阅读说明：本技术 识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具 (NP protein for identifying 2019-nCOV antibody and detection tool ) 是由 徐兴顺 王彬 苗志刚 万波 孙淼 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物检测领域,特别涉及识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具。本发明提供的胶体金检测试剂盒,包括能够识别2019-nCOV抗体的NP蛋白,具有特异性好、灵敏度高、准确度高、方便快捷、易于操作、经济实惠的特点。(The invention relates to the field of biological detection, in particular to NP protein for identifying a 2019-nCOV antibody and a detection tool. The colloidal gold detection kit provided by the invention comprises NP protein capable of identifying the 2019-nCOV antibody, and has the characteristics of good specificity, high sensitivity, high accuracy, convenience, rapidness, easiness in operation, economy and practicability.)

识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具。

背景技术

2019新型冠状病毒,又称之为COVID-19，是2019年在人体中发现的新型冠状病毒，目前已经在全球范围内爆发。该病毒存在人传人的特点，感染该病毒的患者主要表现为全身酸痛、四肢无力、发烧、干咳、呕恶感、腹泻；症状比较重一些则表现为胸闷、气紧、呼吸困难；有少数病毒携带者没有表现出任何症状。因此，将出现症状的疑似病例以及接触确诊病例的人群进行检测十分必要。

现有检测方法或试剂盒存在耗时长，所需费用昂贵，不方便，操作较繁琐等问题，因此，提供检测新冠病毒抗体的胶体金试剂盒的方法，为进一步治疗进行人群筛查，从而有效遏制新冠病毒传播具有重要的现实意义。

免疫层析(Immunochromatography,IC)是一种起源于20世纪80年代初的检测方法。免疫胶体金层析技术以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标志物，待检溶液通过毛细作用在纤维膜上涌动(层析)，通过抗原抗体特异性结合，标记物不断被(或不被)固定浓缩在检测线上并呈现颜色(红色)反应，最后通过检测线的信号来判断待检物的有或无。对比ELISA检测方法，该方法不仅简便、快速、经济，而且不需要复杂仪器，结果直接判断等特点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具。该检测工具包括能够识别2019-nCOV抗体的NP蛋白，具有特异性好、灵敏度高、准确度高、方便快捷、易于操作、经济实惠的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了识别2019-nCOV抗体的NP蛋白，其具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在上述研究的基础上，本发明提供了编码所述NP蛋白的核苷酸，具有

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸。

此外，本发明还提供了转化有所述表达载体的宿主。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的NP蛋白、所述的载体或所述的宿主在制备2019-nCOV的检测试剂或检测工具中的应用。

本发明还提供了2019-nCOV的检测试剂，包括所述的NP蛋白、所述的载体或所述的宿主。

更重要的是，2019-nCOV的检测工具，其为胶体金检测试剂盒，包括所述的NP蛋白、所述的载体或所述的宿主。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的NP蛋白的标计量为18μg/ml，标记pH值为8.0。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测工具包括PVC底板，滤纸、样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜、吸水纸依次固定于所述PVC底板；所述检测工具以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标志物，还包括封闭液和重悬液。

此外，本发明还提供了所述的检测工具的制备方法，包括如步骤：

步骤1：制备获得胶体金溶液；

步骤2：调节pH值至8.0，与如权利要求1所述的NP蛋白、封闭液(优选PEG20000)混合，离心，经重悬液重悬，点样于结合垫，干燥。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重悬液包括：0.5％(w/w)～3％(w/w)蔗糖和0.5％(w/w)～3％(w/w)BSA。

在本发明的一些具体实施方案中，所述离心的时间为20～60min。

本发明提供的胶体金检测试剂盒，包括能够识别2019-nCOV抗体的NP蛋白，具有特异性好、灵敏度高、准确度高、方便快捷、易于操作、经济实惠的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例1构建的质粒谱图；其中，图1(A)示pET-41a(+)-GST-6His-N质粒谱图；图1(B)示PGEX-4T-2-GST-N-6His质粒谱图；

图2示识别2019-nCOV抗体的NP蛋白；其中，泳道1示GST-2019-nCOV-N-6His；泳道2示GST-6His-2019-nCOV-N；

图3示胶体金溶液；

图4示标记PH值的结果；

图5示NP蛋白最佳标记量结果；

图6示胶体金检测效果，阴性(左)；阳性(右)。

具体实施方式

本发明公开了识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的识别2019-nCOV NP蛋白的抗体及检测工具中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本申请构建表达的2019-nCOV抗体NP(Nucleocapsid phosphoprotein)蛋白序列，如SEQ ID No.1所示：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA

本申请构建表达的2019-nCOV抗体NP(Nucleocapsid phosphoprotein)核苷酸序列，如SEQ ID No.2所示：

ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA

质粒构建及表达情况：

通过体外基因合成，通过同源重组法进行质粒构建，获得pET-41a(+)-GST-6His-N及PGEX-4T-2-GST-N-6His两种质粒(图1)，通过转化BL21(DE3)，1mM IPTG 30℃诱导蛋白表达表达4小时，经GST-琼脂糖珠纯化，最终成功表达并获得了能够识别2019-nCOV抗体的NP蛋白(图2)。

实施例2胶体金制备

胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。将100mL 0.01％HAuCl4溶液加热煮沸，然后立即加入1ml 1％柠檬酸三钠溶液搅拌，溶液的颜色由浅黄→灰色→蓝色→深蓝→红色，当溶液的颜色完全变为透明的红色时(图3)，继续回8-10min后停止加热，冷却至室温，定容至100ml，4℃保存。

实施例3标记PH的确定

取8个1.5m L离心管，分别加入1mL胶体金溶液，用0.2mol/LK₂CO₃溶液将pH值分别调为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。上述不同pH值的胶体金各取100μl，每孔加入5μl2mg/m L表达的2019-nCOV NP蛋白，混匀，室温静置5min左右，每孔加入20μl 100g/L NaCl溶液，混匀，室温条件放置10min观察胶体金颜色变化，通过观察可以发现,PH在7.5-8.5，胶体金保持红色(图4)，本实验选用8.0为标记PH。

实施例4蛋白最佳标记量的的确定

在孔板中，每个孔加入100μl pH8.0胶体金，将待标记的2019-nCOV NP蛋白稀释后，摇匀室温放置5min后，分别加入10μl 100g/L NaCl，依次按表1进行。混匀静置1-2h观察结果。保持红色的离心管中，所含最低蛋白量为6号管的15μg/ml(图5)，120％即为实际用量，即18μg/ml。

表1.蛋白最佳标记量的确定

管号	1	2	3	4	5	6	7	8
									胶体金用量μl	100	100	100	100	100	100	100	100
NP蛋白/胶体金质量浓度(μg/ml)	0	3	6	9	12	15	18	21
									100g/LNaCl用量	10	10	10	10	10	10	10	10

实施例5胶体金检测效果

取10ml胶体金溶液，用0.2mol/L K₂CO₃溶液调节pH至8.0，加入1ml18μg/ml 2019-nCOV NP蛋白，搅拌30min，随后分两次加入100μl 10g/L PEG20000，每次混匀10min。4℃、8000r/min离心30min左右，沉淀用重悬液(1％蔗糖+1％BSA)重悬。将重悬液按适当的1:50-1：200比例稀释后，点样于结合垫上(8μl/cm)，干燥1-2h，将1mg/mlNP蛋白抗体(够买于义翘神州生物技术有限公司)和山羊抗人的IgG二抗分别点样于硝酸纤维素上(1μl/cm)的C线和T线，37℃干燥3-4h。将滤纸、样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜、吸水纸固定于PVC底板上。

实验检测结果：T线标记1.0mg/ml山羊抗人IgG抗体，C线标记识别NP蛋白的单克隆抗体。T线红色表示胶体金标记抗原-待检测IgG抗体-包被山羊抗人IgG抗体的免疫复合物，C线红色表示胶体金标记抗原-NP蛋白的单克隆抗体，如果只出现C线则为阴性，若C线和T线均出现则为阳性，如图6所示。

实施例6

本试剂盒已经通过30例样本检测，检测中无假阳性，准确性较高，灵敏度较强，可在2分钟内出结果。

表2.检测样本信息

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 识别2019-nCOV抗体的NP蛋白及检测工具

<130> MP2008231

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260