一种缺氧可调控的启动子在car-t中的应用
阅读说明：本技术 一种缺氧可调控的启动子在car-t中的应用 (Application of hypoxia-controllable promoter in CAR-T ) 是由 张巍 朱秀秀 赵永春 赵文旭 陈军 黄霞 于 2019-03-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于免疫治疗技术领域,具体涉及一种缺氧可调控的启动子在CAR-T中的应用,一种缺氧可调控的启动子的CAR结构、表达载体、CAR-T细胞及其应用以及提高缺氧环境下CAR-T细胞分泌IFN-γ和/或IL-2因子能力的方法和提高缺氧环境下CAR-T细胞杀伤能力的方法。所述CAR结构含有缺氧可调控的启动子,所述缺氧可调控的启动子由Hif1a调节元件和迷你启动子连接构成,所述Hif1a调节元件的重复数为3-5个。所述缺氧微环境诱导启动的所述CAR结构,不仅可以有效的表达于T淋巴细胞,而且在缺氧环境中能够加强CAR-T细胞的活化,增强CAR-T有效性和安全性,能够用于肿瘤的靶向治疗。(The invention belongs to the technical field of immunotherapy, and particularly relates to application of an hypoxia-controllable promoter in CAR-T, a CAR structure of the hypoxia-controllable promoter, an expression vector, CAR-T cells and application thereof, a method for improving the capability of the CAR-T cells to secrete IFN-gamma and/or IL-2 factors under a hypoxia environment, and a method for improving the killing capability of the CAR-T cells under the hypoxia environment. The CAR structure comprises an hypoxia-controllable promoter which is formed by connecting a Hif1a regulatory element and a mini-promoter, wherein the Hif1a regulatory element has the repetition number of 3-5. The CAR structure initiated by the hypoxia microenvironment induction can be effectively expressed in T lymphocytes, can enhance the activation of CAR-T cells in the hypoxia environment, enhances the effectiveness and safety of CAR-T, and can be used for the targeted therapy of tumors.)
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种缺氧可调控的启动子在CAR-T中的应用，一种缺氧可调控的启动子的CAR结构、表达载体、CAR-T细胞及其应用以及提高缺氧环境下CAR-T细胞分泌IFN-γ和/或IL-2因子能力的方法和提高缺氧环境下CAR-T细胞杀伤能力的方法。
背景技术
CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，其在血液系统瘤中取得较好的成绩，但CAR-T在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为CAR-T较难进入实体瘤内部，一方面即便CAR-T细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响CAR-T细胞在实体瘤治疗的疗效；并且由于实体瘤异质程度高，实体瘤靶点往往在正常组织也有所表达，因此还存在脱靶风险等安全问题。虽然目前有构建***CAR、有构建双CAR(构建带有双抗原的CAR-T)或带有激活抑制功能的iCAR的结构以期望提高肿瘤CAR-T治疗的有效性和安全性，但这些CAR结构仍存在安全性或较难被激活的问题。因此，构建一种在肿瘤微环境中特异启动活化的CAR结构很有必要。
酸性和缺氧是肿瘤微环境中的两大物理因素，肿瘤中的大部分的细胞都处在缺氧的环境中，而缺氧改变了肿瘤细胞的糖代谢途径，产生大量的乳酸，造成肿瘤微环境中酸性的特征，而这些酸性可以降低肿瘤细胞凋亡，增强细胞的增殖和生长，并且帮助肿瘤细胞的迁移。缺氧在实体瘤微环境研究比较清楚，如果可以设计在缺氧条件下被激活的可调控启动子，就可以达到在肿瘤微环境中特异性激活下游蛋白的表达从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性的目的，因此本发明创造性的将设计构建的缺氧可调控的启动子联合CAR-T细胞技术应用到肿瘤的免疫治疗当中。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种缺氧可调控的启动子在CAR-T中的应用，所述缺氧可调控的启动子能够在缺氧环境强化目的基因表达，增强目的因子(蛋白、核酸等)的表达，提高抗肿瘤的药物疗效。
本发明从肿瘤自身的缺氧微环境出发，通过构建缺氧激活的调控元件特异性调控蛋白的表达，通过体外药物构建缺氧环境的成功以及后续的CAR-T杀伤的结果显示在CoCl2诱导的缺氧条件下的CAR-T比不诱导的CAR-T有更强的杀伤作用，同时说明了所构建的CAR结构和CAR-T具有缺氧微环境被动靶向性特征，在缺氧微环境中有更强活性和杀伤力，而在非缺氧微环境中则体现出了安全性特征。这对CAR-T的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。
本发明的目的之二在于提供一种包含一种缺氧可调控的启动子的CAR结构。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述CAR结构含有缺氧可调控的启动子，所述缺氧可调控的启动子由Hif1α调节元件和迷你启动子连接构成，所述Hif1α调节元件的重复数为3-5个。
优选的，HRE的重复数为5个。
进一步，所述迷你启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子(miniCMV)、HSV胸苷激酶(TK)的启动子(Mini-TK)、猿猴病毒40(SV40)的启动子(minSV40)、腺病毒晚期启动子(MLP)或者合成启动子。
优选的，迷你启动子选***iCMV。
进一步，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1为重复的5个HRE调控元件与弱启动的CMV mini Promoter联用构成，结构为5HRE-CMVmini promoter；SEQ ID NO.2为对SEQ ID NO.1序列两端进行优化，便于启动子与载体的匹配。
优选的，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述ScFv包含氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ IDNO.8所示的轻链可变区或者包含氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ IDNO.10所示的轻链可变区或者氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示的重链可变区和SEQ IDNO.41所示的轻链可变区。
某些实施例中，所述ScFv结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33或SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.36所示。
所述CAR结构可以是常规的第一代、第二代、第三代CAR结构，也可以是改进的双CAR、可调控CAR结构(如FRB/FKBP12调控)等新型CAR结构。
进一步，所述抗原识别区所识别的抗原为CD19、CD20、CD123、CD22、BCMA、ROR1、间皮素、PSCA、PSMA、c-Met、GPC-3、Her2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR中的任意一项或多项。
进一步，所述重链氨基酸序列SEQ ID NO.7和轻链氨基酸序列SEQ ID NO.8的CDR1、CDR2以及CDR3分别为SEQ ID NO.7的第26-第33位、第51-第58位，第97-第101位；SEQID NO.8的第23-第31位、第49-第51位，第88-第96位。
进一步，所述重链氨基酸序列SEQ ID NO.9和轻链氨基酸序列SEQ ID NO.10的CDR1、CDR2以及CDR3分别为SEQ ID NO.9的第26-第33位、第51-第57位，第96-第109位；SEQID NO.10的第27-第32位、第50-第52位，第89-第97位。
进一步，所述CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
所述包含所述缺氧启动子的CAR结构中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4。
所述包含所述缺氧启动子的CAR结构中跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86。
所述包含所述缺氧启动子的CAR结构中胞内信号区可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127。
在某些实施例中，所述包含所述缺氧启动子的CAR结构带有截短的EGFRt调控标签；在某些实施例中，包含所述缺氧启动子的CAR为通用型CAR结构；在某些实施例中，包含所述缺氧启动子的CAR结构带有***基因如iCasp9。
在某些实施例中，抗原识别区可以为识别靶抗原的配体/受体；在某些实施例中，ScFv可以是鼠源抗体或全人源抗体或人鼠嵌合抗体的ScFv，也可以是鲨鱼、羊驼或骆驼抗体等单域抗体，也可以是双特异性抗体，也可以是人工设计的识别特定靶点的靶点特异性纤连蛋白III型(FN3)结构域组合。
在某些实施例中，所述CAR结构包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRA、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16、和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或胞内信号结构域(例如，DAP12)相互作用。
本发明的目的之三在于提供一种所述CAR结构的表达载体。
为实现上述目的，本发明采用如下方案：
所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、单纯疱疹病毒载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。
优选的，所述载体是慢病毒载体。
在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。
在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(oPRE)。
在某些实施例中，所述5'LTR的启动子经异源启动子置换。
在某些实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
在某些实施例中，所述5'LTR或3'LTR是慢病毒LTR。
在某些实施例中，所述3'LTR是自我失活(SIN)LTR。
在某些实施例中，编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸包含优化的Kozark序列。
在某些实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的所述启动子选自由表一以及以下组成的群组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。
表一
WTPGK启动子
SEQ ID NO:12
截短PGK启动子1
SEQ ID NO:13
截短PGK启动子2
SEQ ID NO:14
截短PGK启动子3
SEQ ID NO:15
截短PGK启动子4
SEQ ID NO:16
EF1α启动子
SEQ ID NO:17
MND启动子
SEQ ID NO:18
在某些实施例中，包含CAR的载体可以包含分泌型抗PD-1ScFv；在某些实施例中，包含CAR的载体包含PD-1共轭转导肽(如PD-1-CD28-CD137-CD3信号结构)；在某些实施例中，包含CAR的载体多个CAR组合，如2个靶向不同抗原或同一抗原的不同识别位点的CAR组合。
优选的，所述载体为PBKL1-5H1P-CAR/anti-PSCA-OPRE，包含核酸序列如SEQ IDNO.3所示的CAR结构；所述载体为PBKL1-5H1P-CAR/anti-CD19-OPRE，包含核酸序列如SEQID NO.4所示的CAR结构；所述载体为pBKL1-5H1P-CAR/anti-CEA-oPRE，包含如核酸序列如SEQ ID NO.43所示的核酸序列的CAR结构，氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。
本发明的目的之四在于提供一种包含所述的表达载体的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞能在缺氧环境和靶抗原存在下诱导活化，在缺氧环境下靶抗原刺激后CAR表达能力和丰度均提高，增强CAR-T有效性，并且有高的IFN-γ和IL-2因子分泌能力；在非缺氧环境下靶抗原刺激后CAR表达能力和丰度均低于常规CAR-T，安全性更高。
进一步，所述的CAR-T细胞可以应用于血液系统疾病和实体瘤治疗。
所述血液系统肿瘤包括但不限于：急性淋巴样白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤以及霍奇金淋巴瘤。
所述实体瘤包括但不限于：***癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌以及皮肤癌。
具体的，所述细胞可以与其他可增强CAR表达活性的活性剂和/或治疗组合使用。
具体的，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射。
在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞活性的活性剂。活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFRβ。所述抑制性分子的胞外结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示)可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1CAR(核苷酸序列如SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.39所示)。
本发明的目的之五在于提高缺氧环境下CAR-T细胞分泌IFN-γ和/或IL-2因子能力的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
具体为构建一种包含缺氧可调控的启动子的CAR结构，所述缺氧可调控的启动子由Hif1α调节元件和迷你启动子连接构成，所述Hif1α调节元件的重复数为3-5个；所述迷你启动子选自细胞病毒启动子、HSV胸苷激酶的启动子、猿猴病毒40的启动子、腺病毒晚期启动子或者合成启动子。
优选的，HRE的重复数为5个。
优选的，迷你启动子选***iCMV。
进一步，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1为重复的5个HRE调控元件与弱启动的CMV mini Promoter联用构成，结构为5HRE-CMVmini promoter；SEQ ID NO.2为对SEQ ID NO.1序列两端进行优化，便于启动子与载体的匹配。
优选的，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之六在于一种提高缺氧环境下CAR-T细胞杀伤能力的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
具体为构建一种包含缺氧可调控的启动子的CAR结构，所述缺氧可调控的启动子由Hif1a调节元件和迷你启动子连接构成，所述Hif1α调节元件的重复数为3-5个；所述迷你启动子选自细胞病毒启动子、HSV胸苷激酶的启动子、猿猴病毒40的启动子、腺病毒晚期启动子或者合成启动子。
优选的，HRE的重复数为5个。
优选的，迷你启动子选***iCMV。
进一步，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1为重复的5个HRE调控元件与弱启动的CMV mini Promoter联用构成，结构为5HRE-CMVmini promoter。
优选的，所述缺氧可调控启动子的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之七在于提供一种所述的CAR结构和/或所述的表达载体和/或所述的CAR-T细胞的应用，具体为在制备***的药物中的应用。
进一步，所述的CAR-T细胞可以应用于血液系统疾病和实体瘤治疗。
所述血液系统肿瘤包括但不限于：急性淋巴样白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤以及霍奇金淋巴瘤。
所述实体瘤包括但不限于：***癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、脑癌以及皮肤癌。
所述肿瘤高表达CD19、CD20、CD123、CD22、BCMA、ROR1、间皮素、PSCA、PSMA、c-Met、GPC-3、Her2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR中的任意一项或多项。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种缺氧可调控的启动子在CAR-T中的应用，利用缺氧微环境诱导的启动子能够在缺氧环境强化目的基因、蛋白等因子的表达，提高肿瘤的药物疗效和CAR-T治疗的有效性和安全性；
2)本发明提供的缺氧微环境诱导启动的CAR结构，不仅可以有效的表达于T淋巴细胞，而且在缺氧环境中能够加强CAR-T细胞的活化，增强CAR-T有效性，并且使CAR-T细胞有高的IFN-γ和IL-2因子分泌能力，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗；
3)本发明提供的缺氧微环境诱导启动的CAR-T细胞在非缺氧环境下靶抗原刺激后CAR表达能力和丰度均低于常规CAR-T，安全性更高；
4)本发明提供的CAR-T细胞在缺氧环境下活性增强，可以用于制备***药物中的过继细胞治疗，对CAR-T的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。
附图说明
图1为pBKL1-5H1P-CAR载体结构图。
图2为载体鉴定结果。
图3A为缺氧诱导方案验证GFP阳性率柱状图，图3B为缺氧诱导方案验证GFP表达荧光密度柱状图。
图4A为缺氧诱导药物对细胞增殖影响柱状图(Hela)，图4B为缺氧诱导药物对细胞增殖影响柱状图(PBMC)。
图5为流式检测CAR阳性率。
图6A为靶细胞Hela的PSCA表达；图6B为CAR-T对靶细胞Hela的杀伤效率。
图7A为CAR-T活化后IFN-γ因子分泌能力检测，图7B为CAR-T活化后IL-2因子分泌能力检测。
图8A为缺氧启动子改造后CAR-T在淋巴瘤荷瘤小鼠体内有效性验证，图8B为相应的肿瘤生长曲线图。
图9A为缺氧启动子改造后CAR-T抑制人结直肠癌荷瘤小鼠体内肿瘤增殖。
图9B为缺氧启动子改造后CAR-T对人结直肠癌荷瘤小鼠体内肿瘤体积大小的影响。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1质粒构建
按照表二所示条件构建质粒，用于后续实验，以迷你启动子miniCMV、慢病毒表达载体、抗原识别区CD19和PSCA为例进行质粒构建。
合成缺氧启动序列5HRE-CMVmini promoter核酸序列如SEQ ID NO:1所示，进一步构建与慢病毒载体匹配的启动子EcoRV-5HRE-CMVmini promoter-NheI(5H1P)，核酸序列如SEQ ID NO:2所示，靶向PSCA-CAR核酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；靶向CD19-CAR核酸序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；靶向CEA-CAR氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示。利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆，获得重组载体PBKL1-5H1P-PSCA(1)-OPRE、PBKL1-5H1P-CD19-OPRE、PBKL1-5H1P-GFP-OPRE；PBKL1-5H1P-GFP-OPRE是未含有CAR基因的对照载体。
缺氧启动子和质粒结构的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，图1为CAR结构和包含CAR的缺氧诱导载体图。获得的质粒通过双酶切NheI+SalI鉴定结果并测序验证正确，结果如图2所示：M:DL10000DNA分子量标准；1：质粒PBKL1-5H1P-PSCA(1)-OPRE(8325bp)；2：质粒PBKL1-5H1P-GFP-OPRE(7443bp)；3：NheI+SalI双酶切质粒PBKL1-5H1P-PSCA(1)-OPRE得6717、1608bp片段；4：NheI+SalI双酶切质粒PBKL1-5H1P-GFP-OPRE得6717、726bp片段。
表二 质粒构建条件
实施例2体外缺氧模型验证
CoCl2诱导缺氧原理：二氯化钴(CoCl2)中的二价钴离子(Co2+)可以置换PHD辅助因子二价铁离子，因为Co2+对氧的亲和力较低，使得血红素不能与氧结合而不能变构为氧化状态，因而形成缺氧状态。
1)缺氧诱导方案验证：
利用PBKL1-5HRE-GFP病毒感染活化的PBMC构建体外缺氧细胞模型，培养12-18h后换液。利用CoCl2诱导缺氧环境，培养至第4天通过绿色荧光检测验证缺氧模型是否构建完成，分别设置对照组(不加CoCl2)，实验组(加CoCl2)，CoCl2药物处理24小时后进行荧光显微镜拍照检测GFP的表达强度，并且通过流式检测GFP的阳性率和荧光表达强度。
结果如图3A和3B所示，可发现加CoCl2诱导组(即微环境缺氧组)GFP阳性率显著高于不加CoCl2组，且其荧光强度也显著高于不加CoCl2组，表明在缺氧环境下PBKL1-5HRE-GFP的缺氧启动子能够正常启动下游GFP的表达。
2)缺氧诱导药物对细胞增殖影响
当天早上分别对适量的Hela和PBMC细胞量铺板96孔板，细胞贴壁5h后，进行不加CoCl2组和终浓度0，100，500，1000μM加CoCl2处理组，处理24小时后将温育好的CellTiter-Glo One Solution Assay试剂按1:1的体积加入，室温孵育10分钟后放入酶标仪检测吸光度。结果如图4A和4B所示，CoCl2的加入并不会影响原靶细胞增殖情况，因此CAR-T细胞杀伤的结果不会受到外源加入的CoCl2影响，仅和是否包含有缺氧启动子相关。
实施例3制备慢病毒及感染T淋巴细胞
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体为：用DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态，细胞预先换液。包装质粒(RRE:REV:2G)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入2.5mol/LCaCl2，补充ddH2O至总体积为600μL，混合均匀，并用移液器向混合液中逐滴加入2×HBS，混匀后室温静置15min，加入到处理好的293T细胞培养液中，3-5h后再次换液至10mL含10％FBS的DMEM培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒，滴度测定。
利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化后，按一定的感染复数(MOI)感染已活化的PBMC，培养过夜后换液，于37℃培养箱继续培养，在病毒感染的第12天检测CAR-T的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率。
结果如图5所示：缺氧诱导5H1P-PSCA CAR-T组为CoCl2诱导的含缺氧启动子CAR-T组，缺氧诱导PSCA CAR-T组为CoCl2诱导的不含缺氧启动子CAR-T组，未诱导5H1P-PSCACAR-T组为不加CoCl2诱导的含缺氧启动子CAR-T组，BLANK为空白对照组。缺氧启动子改造的CAR结构在缺氧环境下CAR表达丰度更高，CAR分子更高密度的表达于T细胞表面。
实施例4检测CoCl2诱导后包含缺氧启动子的CAR-T有效性
分别以PSCA阳性的Hela细胞与PSCA阴性的293T细胞为靶细胞。将效应细胞(常规CAR-T细胞和含缺氧启动子CAR表达的CAR-T细胞)缺氧处理后，按照一定的效靶比铺于靶细胞中，并利用ACEA xCELLigence RTCA MP仪器检测不同CAR-T对靶细胞杀伤能力，实验步骤依据仪器说明书进行。ACEA xCELLigence RTCA MP原理为对附着于孔底的肿瘤细胞以电阻指数为数据每15分钟记录一次，通过电阻指数判断贴壁的靶细胞的增殖或者死亡情况。利用电阻指数分析结果公式为：CAR-T细胞杀伤率＝基线电阻指数-实时电阻指数。
结果如图6A和6B所示：6A图为靶细胞Hela的PSCA表达；6B图为在加入CAR-T的24h后，各组CAR-T对靶细胞Hela的杀伤效率。其中Medium为只加培养基，Medium+为诱导了缺氧环境的培养基，5H1P-PSCA为含缺氧启动子5H1P的CAR-T，5H1P-PSCA+为缺氧环境下含缺氧启动子5H1P的CAR-T，CAG-PSCA为不含缺氧启动子的CAR-T，5H1P-GFP+阴性对照。在加药诱导的缺氧环境下，专利所保护的5H1P-PSCA+的杀伤效果显著增强，且大于未引入缺氧启动子的CAG-PSCA组。
在杀伤24小时后收集细胞上清，进行CAR-T细胞受到靶细胞刺激后IFN-γ和IL-2分泌能力的检测。
实施例5 Elisa检测IFN-γ和IL-2检测
将实施例4收集的上清，利用ELISA(酶联免疫)方法检测IFN-γ和IL-2的分泌情况。IFN-γ检测采用BD IFN-γ试剂盒检测，货号555142，实验步骤依据产品说明书进行；IL-2检测采用inritrogen IL-2试剂盒检测，货号88-7025-88，实验步骤依据产品说明书进行。
结果如图7A和7B所示，5H1P-PSCA为含缺氧启动子5H1P的CAR-T，5H1P-PSCA+为缺氧环境下含缺氧启动子5H1P的CAR-T，CAG-PSCA为不含缺氧启动子的CAR-T，5H1P-GFP+为阴性对照。含缺氧启动子的CAR-T细胞在缺氧环境下受抗原刺激后IFN-γ和IL-2，尤其是IL-2的分泌能力远高于在非缺氧环境；含缺氧启动子5H1P的CAR-T在未缺氧环境下经抗原刺激后IFN-γ分泌远低于不含缺氧启动子的CAR-T CAG-PSCA。可见，在正常组织的未缺氧环境下，经抗原刺激后5H1P-PSCA的IFN-γ分泌远低于不含缺氧启动子的，拥有更高的安全性，并且在肿瘤的缺氧环境下经抗原刺激后5H1P-PSCA分泌IFN-γ能力增强说明缺氧环境下5H1P发挥了作用；在肿瘤的缺氧环境下，5H1P-PSCA分泌IL-2的能力与CAG-PSCA相当，远大于在非缺氧环境下5H1P-PSCA分泌IL-2能力，本发明的5HRE-CMVmini promoter在缺氧环境下确实能够改善CAR-T的安全性和有效性。
实施例6包含缺氧启动子的CAR-T细胞体内有效性验证
建立人淋巴瘤细胞(Raji，CD19阳性)小鼠荷瘤模型和人结直肠癌小鼠荷瘤模型，验证缺氧启动子的加入对CAR-T细胞抗肿瘤疗效的作用。
体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠，由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验最常见品系。体内验证使用的成瘤靶细胞选择Raji细胞，构建人淋巴瘤荷瘤鼠模型。选择6-8周鼠龄雌性NOD/SCID小鼠，标记耳号后，在小鼠背部以1×106/只细胞量皮下注射LoVo或Raji细胞。成瘤第6天测量小鼠肿瘤体积，根据肿瘤体积随机分为Control T组、缺氧启动子改造的CAR-T(5H1P CD19CAR-T)、未改造启动子CAR-T组(CD19CAR-T)和缺氧启动子改造的CAR-T(5H1P CEA CAR-T)、对照组两部分进行实验。人淋巴瘤荷瘤鼠组在成瘤第8天向不同分组小鼠尾静脉注射对应的CAR-T细胞3*10^6CAR-T细胞/只；Control T组于第8天回输总数相同的T淋巴细胞。人结直肠癌荷瘤鼠组在成瘤第7天向不同组小鼠尾静脉注射5H1P CEA CAR-T和CONTROL T细胞1*10^6CAR-T细胞/只；在第14天再重复回输一次5H1P CEA CAR-T和CONTROL T细胞1*10^6CAR-T细胞/只。
每周测量一次各组小鼠肿瘤体积，实验结果如图8A、8B和图9A、9B所示。图8A为Raji荷瘤小鼠进行实验，可见进行缺氧启动子改造的5H1P组(5H1P CD19 CAR-T)相较于未改造的CD19 CAR-T组小鼠体内有效性显著提高。综上，体内动物实验结果表明，采用本发明所述的5HRE-CMVmini promoter的CAR结构改造的CAR-T细胞针对荷瘤小鼠有效性显著提高。
图9A和图9B为利用人结直肠癌小鼠荷瘤模型进行的实验，图9A为回输缺氧启动子改造的5H1P组和未改造组CAR-T后肿瘤增殖曲线，图9B为不同改造组治疗后小鼠肿瘤体积统计结果；结果可见，进行缺氧启动子改造的5H1P组(5H1P CEA CAR-T)与Control对比有显著的疗效。
结果表明，采用本发明所述的5HRE-CMVmini promoter的CAR结构改造的CAR-T细胞针对荷瘤小鼠有效性显著提高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆精准生物技术有限公司
<120> 一种缺氧可调控的启动子在CAR-T中的应用
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttgtcga gccacagtgc atacgtgggc 60
tccaacaggt cctcttgtcg agccacagtg catacgtggg ctccaacagg tcctcttgtc 120
gagccacagt gcatacgtgg gctccaacag gtcctcttgt cgagccacag tgcatacgtg 180
ggctccaaca ggtcctcttg tcgagatctg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 240
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatca ctag 274
<210> 2
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gtcgacgata tcccacagtg catacgtggg ctccaacagg tcctcttgtc gagccacagt 60
gcatacgtgg gctccaacag gtcctcttgt cgagccacag tgcatacgtg ggctccaaca 120
ggtcctcttg tcgagccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt gtcgagccac 180
agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tgtcgagatc tggtaggcgt gtacggtggg 240
aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cactaggcta gc 292
<210> 3
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atggccctgc cagtgaccgc cctgctgctg cccctggccc tgctgctgca cgcagcacgg 60
cccgacatcc aggatattca gctgacccag agcccgagca gcctgagcgc gagcgtgggc 120
gatcgcgtga ccattacctg cagcgcgagc agcagcgtgc gctttattca ttggtatcag 180
cagaaaccgg gcaaagcgcc gaaacgcctg atttatgata ccagcaaact ggcgagcggc 240
gtgccgagcc gctttagcgg cagcggcagc ggcaccgatt ttaccctgac cattagcagc 300
ctgcagccgg aagattttgc gacctattat tgccagcagt ggagcagcag cccgtttacc 360
tttggccagg gcaccaaagt ggaaattaaa ggcagcacca gcggcagcgg caaaccgggc 420
agcggcgaag gcagcaccaa aggcagcgaa gtgcagctgg tggaaagcgg cggcggcctg 480
gtgcagccgg gcggcagcct gcgcctgagc tgcgcggcga gcggctttaa cattaaagat 540
tattatattc attgggtgcg ccaggcgccg ggcaaaggcc tggaatgggt ggcgtggatt 600
gatccggaaa acggcgatac cgaatttgtg ccgaaatttc agggccgcgc gaccattagc 660
gcggatacca gcaaaaacac cgcgtatctg cagatgaaca gcctgcgcgc ggaagatacc 720
gcggtgtatt attgcaaaac cggcggcttt tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 780
tctctcgaga ccaccacccc ggcgccgcgc ccgccgaccc cggcgccgac cattgcgagc 840
cagccgctga gcctgcgccc ggaagcgtgc cgcccggcgg cgggcggcgc ggtgcatacc 900
cgcggcctgg attttgcgtg cgatgaattc ttttgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg 960
ctggcgtgct atagcctgct ggtgaccgtg gcgtttatta ttttttgggt gcgcagcaaa 1020
cgcagccgcg gcggccatag cgattatatg aacatgaccc cgcgccgccc gggcccgacc 1080
cgcaaacatt atcagccgta tgcgccgccg cgcgattttg cggcgtatcg cagcgtgaaa 1140
cgcggccgca aaaaactgct gtatattttt aaacagccgt ttatgcgccc ggtgcagacc 1200
acccaggaag aagatggctg cagctgccgc tttccggaag aagaagaagg cggctgcgaa 1260
ctgcgcgtga aatttagccg cagcgcggat gcgccggcgt atcagcaggg ccagaaccag 1320
ctgtataacg aactgaacct gggccgccgc gaagaatatg atgtgctgga taaacgccgc 1380
ggccgcgatc cggaaatggg cggcaaaccg cgccgcaaaa acccgcagga aggcctgtat 1440
aacgaactgc agaaagataa aatggcggaa gcgtatagcg aaattggcat gaaaggcgaa 1500
cgccgccgcg gcaaaggcca tgatggcctg tatcagggcc tgagcaccgc gaccaaagat 1560
acctatgatg cgctgcatat gcaggcgctg ccgccgcgc 1599
<210> 4
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atggcgctgc cggtgaccgc gctgctgctg ccgctggcgc tgctgctgca tgcggcgcgc 60
ccggatattc agatgaccca gagcccgagc agcctgagcg cgagcgtggg cgatcgcgtg 120
accattacct gccgcgcgag ccaggatatt agcaaatatc tgaactggta tcagcagaaa 180
ccgggcaaag cgccgcgcct gctgatttat cataccagcc gcctgcatag cggcgtgccg 240
agccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattataccc tgaccattag cagcctgcag 300
ccggaagatt ttgcgaccta ttattgccag cagggcaaca ccctgccgta tacctttggc 360
ggcggcaccc gcctggaaat taaaggcagc accagcggca gcggcaaacc gggcagcggc 420
gaaggcagca ccaaaggcca ggtgcagctg caggaaagcg gcccgggcct ggtgaaaccg 480
agccagaccc tgagcctgac ctgcaccgtg agcggcgtga gcctgccgga ttatggcgtg 540
agctggattc gccagccgcc gggcaaagcg ctggaatggc tgggcgtgat ttggggcagc 600
gaaaccacct attataacag cagcctgaaa acccgcctga ccattagcaa agataacagc 660
aaaaaccagg tggtgctgac catgaccaac atggatccgg tggataccgc gacctattat 720
tgcgcgaaac attattatta tggcggcagc tatgcgatgg attattgggg ccagggcagc 780
agcgtgaccg tgagcagcct ggaaaccacc accccggcgc cgcgcccgcc gaccccggcg 840
ccgaccattg cgagccagcc gctgagcctg cgcccggaag cgtgccgccc ggcggcgggc 900
ggcgcggtgc atacccgcgg cctggatttt gcgtgcgata tttatatttg ggcgccgctg 960
gcgggcacct gcggcgtgct gctgctgagc ctggtgatta ccctgtattg caaacgcggc 1020
cgcaaaaaac tgctgtatat ttttaaacag ccgtttatgc gcccggtgca gaccacccag 1080
gaagaagatg gctgcagctg ccgctttccg gaagaagaag aaggcggctg cgaactgcgc 1140
gtgaaattta gccgcagcgc ggatgcgccg gcgtataaac agggccagaa ccagctgtat 1200
aacgaactga acctgggccg ccgcgaagaa tatgatgtgc tggataaacg ccgcggccgc 1260
gatccggaaa tgggcggcaa accgcgccgc aaaaacccgc aggaaggcct gtataacgaa 1320
ctgcagaaag ataaaatggc ggaagcgtat agcgaaattg gcatgaaagg cgaacgccgc 1380
cgcggcaaag gccatgatgg cctgtatcag ggcctgagca ccgcgaccaa agatacctat 1440
gatgcgctgc atatgcaggc gctgccgccg cgc 1473
<210> 5
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile
165 170 175
Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg
180 185 190
Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly
210 215 220
Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr
225 230 235 240
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
245 250 255
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
260 265 270
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu
275 280 285
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
290 295 300
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
305 310 315 320
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
325 330 335
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
340 345 350
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
355 360 365
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
370 375 380
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
385 390 395 400
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
420 425 430
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
435 440 445
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
450 455 460
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
465 470 475 480
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
485 490 495
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 6
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Thr Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr
195 200 205
Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
260 265 270
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
290 295 300
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
305 310 315 320
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
325 330 335
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
340 345 350
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttgtcga gccacagtgc atacgtgggc 60
tccaacaggt cctcttgtcg agccacagtg catacgtggg ctccaacagg tcctcttgtc 120
gagccacagt gcatacgtgg gctccaacag gtcctcttgt cgagccacag tgcatacgtg 180
ggctccaaca ggtcctcttg tcgagatctg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 240
gcagagctcg magtgaaccg tcagatcact ag 272
<210> 12
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60
aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399
<210> 13
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg 118
<210> 14
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g 221
<210> 15
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
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cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300
ttccttggaa gggctgaatc cccg 324
<210> 16
<211> 422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60
ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120
gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180
gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240
cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300
ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360
cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420
cg 422
<210> 17
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg 360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg 420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg 480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt 540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg 600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc 660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg 720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg 780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat 840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct 900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc 960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg 1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga 1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc 1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga 1184
<210> 18
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt ttggcaagct 60
aggatcaagg ttaggaacag agagacagca gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 120
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 180
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 240
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 300
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 360
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagccca 399
<210> 19
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 20
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 21
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 22
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 24
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 25
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala
20 25 30
Ser Ala Leu Pro
35
<210> 26
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Arg Pro Ala Ala
20 25 30
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Asp
35 40 45
<210> 27
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 28
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 29
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 32
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
130 135 140
Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
145 150 155 160
Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser Cys
210 215 220
Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 33
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Arg
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 34
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln
115 120 125
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Gln
165 170 175
Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr
180 185 190
Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser
195 200 205
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr
210 215 220
Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 35
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln
210 215 220
Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235 240
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<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile
165 170 175
Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg
180 185 190
Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly
210 215 220
Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
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<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145 150
<210> 38
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
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ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag 600
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cgcaagcatt accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctcctaa 717
<210> 39
<211> 833
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccactgtcc aagtccccta 480
tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 540
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 600
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 660
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccgttaa acggggcaga 720
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 780
gaagatggct tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctg 833
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ser Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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