₄(8.2g)的溶液。向含有产物的有机层中加入KH₂PO₄溶液(138.2g)直至达到pH 7.10。分离水层后，用水(200g)清洗有机层。分离水层后，在40℃蒸发有机层。加入TBME(370g)并在65℃，在真空下再次蒸馏直至剩下10体积(收集到218.5g溶剂)。将延胡索酸(7.2g，62mmol)加入至所述溶液，导致产生了白色沉淀。在2小时内冷却至20℃并在该温度保持15小时后，过滤所述混悬液，将母液再循环一次，并用TBME(33g)清洗产物。在用氮气流在过滤器上干燥之后，获得了26.5g湿产物。在真空下，在50-60℃干燥提供了作为白色粉末的HM04延胡索酸盐的干燥产物(22.3g；通过HPLC，99.9％的纯度；61％的得率)。通过XRPD分析鉴别了不同的晶体形式，形式4(参见图16)。

实施例9.大鼠和狗中口服HM04游离碱和HM04延胡索酸盐的药物动力学比较

比较了剂量施用了使用HM04游离碱或HM04延胡索酸盐，在10％DMAC、6％Solutol和84％PBS的溶液中配制的3mg/kg HM04(基于游离碱重量)的单一口服施用的雄性SpragueDawley大鼠血浆中的HM04的药物动力学。在固定时间间隔抽出血液样品并通过LC-MS/MS测量HM04的血浆浓度。图17中提供了口服剂量施用了HM04游离碱和HM04延胡索酸盐的大鼠中HM04随时间的血浆浓度(ng/mL)的比较。

下表3中提供了药物动力学分析的总结。根据口服平均AUC与向三只雄性SpragueDawley大鼠静脉内施用3mg/kg HM04游离碱后所确定的990.3±24.6ng*h/mL的平均AUC的比计算了在3mg/kg HM04游离碱时的生物利用度(bioavailability)。根据口服平均AUC与向三只雄性Sprague Dawley大鼠静脉内施用3mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的2103.3±357.7ng*h/mL的平均AUC的比计算了在3mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)时的生物利用度。

表3.

^*N＝1；三只动物中的两只的浓度低于定量水平。

比较了剂量施用了使用HM04游离碱或HM04延胡索酸盐，在10％DMAC、6％Solutol和84％PBS的溶液中配制的2mg/kg HM04的单次口服施用的雄性Beagle狗血浆中的HM04的药物动力学。图18中提供了口服剂量施用了HM04游离碱和HM04延胡索酸盐的狗中HM04随时间的血浆浓度(ng/mL)的比较。

下表4中提供了药物动力学分析的总结。根据口服平均AUC与静脉内平均AUC的剂量归一化比值(AUC_po/AUC_iv×剂量_iv/剂量_po)计算了生物利用度。根据口服平均AUC与向三只雄性Beagle狗静脉内施用1mg/kg HM04游离碱后所确定的782.1±363.5ng*h/mL的平均AUC的剂量归一化比值计算了在2mg/kg HM04游离碱时的生物利用度。根据口服平均AUC与向三只雄性Beagle狗静脉内施用1mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的1126.1±363.6ng*h/mL的平均AUC的剂量归一化比值计算了在2mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)时的生物利用度。

表4.

实施例10.大鼠和狗中单次口腔递送HM04延胡索酸盐的药物动力学

研究了向6周大的雄性Sprague Dawley大鼠和雄性Beagle狗(1-5岁)单次口服施用HM04延胡索酸盐后血浆中的HM04的药物动力学。在5％的葡萄糖溶液中制备了0.6mg/mL、2mg/mL和6mg/mL HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)的测试制剂。作为三种测试制剂中每一种的5mL/kg的剂量的量，通过灌胃(gastric gavage)施用了3、10和30mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)剂量。每个剂量组中4只动物。向处于禁食条件的狗施用所述制剂，并在剂量施用后3小时提供食物。

图19提供了大鼠中HM04的血浆浓度(ng/mL)随时间的比较，下表5中提供了药物动力学分析总结。根据口服平均AUC与向4只雄性Sprague Dawley大鼠静脉内施用3mg/kgHM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的1760±196ng*h/mL的平均AUC的比计算了3mg/kg时的生物利用度(n＝4)。根据口服平均AUC与向4只雄性Sprague Dawley大鼠静脉内施用10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的6170±1770ng*h/mL的平均AUC的比计算了10mg/kg时的生物利用度。根据下式计算与平均口服生物利用度有关的标准偏差：

其中q＝平均生物利用度；mx＝口服剂量-归一化的平均AUC，并且my＝IV剂量-归一化的平均AUC。

表5

最后(last)＝上次测量的可检测浓度的时间。

BLQ＝低于定量限。

^*N＝1；4只动物中的3只的浓度低于定量水平。

⁺N＝2；^§N＝3。

对HM04的暴露随剂量而增加，其中在30mg/kg时超过了成比例的增加。在向大鼠单次口服施用3、10和30mg/kg后，HM04在4小时内达到其Cmax。在口服剂量施用后，在3和10mg/kg的剂量，以约40-50％的生物利用度吸收所述化合物。

图20提供了狗中HM04的血浆浓度(ng/mL)随时间的比较，下表6中提供了药物动力学分析总结。

表6

BLQ＝低于定量限。

^*确定了前剂量浓度。在相同动物中至少间隔4天进行剂量施用。

^**N＝3；在统计中排除作为异常值的狗3。

在3mg/kg时，HM04的4个剂量前浓度中的3个是可检测的(范围5.15-8.31ng/mL)。将样品重复两次进行再分析并确认为阳性。另外，在以10mg/kg口服时，狗2显示出可检测的剂量前浓度(8.60ng/mL)。该浓度不可能是先前3mg/kg剂量的残余浓度，因为该浓度在24小时时低于定量限。通过用0值替代，从计算中排除这些接近于分析方法的定量下限(2.5ng/mL)的值。

对于HM04延胡索酸盐的单次口服施用，在剂量施用后1小时内快速实现了HM04的最大浓度。除2只狗外，在剂量施用后长达24小时测量了该化合物的可检测浓度。在实现最大浓度后，HM04血浆水平降低，其表观终末半衰期(apparent terminal half-life)(范围在4-7小时)类似于静脉内施用后的半衰期(范围在4-5小时)。在3至30mg/kg的口服剂量范围内，尽管Cmax随剂量大致按比例升高，但AUC随剂量的升高大于正比。HM04的口服生物利用度较高，这与该化合物的低清除率一致。

根据各自口服AUC_∞与向相同4只雄性Beagle狗静脉内施用3mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的各自AUC_∞的比计算了3mg/kg时的口服绝对生物利用度。确定了以下各自的口服和IV AUC_∞值：狗1：分别为4930和6190ng*h/mL；狗2：分别为1440和3100ng*h/mL；狗3：分别为1160和3210ng*h/mL；和狗4：分别为1850和3070ng*h/mL。

根据各自口服AUC_∞与向相同4只雄性Beagle狗静脉内施用10mg/kg HM04延胡索酸盐(基于游离碱的重量)后所确定的各自AUC_∞的比计算了10mg/kg时的口服绝对生物利用度。确定了以下各自的口服和IV AUC_∞值：狗1：分别为17500和22500ng*h/mL；狗2：分别为8780和13200ng*h/mL；狗3：分别为8470和15500ng*h/mL；和狗4：分别为10900和14900ng*h/mL。

以96-孔板的形式(96-well plate format)蛋白沉淀后，通过LC-MS/MS测量了血浆HM04浓度。分析时，将样品在环境温度融化。向25μL大鼠或狗K3EDTA血浆等份中加标300μL内标(25ng/mL HM04-d8在乙腈中的溶液)。在轻微涡旋混合5分钟并在4℃以2010g离心15分钟后，使用P3-Evolution机器人系统(Perkin Elmer)将100μL的有机相等份转移至新的96-孔聚丙烯板中。在用100μL 10nM甲酸铵pH 3.5稀释后，将10μL等份注入LC-MS/MS系统。下表7提供了LC-MS/MS的条件。

表7

实施例11.HM04与胃饥饿素受体(GHSR1a)的拮抗剂活性

在荧光成像板读数器(FLIPR)测定中，使用HM04延胡索酸盐研究了HM04对胃饥饿素受体GHSR1a的结合性质，实验重复两次。HM04显示出对GHSR1a显著的拮抗剂活性，其IC50值为7.308nM。(图21A)。还使用参比GHSR1a拮抗剂R011进行了对比测试(WO2005/048916，实施例30)。R011显示出对GHSR1a的拮抗剂活性，其IC50值为343nM(图21B)。

在浓度高达10μM时，使用HM04和R011，未观察到激动剂活性(图21C和21D)。HM04和R011两者均未在肌醇-1-磷酸(IP-1)反向激动剂活性研究中显示出明确的显著反向激动剂活性(图21E和21F)。体外数据表明HM04是有效的胃饥饿素拮抗剂，且无激动剂或明确的反向激动剂活性。

用100％DMSO稀释化合物以制备30mM的储液(stock)。在测试日，从储液起始制备连续稀释。对于FLIPR测定：1)将8μl DMSO加入至2μl化合物储液(30mM)以产生10μl 6mM溶液；产生了6mM溶液的半倍连续稀释以产生10个剂量；2)通过在测定缓冲液(DMSO浓度2.5％)中1/40稀释储液，获得了测试溶液。对于IP-1测定：1)将29μl DMSO加入至1μl化合物储液(30mM)以产生30μl 1mM溶液；产生了1mM溶液的半倍连续稀释以产生10个剂量；2)通过在测定缓冲液(DMSO浓度1％)中1/100稀释储液，获得了测试溶液。

对于激动剂和拮抗剂活性研究，在(FLIPR)测定中使用了稳定表达人GHSR1a受体的HEK293细胞。在测试前1天，将细胞以1.5×10⁴个细胞/孔的密度接种至具有30μl完全DMEM培养基的涂层384-孔板中，并在37℃，在5％CO₂中培育22-26小时。在测试日，将4×上样染料加入至每个孔中(对于384孔板，10μl/孔)。将测定板在37℃，在黑暗中培育30分钟。通过以300rpm离心30秒除去染料含量。与PlateMate Matrix(低速环境，ThermoFisher Scientific)一起添加具有1mM丙磺舒(probenecid)的HBSS/Hepes(30μl)。然后，将板置于FLIPR Tetra(Molecular Devices)，并通过FLIPR(激动剂模式)添加10μl 4×工作浓度的HM04或R011。在细胞暴露于10μl 5×工作浓度的激动剂(通过FLIPR添加的化合物)之前，根据标准设置，在室温下通过FLIPR检测荧光信号10分钟。在连续3分钟内检测荧光信号(拮抗剂模式)。

对于反向激动剂活性研究，遵循上述相同的步骤至测试日。在测试日，通过以700rpm离心30秒除去培养基，并添加20μl/孔的含有HM04或R011的测定缓冲液。将测定板在37℃，在黑暗中培育1小时。使用multidrop Combi将IP1-d2(5μl)和AB-Cryp(5μl)顺序添加至所有的孔中。将板在室温下培育1小时，并在EnVision上，在620nm和665nm读数。

将数据报告为相对发光度单位(RLU)并使用GraphPad Software Inc.6版分析。通过非线性回归分析计算对于HM04和R011所测量的半最大抑制浓度(IC50)。

实施例12.HM04延胡索酸盐对大鼠中胃饥饿素所引起的生长激素升高的影响

将大鼠分成四组：1)1ml/kg盐水加10ml/kg 0.5％CMC p.o.(n＝6)；2)15μg/kg胃饥饿素i.v.加10ml/kg 0.5％CMC p.o.(n＝6)；3)30mg/kg HM04延胡索酸盐p.o.，2小时后15μg/kg胃饥饿素i.v.(n＝6)；4)10mg/kg胃饥饿素拮抗剂R011 i.p.，30分钟后，15μg/kg胃饥饿素i.v.(n＝6)。作为100μl样品，在时间0和胃饥饿素注射后15分钟收集血液。用64.8mg/kg戊巴比妥钠(sodium pentobarbital)使大鼠麻醉。将充满肝素化的盐溶液的导管***左股动脉以用于血液采集，并且其配备了伸缩管、1-mL采样注射器和3-通旋塞以允许过量血液返回。

使用大鼠GH ELISA(Millipore,目录号No.EZRMGH-45K)确定生长激素(GH)的血浆水平。重复进行两次测量。使用梯形法计算GH AUC 0-15min。将单因素和两因素ANOVA用于比较组间差异。所有值表示为平均值±SEM。实施单因素ANOVA，然后进行Turkey事后检验，其中通过p值<0.05或者p值<0.01表示显著性。

盐水注射导致血浆GH轻微升高。在注射后15分钟，胃饥饿素本身引起GH稳健升高。在i.v.施用15μg/kg胃饥饿素之后，平均血浆GH浓度在90-120ng/mL的范围内。HM04和R011两者将胃饥饿素引起的GH升高分别抑制了35％和78％。图22显示了在胃饥饿素注射后的时间0和15分钟，对四组中的每一组观察了平均血浆生长激素浓度(***p<0.01vs媒介物(vehicle)；###p<0.05，与单独的胃饥饿素相比)。

实施例13.HM04延胡索酸盐在Prader-Willi小鼠模型中的作用

与野生型(WT)同窝小鼠相比，在普拉德-威利综合征的Snord116+/-(Het)小鼠基因模型(Het小鼠)中研究了HM04延胡索酸盐对食物摄入行为和葡萄糖耐量的影响。由于D2R激动剂抑制食物摄入，使用FDA批准的D2R激动剂卡麦角林(cabergoline)作为实验对照。这种PWS小鼠模型的表型特征包括食欲过盛、出生后生长停滞、高胃饥饿素和低生长激素。Ding F.,等人SnoRNA Snord116(Pwcr1/MBII-85)deletion causes growth deficiencyand hyperphagia in mice.PloS one.2008；3(3):e1709。这些PWS小鼠的进食频率比WT同窝小鼠更高，特别是在光照周期期间，并且为食物工作的积极性更高(更高水平的压力(more level presses))(数据未显示)。

10mg/kg腹膜内(i.p.)剂量施用的HM04不会降低3、7或12个月大的WT小鼠中的食物摄入(参见图25-27)。在3个月大的Het小鼠中，在剂量施用后12和24小时，HM04(10mg/kg，i.p.)抑制食物摄入(图26)。在12个月大的Het小鼠中，在剂量施用后1小时，HM04(10mg/kg，i.p.)抑制食物摄入(图25A)，但是未维持该抑制水平(图25B)。在7个月大的Het小鼠中，在剂量施用后，以30mg/kg i.p.剂量施用的HM04抑制食物摄入长达8小时，但是在WT小鼠不抑制(图26)。当每天在07.00小时，向8个月大的Het小鼠以30mg/kg口服施用HM04 5天时，食物摄入减少达2天且不影响体重(图30A和30B)。当在黑暗周期期间，在18.00小时向8个月大的小鼠以30mg/kg口服施用HM04时，在随后的光照周期期间，在第2、3、4和5天，食物摄入降低且在第5天达到显著(图31A)。

与食物摄入效果相反，HM04未在Het小鼠中显示出葡萄糖耐量的改善，然而在WT小鼠中观察到了这种效果。这些结果表明HM04可以改善与PWS有关的食欲过盛，尽管与年龄、昼夜节律、能量状态和代谢有关的因素可能影响药理学反应。

急性施用：将小鼠(3、7和12个月大)禁食16小时，然后根据下表8，施用单次腹膜内注射的媒介物或含有HM04、卡麦角林或HM04和卡麦角林的媒介物。

表8.

将HM04溶于注射用水，将卡麦角林溶于DMSO以提供5％的注射用DMSO/水溶液。然后，小鼠自由获取食物，并且在剂量施用后1、2、4、8、12和24小时测量累积食物摄入。由于Het小鼠显著小于它们的WT同窝对照，因此将食物摄入表示为每g体重的摄入量。使用2因素ANOVA、Bonferroni事后检验(Graphpad Prism,Prism 5.0,San Diego,CA)分析数据的显著性。

对于7个月大的群组(cohort)，与媒介物处理的WT小鼠相比，在媒介物处理的Het小鼠中，累积食物摄入显著升高。在两种基因型中，卡麦角林抑制食物摄入。相反，HM04(10mg/kg)在WT或Het小鼠中不抑制食物摄入，并且不能提高卡麦角林对食物消耗的抑制作用(图23A和23B)。

对于3个月大的组，对于前8小时，在媒介物处理的小鼠中，累积食物摄入无显著差异。在12和24小时，Het小鼠消耗了比wt小鼠更多的食物。在Het小鼠中，在剂量施用后12和24小时，用HM04(10mg/kg)处理显著抑制了食物摄入(参见图24)。HM04不能抑制WT小鼠中的食物摄入。

在12个月大的小鼠中，媒介物处理的Het小鼠中的食物摄入显著大于WT小鼠。在剂量施用后1小时，HM04(10mg/kg)抑制Het小鼠中的食物摄入(图25A)；然而，未维持该抑制水平(图25B)。

还评价了施用媒介物或30mg/kg的更高剂量的HM04的7个月大的Het和WT小鼠组。HM04(30mg/kg)对WT小鼠中的食物摄入无明显影响，但是抑制Het小鼠中的食物摄入达8小时(图26)。

每天施用：为了测试如果每天施用，HM04是否可以更有效，用媒介物或含有HM04(10mg/kg ip)的媒介物每天在07.00小时对6个月大的小鼠注射一次，注射10天，并且每天在07.00小时或18.00小时，通过口腔管饲法(oral gavage)，用媒介物或含有30mg/kg更高剂量的HM04的媒介物处理8个月大的小鼠5天。下表9提供了总结。每天测量食物摄入和体重。

表9

在6个月大的组中，在媒介物处理的WT和Het小鼠中，食物消耗无显著差异。用HM04(10mg/kg)每天处理对WT和Het小鼠中的食物摄入(图27A)或体重(图27B)无明显影响。

在光照周期期间，在07.00小时处理的8个月大的组中，到第2天观察到食物摄入显著减少，但在后续天中未观察到(图28A)。体重未受影响(28B)。在HM04 WT小鼠中，未观察到食物摄入或体重的降低(图28A和28B)。

对于在黑暗周期期间，在18.00小时处理的8个月大的组中，在光照和黑暗周期期间测量了食物摄入。尽管在黑暗周期开始时，用HM04处理小鼠，但是在WT或Het小鼠中，在黑暗周期期间未观察到食物消耗的抑制(图29B)。在后续光照周期期间(06.00-18.00)，在第2、3、4和5天，HM04处理的Het小鼠中食物摄入降低，但是WT小鼠未降低，并且在第5天达到显著(图29A)。

以上书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施方式。以上描述和实施例详细说明了某些实施方式并且描述了发明人所考虑的最佳方式。然而，将理解无论可以在正文中多么详细地描述上述内容，但是可以以多种方式实践实施方式并且应根据所附权利要求及其任何等价形式进行理解。

如本文所使用的，无论是否明确表示，术语约是指数值，包括(例如)整数、部份和百分比。术语约一般地表示本领域技术人员将认为等于所列举的数值(例如，具有相同功能或结果)的范围数值(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当术语，如至少和约置于数值或范围列表之前时，该术语修饰该列表中所提供的所有的值或范围。在一些情况下，术语约可以包括圆整至最近的有效数字的数值。