阅读说明：本技术 一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂及其制备方法与应用 (Reagent for inhibiting expression of antibiotic resistance gene of bacteria under metal induction, preparation method and application thereof ) 是由 吴平霄 李义豪 王慧敏 牛文超 王锐 朱能武 党志 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂及其制备方法与应用。该方法包括：将蒙脱石加入水中,离心取沉淀,将沉淀重新加入水中,重复离心直到上清液澄清,烘干,过筛,加入溶剂中,混匀,得到所述抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂。该试剂通过利用Mt调节Cd<Sup>2+</Sup>诱导下细菌抗生素抗性基因的表达模式和代谢,抵抗低剂量的抗生素应激,从而抑制<I>E. coli</I>抗生素抗性基因的表达。最小抑菌浓度和荧光定量PCR的结果也表明Mt能减弱Cd<Sup>2+</Sup>诱导下细菌抗生素抗性的表达。因此,Mt可作为环境材料缓解重金属胁迫下细菌抗生素抗性基因的表达,对控制因此造成的ARGs污染具有重要意义。(The invention discloses a reagent for inhibiting the expression of antibiotic resistance genes of bacteria under the induction of metal, a preparation method and application thereof. The method comprises the following steps: adding montmorillonite into water, centrifuging to obtain precipitate, and collecting the precipitateAnd adding the precipitate into water again, repeatedly centrifuging until the supernatant is clear, drying, sieving, adding the supernatant into a solvent, and uniformly mixing to obtain the reagent for inhibiting the expression of the antibiotic resistance gene of the bacteria under the induction of metal. The reagent regulates Cd by utilizing Mt 2+ Inducing the expression pattern and metabolism of bacterial antibiotic resistance genes against low-dose antibiotic stress, thereby inhibiting E. coli Expression of antibiotic resistance genes. The results of minimum inhibitory concentration and fluorescent quantitative PCR also show that Mt can weaken Cd 2+ The expression of bacterial antibiotic resistance is induced. Therefore, Mt can be used as an environmental material to relieve the expression of bacterial antibiotic resistance genes under heavy metal stress, and has important significance for controlling ARGs pollution caused by the expression.)

一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂及其 制备方法与应用

技术领域

本发明属于矿物学和环境微生物学领域，具体涉及一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂及其制备方法与应用。

背景技术

抗生素耐药性是对公共卫生最严重的威胁之一。抗生素的过度使用会诱导细菌抗生素抗性基因(ARGs)的产生，从而成为抗生素耐药性扩散的关键原因。ARGs作为一种新型的环境污染物，对环境介质，特别是土壤环境有很大的危害。

大量研究表明，ARGs不仅由抗生素诱导产生，还由非抗生素物质重金属、有机物等诱导产生。重金属与抗生素耐药性之间存在密切联系，其能通过共选择机制增强抗生素抗性。在重金属污染区域，重金属不但会诱导细菌产生重金属抗性，还会诱导其产生多种抗生素抗性，并且ARGs存在水平与重金属污染水平成正相关。更值得关注的是，在环境介质中重金属的含量远远高于抗生素的含量，并且与抗生素相比，重金属不被降解，这将给环境带来更长期的压力。因此，探究减轻重金属诱导下ARGs的扩散对降低其环境健康风险具有重要意义。

粘土矿物是地球表生环境中最常见的物质，与土壤中的微生物、重金属存在复杂的界面反应。一方面，微生物活动可以促进矿物的溶解、沉淀和转化，从而加速生物地球化学循环，影响地形地貌和地球生态系统的演化。另一方面，粘土矿物可以调节微生物生长代谢，对微生物在外界压力下的分布、活性、多样性、基因表达和转化也有很大的影响。然而，很少有学者深入地从分子生物学角度探索重金属胁迫下粘土矿物如何调节微生物的抗生素抗性基因产生过程。Mt具备优异的生物相容性，可使细菌在重金属胁迫下具有调节基因表达模式和生长代谢活动的潜力，从而增强重金属抗性来减缓重金属污染环境压力及减缓重金属诱导下抗生素抗性基因产生带来的环境压力及生态风险。因此，探究Mt对金属胁迫下细菌的抗生素抗性表达机制，可以进一步为推进重金属污染治理及缓解ARGs表达提供新思路和新技术。

发明内容

为了克服抗生素抗性基因的污染问题，本发明提供了一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂及其制备方法与应用。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂，包含蒙脱石。

进一步地，所述蒙脱石(Mt)使用前需经过高温灭菌，温度为100-120℃。

进一步地，所述Mt的浓度为10-20gL^-1。

进一步地，该试剂的pH为6.0-8.0。

进一步地，所述金属诱导为Cd²⁺离子诱导环境。

进一步地，所述Cd²⁺离子的浓度为16-128μg·mL^-1。

本发明提供的一种制备抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂的方法，包括如下步骤：

(1)将蒙脱石加入水中，然后离心处理，去除上清液，取沉淀，然后将沉淀重新加入水中，重复离心处理的步骤直到上清液澄清，烘干，过筛，高温灭菌处理，得到预处理后的蒙脱石；

(2)将步骤(1)所述预处理后的蒙脱石加入溶剂中，混合均匀，得到所述抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂。

进一步地，步骤(1)所述离心处理的转速为8000-10000rpm；步骤(1)所述烘干的温度为55-65℃。

进一步地，步骤(1)所述过筛的筛孔大小为200目。

进一步地，步骤(1)所述高温灭菌处理的温度为100-120℃，高温灭菌处理的时间为30-60min。

进一步地，步骤(2)所述溶剂为去离子水。

本发明提供的抑制细菌抗生素抗性基因表达的试剂在制备抗菌药剂中的应用。

本发明通过利用Mt对微生物的生长繁殖和新陈代谢影响，调节细菌的基因表达模式，抵抗低剂量下金属诱导的抗生素应激，进而降低抗ARGs表达的可能性，并对控制因此造成的ARGs污染具有重要意义。

本发明提供的抑制细菌抗生素抗性基因表达的试剂可以通过以下实验进行效果验证。该验证实验包括如下步骤。

1)Mt前处理：

用去离子水洗涤Mt原土，并在8000rpm转速下离心分离，以除去其表面的可溶性杂质，多次处理直至去离子水澄清后，沉淀物质即为纯净的Mt固体。然后将其放入60℃烘箱中鼓风干燥，过200目筛，经过高温灭菌处理后(100-120℃)用于后续分析。

2)细菌的培养：

所述细菌为野生型大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922(E.coli)，在MHB培养基中，37℃，pH 7.0条件下，并以200rpm摇动培养。

3)有无Mt存在下重金属对细菌的梯度浓度诱导

所述重金属为镉(Cd²⁺)，从细菌的亚抑菌浓度出发，利用Cd²⁺梯度浓度诱导抗生素敏感菌E.coli产生抗生素抗性。将被活化的菌株(E.coli)以1:100的比例分别添加至有Mt和无Mt存在的30mL Cd浓度为16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1和128μg·mL^-1的新鲜NB培养基中培养三代，每代培养24h，培养条件为37℃，pH 7.0，200rpm。然后在相同条件下，转移至培养基中传代3次，每次培养24h。

4)细菌对重金属和抗生素最低抑菌浓度(MIC)的分析

实验采用微量肉汤稀释法测定重金属的MIC。将被测细菌用LB培养基稀释并分散至Cd²⁺浓度为16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、48μg·mL^-1、64μg·mL^-1、80μg·mL^-1、98μg·mL^-1、112μg·mL^-1、128μg·mL^-1的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。

此外，抗生素的MIC也采取微量肉汤稀释法测定。将被测细菌(Cd或Cd-Mt诱导处理以后)用MHB培养基稀释并分散至含有0.5μg·mL^-1、1μg·mL^-1、2μg·mL^-1、4μg·mL^-1、8μg·mL^-1、16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1、128μg·mL^-1各类抗生素浓度的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。

5)对比有Mt和无Mt存在的情况下，Cd诱导细菌的MIC的变化。

利用实时荧光定量PCR，获取有Mt和无Mt存在的情况Cd诱导细菌ARGs的变化。青霉素(如mrdA、mrcA、dacB/D)、四环素(如accC)、红霉素(如suhB)和氯霉素(如tktA，)等抗生素相关基因的表达水平。以及细菌在Cd胁迫下多药耐药抗性/多重抗生素抗性/抗生素应答相关的基因(如mdtQ、marB/R、arnA/B/C/D)和大量毒物外排相关基因(如emrA、mprA、ydhC、marA)的表达情况。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的试剂通过利用Mt调节重金属诱导下细菌的ARGs表达模式和代谢，抵抗低剂量的抗生素应激，从而抑制基因突变的表达，进而降低抗生素抗性基因的表达；本发明提供的制备方法具有步骤简单、无需特殊专用设备、原材料容易获得、投资少等优点。

附图说明

图1为一种抑制细菌金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂制备流程图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

一种制备抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂的方法，包括如下步骤：

(1)将蒙脱石加入水中，然后离心处理，离心处理的转速为8000rpm，去除上清液，取沉淀，然后将沉淀重新加入水中，重复离心处理的步骤直到上清液澄清，烘干，烘干的温度为55℃，过筛，筛孔大小为200目，在100℃高温灭菌处理(灭菌时间为60min)后，得到预处理后的蒙脱石；

(2)将步骤(1)所述预处理后的蒙脱石加入溶剂去离子水中，混合均匀，得到所述抑制细菌抗生素抗性基因表达的试剂。实施例1得到的抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂中，蒙脱石的浓度为8g L^-1，该试剂的pH值为6.0。

实施例2

一种制备抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂的方法，包括如下步骤：

(1)将蒙脱石加入水中，然后离心处理，离心处理的转速为9000rpm，去除上清液，取沉淀，然后将沉淀重新加入水中，重复离心处理的步骤直到上清液澄清，烘干，烘干的温度为60℃，过筛，筛孔大小为200目，在110℃高温灭菌处理(灭菌时间为50min)后，得到预处理后的蒙脱石；

(2)将步骤(1)所述预处理后的蒙脱石加入溶剂去离子水中，混合均匀，得到所述抑制细菌抗生素抗性基因表达的试剂。实施例1得到的抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂中，蒙脱石的浓度为12g L^-1，该试剂的pH值为7.0。

实施例3

一种制备抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂的方法，包括如下步骤：

(1)将蒙脱石加入水中，然后离心处理，离心处理的转速为10000rpm，去除上清液，取沉淀，然后将沉淀重新加入水中，重复离心处理的步骤直到上清液澄清，烘干，烘干的温度为65℃，过筛，筛孔大小为200目，在120℃高温灭菌处理(灭菌时间为30min)后，得到预处理后的蒙脱石；

(2)将步骤(1)所述预处理后的蒙脱石加入溶剂去离子水中，混合均匀，得到所述抑制细菌抗生素抗性基因表达的试剂。实施例1得到的抑制细菌在金属诱导下抗生素抗性基因表达的试剂中，蒙脱石的浓度为16g L^-1，该试剂的pH值为8.0。

实施例4

验证Mt存在下Cd诱导E.coli对氨苄青霉素ARGs表达的影响(流程可参照图1所示)。

使用细菌浊度仪将活化12小时后的菌株调整至2.5MCF(1MCF＝3x10⁸CFU·mL^-1)，以确保后续实验所使用的细菌数量相等。将被活化的菌株以1:100的比例分别添加至有Mt(8gL^-1)和无Mt存在的30mL Cd²⁺浓度为16μg·mL^-1(亚抑菌浓度)的新鲜LB培养基中培养三代，每代培养24h，培养条件为37℃，pH 6.0，200rpm转速。然后在相同条件下转移至Cd²⁺浓度为32μg·mL^-1培养基中传代3次，每次培养24h，依此类推，依次转移至64μg·mL^-1、96μg·mL^-1、128μg·mL^-1培养基中各传代3次，每次培养24h，整个过程共15d。

将被测细菌用MHB培养基稀释并分散至含有0.5μg·mL^-1、1μg·mL^-1、2μg·mL^-1、4μg·mL^-1、8μg·mL^-1、16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1、128μg·mL^-1、氨苄青霉素浓度的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。有无Mt存在下细菌对氨苄青霉素MIC值的影响见表1。由表1可知，Cd处理下氨苄青霉素对大肠杆菌的MIC为4μg·mL^-1，Mt-Cd处理下氨苄青霉素对大肠杆菌的MIC为2μg·mL^-1，可以得出Mt的存在明显降低了细菌对氨苄青霉素的抗性。

采用实时荧光定量PCR技术进一步验证RNA-Seq测序结果。有无Mt(蒙脱石)存在下大肠杆菌对氨苄青霉素抗性基因表达的差异见表2。从表2可以看出Cd处理下氨苄青霉素抗性基因mrdA表达的差异倍数为1.67，而Mt-Cd处理下的差异倍数为1.17；Cd处理下氨苄青霉素的抗性基因mrcA、dacB和dacD表达的差异倍数为1.28、1.03和1.11，而Mt-Cd处理下的差异倍数并不明显。因此可知，Mt的存在明显抑制了氨苄青霉素抗性基因的表达。

实施例5

验证Mt存在下Cd诱导E.coli对四环素ARGs表达的影响。

使用细菌浊度仪将过夜活化12小时后的菌株调整至2.5MCF(1MCF＝3x10⁸ CFU·mL^-1)，以确保后续实验所使用的细菌数量相等。将被活化的菌株以1:100的比例分别添加至有Mt(12gL^-1)和无Mt存在的30mL Cd²⁺浓度为16μg·mL^-1(亚抑菌浓度)的新鲜LB培养基中培养三代，每代培养24h，培养条件为37℃，pH 7.0，200rpm转速。然后在相同条件下转移至Cd²⁺浓度为32μg·mL^-1培养基中传代3次，每次培养24h，依此类推，依次转移至64μg·mL^-1、96μg·mL^-1、128μg·mL^-1培养基中各传代3次，每次培养24h，整个过程共15d。

将被测细菌用MHB培养基稀释并分散至含有0.5μg·mL^-1、1μg·mL^-1、2μg·mL^-1、4μg·mL^-1、8μg·mL^-1、16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1、128μg·mL^-1、四环素浓度的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。有无Mt存在下细菌对四环素MIC值的影响见表1。由表1可知，Cd处理下四环素对大肠杆菌的MIC为8μg·mL^-1，Mt-Cd处理下四环素对大肠杆菌的MIC为4μg·mL^-1，可以得出Mt的存在明显降低了细菌对四环素的抗性。

采用实时荧光定量PCR技术进一步验证RNA-Seq测序结果。有无Mt存在下大肠杆菌对四环素抗性基因表达的差异见表2。从表2可以看出Cd处理下四环素抗性基因accC表达的差异倍数为1.49，而Mt-Cd处理下的差异倍数为1.33。因此可知，Mt的存在明显抑制了四环素抗性基因的表达。

实施例6

验证Mt存在下Cd诱导E.coli对红霉素ARGs表达的影响。

使用细菌浊度仪将活化12小时后的菌株调整至2.5MCF(1MCF＝3x10⁸CFU·mL^-1)，以确保后续实验所使用的细菌数量相等。将被活化的菌株以1:100的比例分别添加至有Mt(16gL^-1)和无Mt存在的30mL Cd²⁺浓度为16μg·mL^-1(亚抑菌浓度)的新鲜LB培养基中培养三代，每代培养24h，培养条件为37℃，pH 7.0，200rpm转速。然后在相同条件下转移至Cd²⁺浓度为32μg·mL^-1培养基中传代3次，每次培养24h，依此类推，依次转移至64μg·mL^-1、96μg·mL^-1、128μg·mL^-1培养基中各传代3次，每次培养24h，整个过程共15d。

将被测细菌用MHB培养基稀释并分散至含有0.5μg·mL^-1、1μg·mL^-1、2μg·mL^-1、4μg·mL^-1、8μg·mL^-1、16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1、128μg·mL^-1红霉素浓度的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。有无Mt存在下细菌对红霉素MIC值的影响见表1。由表1可知，Cd处理下红霉素对大肠杆菌的MIC为4μg·mL^-1，Mt-Cd处理下四环素对大肠杆菌的MIC为2μg·mL^-1，可以得出Mt的存在明显降低了细菌对红霉素的抗性。

采用实时荧光定量PCR技术进一步验证RNA-Seq测序结果。有无Mt存在下大肠杆菌对红霉素抗性基因表达的差异见表2。从表2可以看出Cd处理下红霉素抗性基因suhB表达的差异倍数为2.86，而Mt-Cd处理下的差异倍数无明显变化。因此可知，Mt的存在明显抑制了红霉素抗性基因的表达。

实施例7

Mt存在下Cd诱导E.coli对氯霉素ARGs表达的影响。

使用细菌浊度仪将活化12小时后的菌株调整至2.5MCF(1MCF＝3x10⁸CFU·mL^-1)，以确保后续实验所使用的细菌数量相等。将被活化的菌株以1:100的比例分别添加至有Mt(16gL^-1)和无Mt存在的30mL Cd²⁺浓度为16μg·mL^-1(亚抑菌浓度)的新鲜LB培养基中培养三代，每代培养24h，培养条件为37℃，pH 8.0，200rpm转速。然后在相同条件下转移至Cd²⁺浓度为32μg·mL^-1培养基中传代3次，每次培养24h，依此类推，依次转移至64μg·mL^-1、96μg·mL^-1、128μg·mL^-1培养基中各传代3次，每次培养24h，整个过程共15d。

将被测细菌用MHB培养基稀释并分散至含有0.5μg·mL^-1、1μg·mL^-1、2μg·mL^-1、4μg·mL^-1、8μg·mL^-1、16μg·mL^-1、32μg·mL^-1、64μg·mL^-1、128μg·mL^-1、氯霉素浓度的96孔板，并且保证每个孔的细菌数量为10⁴CFU。随后，将96孔板放置恒温培养箱(37℃)孵育24h后查看结果。MIC值的判定为第一列开始出现没有细菌生长时的浓度。有无Mt存在下细菌对氯霉素MIC值的影响见表1。由表1可知，Cd处理下氯霉素对大肠杆菌的MIC为4μg·mL^-1，Mt-Cd处理下氯霉素对大肠杆菌的MIC为2μg·mL^-1，可以得出Mt的存在明显降低了细菌对氯霉素的抗性。

采用实时荧光定量PCR技术进一步验证RNA-Seq测序结果。有无Mt存在下大肠杆菌对氯霉素抗性基因表达的差异见表2。从表2可以看出Cd处理下氯霉素抗性基因tktA表达的差异倍数为1.64，而Mt-Cd处理下的差异倍数无明显变化。因此可知，Mt的存在明显抑制了氯霉素抗性基因的表达。

同时，大肠杆菌多药耐药抗性/多重抗生素抗性/抗生素应答相关的基因(如mdtQ、marB/R、arnA/B/C/D等)和大量毒物外排相关基因(如emrA、mprA、ydhC、marA等)的表达差异见表2。从表2可知，Mt-Cd处理组基因的表达差异倍数均低于Cd处理组。由此可以Mt的存在也抑制大肠杆菌多药耐药抗性/多重抗生素抗性/抗生素应答相关的基因和大量毒物外排相关基因的表达。

表1不同处理组诱导前后MIC对比

表1的Cd处理表示仅用Cd²⁺诱导处理；Mt-Cd处理表示在Cd²⁺诱导下加入了蒙脱石进行处理；空白处理表示仅大肠杆菌，不使用Cd²⁺诱导处理也不添加Mt。

表2有无Mt存在下在Cd诱导细菌抗生素抗性相关的部分差异表达基因(DEGs)

^aCd处理(处理1)和Mt-Cd处理(处理2)样品与对照样品E.coli基于log2基因丰度比值的倍数变化。^b用“-”表示处理后的样品与对照之间没有显著差异。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。