一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法
阅读说明：本技术 一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法 (Method for obtaining whole transgenic woody plant by utilizing agrobacterium rhizogenes transformation ) 是由 张世忠 刘琳 郑成超 马晓君 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。本发明所述的方法是先将携带目的基因的普通或特定载体转入发根农杆菌中,再用活化的发根农杆菌菌液侵染预培养的木本植物组培苗,培养至植株长出转基因毛状根后,转至添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中诱导根生芽,再经过扩繁生根从而获得整株转基因木本植株。通过本发明的方法得到转基因植株的转化效率高,不仅充分利用了木本植物自身的细胞全能性,促进转基因根向整株转基因植株的分化,并且成本低,该方法适用性广,可以用于各种木本植物的转基因培育,具有广阔应用前景。(The invention discloses a method for obtaining a whole transgenic woody plant by transforming agrobacterium rhizogenes. The method comprises the steps of firstly transferring a common or specific carrier carrying a target gene into agrobacterium rhizogenes, then infecting a pre-cultured woody plant tissue culture seedling with activated agrobacterium rhizogenes bacterial liquid, culturing until a plant grows a transgenic hairy root, transferring the plant to a root bud transformation pre-culture medium added with dexamethasone or MdWUSCHEL1 protein to induce root germination, and then propagating and rooting to obtain the whole transgenic woody plant. The method has the advantages of high transformation efficiency of the transgenic plant obtained by the method, low cost, wide applicability, wide application range, wide application prospect and capability of promoting the differentiation of the transgenic root to the whole transgenic plant by fully utilizing the cell totipotency of the woody plant.)
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。
背景技术
利用发根农杆菌转化植物是一种传统的植物转基因方法。发根农杆菌中含Ri质粒，Ri质粒T-DNA的LB端含RolA、RolB、RolC、RolD四个生根相关基因，RB端含生长素、细胞***素和冠瘿碱三个合成基因。这几个与生根及激素相关基因的存在使发根农杆菌侵染植物后，植物在侵染成功部位长出不定根，该不定根具有可离体生长、生长速度快、无向地性等特性。
发根农杆菌菌株对不同植物的转化能力不同。而现有发根农杆菌成功转化的植物多为草本植物，如玉米、花生、菠菜、人参、苜蓿、菊花、雪莲等，且其中很多草本植物都易由转基因根系转化为整株转基因植株。但对于木本植物来说，不仅转化效率低，且转化成功的植物种类很少，目前仅有苹果、柑橘、喜树、具芒小檗等几种木本植物转化成功，而且成功由转基因根诱导为整株的也仅有柑橘。其中主要的原因的是木本植物脱分化效率较草本植物更为低下，细胞全能性差，根向芽分化难度大。
芽由顶端分生组织分化而来，而WUSCHEL1基因是顶端分生组织分化的决定性因素，它能够促进顶端分生组织的分化，进而促进芽的形成。WUSCHEL1基因也能使某些组织或器官在不添加任何外源激素的情况下诱导体细胞胚发生。虽然现有技术提到过通过注射带有目的基因的发根农杆菌的菌液的方法使已生根苗再长出新的转基因毛状根，但该发明中最终仍停留在获得转基因根系的阶段，并未获得整株转基因植株，而WUSCHEL1基因的特性对获得整株木本植株存在重要意义。
发明内容
本发明公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，本发明克服了传统植物转基因方法低效率、高成本的缺陷，将WUXCHEL1基因转入转基因植物中，提高了木本植物细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并成功获得含有WUXCHEL1基因的整株转基因木本植株，提高了木本植物的转化效率。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含有目的基因的活化发根农杆菌菌液；
(2)将木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下继代培养28-32天后，切掉愈伤团，转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下预培养4-6天，得到预培养组培苗；
(3)取出所述预培养组培苗，切掉愈伤组织，切口处蘸取所述含有目的基因的活化发根农杆菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染组培苗；
(4)将所述侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗的条件下培养1-2天后插到含有500mg/L特美汀的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；
(5)待所述转基因根系的根长到5cm时切下，先转入根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗下培养5天后，再转入添加***或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中培养直至生芽，得到转基因地上部分转基因芽；
(6)将所述转基因芽先转入继代培养基，再转入生根培养基中培养至生根，得到整株转基因木本植株。
进一步的，所述步骤(1)中表达载体包括普通表达载体和特定表达载体。
进一步的，所述特定表达载体为***诱导型启动子载体PTA7002中***CamV35S：：WUSCHEL1-CamV35S：：目的基因序列。
进一步的，所述***的添加量为5-10μm/L。
进一步的，所述MdWUSCHEL1蛋白质的浓度为5μM/L。
进一步的，所述根芽转化预培养基为MS液体培养基中含0-1.0mg/L TDZ、0-1.0mg/L NAA、500mg/L特美汀、30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。
进一步的，所述生根培养基为20-25g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85MS液体培养基中含0-0.7mg/L IBA、0-0.1mg/L IAA、200mM/L cPTIO、20-25g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。
进一步的，所述木本植株包括苹果、猕猴桃、樱桃、桃和桂花。
进一步的，所述整株转基因木本植株的检测引物序列为：
Forward：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG；
Reward：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明利用发根农杆菌转化效率高的优势，将促进植物芽生长的WUSCHEL1基因和目的基因一起转入木本植物的根系中，进一步利用木本植物自身的细胞全能性，将转基因根系脱分化形成整株转基因植株。本发明利用了传统转基因和分子机制结合的方法，该方法适用性广，可以用于各种木本植物的转基因培育，不仅很好的提高了转基因植株的转化效率，还可以促进转基因根向整株转基因植株的分化，且操作简单、成本低，在科研和实际农业种植中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为转基因载体图谱。
图2为本发明实施例4获得的转基因苹果的转基因芽。
图3为本发明实施例5获得的转基因猕猴桃的转基因芽。
图4为本发明实施例6获得的转基因樱桃的转基因芽。
图5为本发明实施例4-6中蛋白质检测结果，其中1：苹果中GFP，2：猕猴桃中GFP，3：樱桃中GFP。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
下列实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均按照常规或制造厂商所建议的方法和条件；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得或使用常规方法制备。
实施例1
本发明所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，具体包括以下步骤：
(1)将携带目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含目的基因的活化发根农杆菌菌液；
(2)将生长状态良好的木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养30天，得到继代组培苗；
(3)将继代组培苗形态学下端的愈伤团切掉后转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下预培养5天，得到预培养组培苗；
(4)用镊子取出预培养组培苗，切掉组培苗基部愈伤组织，将切口处在活化好的发根农杆菌菌液中蘸取一次，然后用无菌滤纸将切口处多余菌液吸干，得到侵染组培苗；
(5)将侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗条件下共培养1-2天后，再插到加入500mg/L特美汀抗生素的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；
(6)当转基因根系的根长到5cm时切下，先转到根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养5天，再转入加了5μM/L MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中诱导生芽，直到长出新芽，得到转基因地上部分转基因芽；
(7)将转基因芽转入继代培养基中继续生长30天，得到转基因苗；
(8)将长大的转基因苗转入生根培养基中培养至生根，即可得到整株转基因木本植株。
在本实施例中，目的基因可以根据实际需求进行选择。本实施例选择的发根农杆菌为R1601、C58C1或K599。所述的木本植物包括苹果、樱桃、猕猴桃、桃、桂花等。
其中，所述继代培养基配方为：每升MS液体培养基中含0-0.5g/L IBA、0-0.2mg/LIAA、0-1.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。
所述生根培养基配方为：每升MS液体培养基中含0-0.7mg/L IBA、0-0.1mg/L IAA、200mM/L cPTIO、20-25g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。
所述根芽转化预培养基配方为：MS液体培养基中含0-1.0mg/L TDZ、0-1.0mg/LNAA、500mg/L特美汀、30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。
本发明所使用的MdWUSCHEL1蛋白质是拟南芥WUSCHEL1的苹果同源蛋白质，该蛋白质是由生物公司合成的，且其TF ID为MDP0000144307。
实施例2
本发明所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，具体包括以下步骤：
(1)将携带***诱导型启动子启动的WUSCHEL1基因和CaMv35S启动的目的基因的表达载体转入发根农杆菌并活化，得到可诱导启动WUSCHEL1并含目的基因的活化发根农杆菌菌液；
(2)将生长状态良好的木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养30天，得到继代组培苗；
(3)将继代组培苗形态学下端的愈伤团切掉后转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗条件下预培养5天，得到预培养组培苗；
(4)用镊子将预培养组培苗取出，切掉组培苗基部愈伤组织，再将切口处在活化好的发根农杆菌菌液中蘸取一下，然后用无菌滤纸将切口处的多余菌液吸干，得到侵染组培苗；
(5)将侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗条件下培养1-2天；再插到含有500mg/L特美汀抗生素的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；
(6)待转基因根系的根长到5厘米时切下，转到根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养5天，再转入含有5-10μm/L***的根芽转化预培养基中诱导生芽，直到长出新芽，得到转基因芽；
(7)将转基因芽转入继代培养基中继续生长30天，得到转基因苗；
(8)将长大的转基因苗转入生根培养基中培养至生根，得到整株转基因木本植株。
在本实施例中，所述表达载体为***诱导型启动子载体PTA7002中***CamV35S：：WUSCHEL1-CamV35S：：目的基因序列(图1)。本实施例选择的发根农杆菌为R1601、C58C1或K599。所述的木本植物包括苹果、樱桃、猕猴桃、桃、桂花等。本实施例中各种培养基配方与实施例1中的配方相同。
实施例3
1、应用MdWUSCHEL1蛋白质外施对根芽转化的影响实验
在实施例1得到的转基因根系进行根芽转化时，将不同浓度(0，5，10μm/L)的MdWUSCHEL1蛋白质外施于培养基中，在每个浓度下诱导培养20条根毛状根，然后观察记录根芽转化率。结果如表1所示，当外施5μm/L的MdWUSCHEL1蛋白质时，根芽转化率为70％，达到较高水平，说明植株的根芽转化能力被明显提升。
表1 不同浓度WUSCHEL1蛋白质外施的根芽转化结果
由于MdWUSCHEL1蛋白质与拟南芥WUSCHEL1蛋白质同源，因此两者具有相似的功能，都可以促进顶端分生组织的分化，进而促进芽的形成，其原理是：干细胞主要是通过CLAVATA-WUSCHEL负反馈调节回路来维持的，当WUSCHEL增多时，就会抑制CLAVATA的表达，从而促进干细胞向芽的分化，因此适量浓度的WUSCHEL1或MdWUSCHEL1蛋白质外施能促进根系干细胞进行根芽转化过程，提高木本植物根芽转化率，从而形成更多的芽。但当MdWUSCHEL1浓度达到10μm/L时，过高的MdWUSCHEL1诱导畸形芽甚至非芽结构产生，因此不能促进根系干细胞的根芽转化过程。
2、应用MdSTM外施对根芽转化的影响实验
在实施例1得到的转基因根系进行根芽转化时，分别将不同浓度(0，5，10μm/L)的MdSTM蛋白质外施于培养基中，在每个浓度下诱导培养20条根，观察记录根芽转化率。其中，使用的MdSTM蛋白质是拟南芥STM的苹果同源性最高的蛋白质，该蛋白质是由生物公司合成的，且其TF ID为MDP0000136226。结果如表2所示，外施MdSTM蛋白质会提高根芽转化率，但作用影响不大。
表2 不同浓度MdSTM蛋白质外施的根芽转化结果
由于MdSTM蛋白质与拟南芥STM蛋白质基因同源，它与WUSCHEL共同作用于CLAVATA促进干细胞向芽的分化，因此适量浓度的MdSTM蛋白质外施能促进根系干细胞进行根芽转化过程，提高根芽转化率，从而形成更多的芽。但在分子层面上，STM对CLAVATA的作用效果弱于WUSCHEL，因此MdSTM外施对根芽转化过程的促进效果不如WUSCHEL明显。
3、应用***诱导型启动子启动的拟南芥WUSCHEL1基因***对根芽转化的影响实验
观察记录***诱导型启动子启动的WUSCHEL1基因***与无任何功能基因***的转基因根系进行根芽转化时的根芽转化率，结果如表3所示，***诱导型启动子启动的WUSCHEL1基因***可以显著提高植株的根芽转化率。
表3 功能基因***的根芽转化结果
这是由于WUSCHEL1基因表达后会翻译成WUSCHEL1蛋白质，而一定浓度的WUSCHEL1蛋白能促进根系干细胞进行根芽转化过程，提高根芽转化率，从而形成更多的芽。
综上，在利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的过程中，选择***诱导型启动子启动的WUSCHEL1基因***或外施5μm/L的MdWUSCHEL1蛋白质均可以很好的提高根芽转化率，进而更好的获得整株转基因木本植株。
实施例4
EGFP基因转化苹果砧木平邑甜茶植株的构建方法，包括以下步骤：
(1)培养获得用于转基因的植物材料：将平邑甜茶组培苗切段，转入平邑甜茶继代培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养30天；将生长30天的继代苗底部的愈伤团切掉后转入平邑甜茶生根培养基(1/2MS+0.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中预培养5天，获得用于转化的植物材料。
(2)转化并培养获得用于转化的菌株：将载体质粒从大肠杆菌中提出，用热激法转入发根农杆菌感受态细胞C58C1，在50mg/L kana和50mg/L链霉素的LB培养基上培养获得阳性菌株，经PCR验证后，转摇至50ml，OD600为0.8，获得用于转化的菌株。
(3)转化：将预培养的植株取出，切掉植株基部愈伤组织，伤口处在菌液中蘸一下后用无菌滤纸将菌液吸干，将植株放回平邑甜茶生根培养基中，置于28℃培养箱中暗培养1天后，将植株重新转至加入500mg/L特美汀的平邑甜茶生根培养基中，培养至生出转基因毛状根。
(4)根生芽：当转基因毛状根长至大于3cm时，将毛状根切下，转到根芽转化预培养基(MS+0.2mg/L TDZ+NAA0.4mg/L+500mg/L特美汀+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养5天，再转入加了5μm/L***的根芽转化预培养基中培养至生芽(图2)，并将新生芽转入加入500mg/L特美汀平邑甜茶继代培养基中进行继代培养，再转入生根培养基中培养至生根，获得整株转基因木本植株。
(5)转基因植株的鉴定：在基因组、转录和蛋白水平上分别进行转基因植株的鉴定。用CTAB法提取基因组，试剂盒提取RNA和蛋白质。基因组和转录水平的检测所用到的引物为：Forward：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID No.1)；Reward：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ ID No.2)。蛋白质检测结果如图5所示。
实施例5
EGFP基因转化猕猴桃的构建方法，包括以下步骤：
(1)培养获得用于转基因的植物材料：将猕猴桃组培苗切段，转入猕猴桃继代培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养30天；将生长30天的继代苗底部的愈伤团切掉后转入猕猴桃生根培养基(1/2MS+0.7mg/L IBA+25g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中预培养5天，即可获得用于转化的植物材料。
(2)转化并培养获得用于转化的菌株：将载体质粒从大肠杆菌中提出，用热激法转入发根农杆菌感受态细胞C58C1，在50mg/L kana和50mg/L链霉素的LB培养基上培养获得阳性菌株，经PCR验证后，转摇至50ml，OD600为0.8，获得用于转化的菌株。
(3)转化：将预培养的植株取出，切掉植株基部愈伤组织，伤口处在菌液中蘸一下后用无菌滤纸将菌液吸干，将植株放回猕猴桃生根培养基，置于28℃培养箱中暗培养1天后，将植株重新转至加入500mg/L特美汀的猕猴桃生根培养基中，培养至生出转基因毛状根。
(4)根生芽：当转基因毛状根长至大于3cm时，将毛状根切下，转到根芽转化预培养基(MS+0.4mg/L TDZ+NAA0.6mg/L+500mg/L特美汀+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养5天，再转入加了5μm/L***的根芽转化预培养基中培养至生芽(图3)，并将新生芽转入加入500mg/L特美汀猕猴桃继代培养基中进行继代培养，再转入生根培养基中培养至生根，获得整株转基因木本植株。
(5)转基因材料的鉴定：在基因组、转录和蛋白水平上分别进行转基因植株的鉴定。用CTAB法提取基因组，试剂盒提取RNA和蛋白质。基因组和转录水平的检测所用到的引物为：Forward：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID No.1)；Reward：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ ID No.2)。蛋白质检测结果如图5所示
实施例6
EGFP基因转化樱桃的构建方法，包括以下步骤：
(1)培养获得用于转基因的植物材料：将樱桃组培苗切段，转入樱桃继代培养基(MS+0.4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养30天；将生长30天的继代苗底部的愈伤团切掉后转入樱桃生根培养基(1/2MS+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中预培养5天，即可获得用于转化的植物材料。
(2)转化并培养获得用于转化的菌株：将载体质粒从大肠杆菌中提出，用热激法转入发根农杆菌感受态细胞C58C1，在50mg/L kana和50mg/L链霉素的LB培养基上培养获得阳性菌株，经PCR验证后，转摇至50ml，OD600为0.8，获得用于转化的菌株。
(3)转化：将预培养的植株取出，切掉植株基部愈伤组织，伤口处在菌液中蘸一下后用无菌滤纸将菌液吸干，将植株放回樱桃生根培养基，置于28℃培养箱中暗培养1天后，将植株重新转至加入500mg/L特美汀的樱桃生根培养基中，培养至生出转基因毛状根。
(4)根生芽：当转基因毛状根长至大于3cm时，将毛状根切下，转到根芽转化预培养基(MS+0.2mg/L TDZ+NAA1.0mg/L+500mg/L特美汀+30g/L蔗糖+8.5g/L琼脂)中培养5天，再转入加了***(5μm/L)的根芽转化预培养基中培养至生芽(图4)，并将新生芽转入加入500mg/L特美汀樱桃继代培养基中进行继代培养，再转入生根培养基中培养至生根，获得整株转基因木本植株。
(5)转基因材料的鉴定：在基因组、转录和蛋白水平上分别进行转基因植株的鉴定。用CTAB法提取基因组，试剂盒提取RNA和蛋白质。基因组和转录水平的检测所用到的引物为：Forward：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID No.1)；Reward：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ ID No.2)。蛋白质检测结果如图5所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttacttgtac agctcgtcca tg 22