阅读说明：本技术 一种提高电穿孔细胞转染效率的方法 (Method for improving transfection efficiency of electroporation cell ) 是由 郭霄亮 商院芳 石晓晓 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高电穿孔细胞转染效率的方法,包括,采用电穿孔装置对待处理细胞样本液体进行电穿孔,所述电穿孔装置的电极中至少有一片为多孔电极；此外,通过对所述电穿孔电极施加双极性脉冲电压,对待处理细胞样本液体进行电穿孔,所述双极性脉冲电压的脉冲电压在-2kV～+2kV之间。本发明通过使用多孔电极来作为电穿孔电极,可增加电极双电层电容,从而减轻电极表面分压,增加施加在溶液上的电压增大,缓解溶液电解和阴极效应,而阴极效应是增加细胞死亡率、降低转染率的主要因素；同时由于减少了电极上的分压,可以在同等电场强度要求下,减少施加电压的强度。(The invention discloses a method for improving the transfection efficiency of electroporation cells, which comprises the steps of performing electroporation on cell sample liquid to be treated by adopting an electroporation device, wherein at least one piece of electrode of the electroporation device is a porous electrode; in addition, the cell sample liquid to be processed is electroporated by applying a bipolar pulse voltage to the electroporation electrode, the pulse voltage of the bipolar pulse voltage being between-2 kV and +2 kV. According to the invention, the porous electrode is used as the electroporation electrode, so that the electric double layer capacitance of the electrode can be increased, the partial pressure on the surface of the electrode is reduced, the voltage applied to the solution is increased, the electrolysis of the solution and the cathode effect are relieved, and the cathode effect is a main factor for increasing the cell death rate and reducing the transfection rate; meanwhile, the partial pressure on the electrode is reduced, so that the intensity of applied voltage can be reduced under the requirement of the same electric field intensity.)

一种提高电穿孔细胞转染效率的方法

技术领域

本发明设计电穿孔技术领域，具体涉及一种提高电穿孔细胞转染效率的方法。

背景技术

电穿孔是一种通过施加外部脉冲电场使细胞膜产生跨膜电压，当细胞跨膜电压超过一定阈值后，细胞膜表面形成可恢复的微孔，从而将外源物质导入细胞的细胞转染的方法。电穿孔现象不会对细胞造成永久性的损伤，其所形成的微孔可自行恢复，电穿孔现象使生物活性物质进入细胞成为可能。

在电穿孔的过程中，如何提高其转染率，同时降低其死亡率是本领域技术人员急需解决的关键技术问题。到目前为止，尚未见到有关优化电穿孔装置的电穿孔电极的结构和所施加的脉冲电压在提高其转染率和降低其死亡率的相关报道。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高电穿孔细胞转染效率的方法。

根据本发明一方面提供了一种提高电穿孔细胞转染效率的方法，包括，采用电穿孔装置对待处理细胞样本液体进行电穿孔，所述电穿孔装置的电极中至少有一片为多孔电极。

理想情况下，在流式电穿孔装置中电极施加电压，细胞样本液体相当于电阻，细胞样本在高电场下产生微孔，实现电穿孔；但在实际应用中，电极和细胞样本液体接触，在电极表面极易形成一层双电层，构成一个双电层电容。双电层电容在串联电路中会分压，使实际加在溶液上的电压变小，造成电极内电场强度分布发生变化；同时，由于双电层电容分压较大会造成电极电解。在电极表面发生电解水反应，产生气泡，如果气泡在电穿孔室内部滞留，由于气泡不导电，电极内电场强度分布发生变化；同时气泡占据腔室，会改变溶液流速，导致细胞流过电极区域接受到的电流脉冲信号次数和强度的改变，造成电穿孔结果发生变化。增加双电层电容可以减轻分压影响，增加施加在溶液上的电压增大，缓解电解效果。多孔电极可以极大的增加了细胞样本液体和电极的接触面积，增加了双电层电容，容抗和电容成反比，使得容抗减小，减小了分压，双电层电压减小到可忽略不计，可以有效降低电解现象，可以显著提高电转染效率。

在上述技术方案中，所述多孔电极的孔径尺寸为3nm-7mm，优选为1-1000μm。

在上述技术方案中，所述多孔电极为连通多孔电极。

进一步地，在上述技术方案中，所述多孔电极的孔隙率为10-90％。

具体地，多孔电极的孔径尺寸和孔隙率均直接与双电层电容有密切关系，双电层电容进一步与电解强度相关，进而影响到最终的细胞的成活率和转染率。

孔隙率过小对降低双电层电容不明显，相反，若孔隙率过大，细胞电极较为脆弱。

又进一步地，在上述技术方案中，所述电穿孔装置的电极采用包含金属、非金属和金属-非金属组合在内的导电体材料制得，优选采用金属泡沫、石墨烯、碳纳米管和铂黑电极中的一种或多种制得。

又进一步地，在上述技术方案中，所述电穿孔装置的电极的形状为方形、圆形和椭圆形中的一种或几种。

在上述技术方案中，通过对所述电穿孔装置的电极施加双极性脉冲电压，对待处理细胞样本液体进行电穿孔，所述双极性脉冲电压的脉冲电压在-2kV～+2kV之间，使得溶液中的电场可以达到200-2000V/cm。

具体地，施加信号采用双极性脉冲，以进一步降低阴极效应产生的PH变化。对于单极性脉冲，由于电流是单向的，会出现电极效果的累计，即pH会不断单方向变化。对于双极性脉冲由于瞬间施加了相反的电压，产生氢氧根的电极迅速会消耗氢氧根，这样会大大的降低pH变化对细胞造成的影响。

进一步地，在上述技术方案中，所述双极性脉冲电压的正反极性脉冲的间隔为0-100ms，优选为0-10ms。

进一步地，在上述技术方案中，所述双极性脉冲电压的波形为方波、梯形波、三角波和指数衰减波中的一种。

本发明另一方面还提供了上述提高电穿孔细胞转染效率的方法在电穿孔细胞转染中的应用。

本发明的优点：

本发明通过使用多孔电极来作为电穿孔电极，可增加电极双电层电容，从而减轻电极表面分压，增加施加在溶液上的电压增大，缓解溶液电解和阴极效应，而阴极效应是增加细胞死亡率、降低转染率的主要因素；同时由于减少了电极上的分压，可以在同等电场强度要求下，减少施加电压的强度。

附图说明

图1为本发明实施例采用多孔电极作为电穿孔电极的电穿孔装置的等效电路网络图；

图2为本发明实施例电穿孔的电极溶液系统的电穿孔模型的等效图；

图3为本发明实施例所采用的电穿孔装置的核心结构图；

图4为本发明实施例分别采用普通电极和多孔电极分别施加单极性脉冲电压和双极性脉冲电压后其pH结果对照图；

图5为本发明实施例的Hela细胞的GFP转染试验结果；

图中：

多孔电极1，流体池2，细胞悬浮液入口3，细胞悬浮液出口4。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得，若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

本发明实施例提供了一种提高电穿孔细胞转染效率的方法，具体为，采用至少有一片电极为多孔电极的电穿孔装置对待处理细胞样本液体进行电穿孔。

具体地，上述电穿孔装置的核心结构如图3所示，包括流体池2，所述流体池2的两端相对设置有细胞悬浮液入口3和细胞悬浮液出口4，此外，在流体池2的内部，相对平行设置有两片电极，上述两片电极沿细胞悬浮液在流体池2内的流动方向延伸，且上述两片电极中至少有一片为多孔电极1。

详细地，如图1所示为采用多孔电极作为电穿孔电极的电穿孔装置的等效电路网络图，在实际应用中，电极和细胞样本液体接触，在电极表面极易形成一层双电层，构成一个双电层电容。双电层电容在串联电路中会分压，使实际加在溶液上的电压变小，造成电极内电场强度分布发生变化；同时，由于双电层电容分压较大会造成电极电解。在电极表面发生电解水反应，产生气泡，如果气泡在电穿孔室内部滞留，由于气泡不导电，电极内电场强度分布发生变化；同时气泡占据腔室，会改变溶液流速，导致细胞流过电极区域接受到的电流脉冲信号次数和强度的改变，造成电穿孔结果发生变化。增加双电层电容可以减轻分压影响，增加施加在溶液上的电压增大，缓解电解效果。多孔电极可以极大的增加了细胞样本液体和电极的接触面积，增加了双电层电容，容抗和电容成反比，使得容抗减小，减小了分压，双电层电压减小到可忽略不计，可以有效降低电解现象，可以显著提高电转染效率。

如图2所示为本发明实施例电穿孔的电极溶液系统的电穿孔模型的等效图，其中，C_dl为电极双电层电容，R_s为溶液的等效电阻。

施加在两个电极两端的总电压为

U＝2Uc+Ur。

其中：

Uc的大小决定了电解的程度，Ur的大小则决定了施加在溶液上有效电场的大小。

具体地，Uc＝1/jwC_dl×I，Ur＝R_s×I。

其中，j为虚数单位，w为角频率，I为电流。

从上分析可见，C_dl越大，Uc的分压会越小，意味着在达到同等溶液内部电场的情况下，导致电解的Uc会越小，从而越不容易产生电解。同时，可以发现，在达到同样的内部电场的情况下，施加的电压也会减小。

在本发明实施例中，该多孔电极的孔径尺寸为3nm-7mm，其孔隙率为10-90％。

具体地，在本发明实施例中，该多孔电极可采用包含金属、非金属和金属-非金属组合在内的导电体材料制得，在具体应用过程中，多孔电极大多采用金属泡沫、石墨烯、碳纳米管和铂黑电极制得。

在本发明的一个具体实施方式中，采用不锈钢材料制备孔隙率为80％的连通的金属泡沫多孔电极，与采用相同材料制得的尺寸规格相同的普通平面电极相比，多孔电极的等效双电层电容为普通平面电极的5-10倍。

此外，为了验证多孔电极和双极性脉冲可以大大的较少pH变化产生的影响，分别采用普通电极和多孔电极，对其施加单极性脉冲和双极性脉冲(幅值：1200V；脉冲宽度：1ms，脉冲个数：5个)。

结果如图4所示，其中，图4a、4b和4c分别为平面电极施加单极性脉冲、多孔电极施加单极性脉冲和多孔电极施加双极性脉冲后滴加酚酞后的颜色，酚酞颜色变深，说明pH变化越大，则会对细胞的死亡率产生较大的影响。通过对比图4的结果，可以看出，多孔电极施加双极性脉冲后几乎不会改变溶液的pH值。

在一个具体实施方式中，对Hela细胞进行GFP转染实验，具体为，将细胞换液到细胞穿孔液中，并调节浓度至2×10⁵mL^-1，在细胞悬浮液中加入质粒pEGFP-N，使得质粒的最终浓度为含有120μg/mL，将细胞悬浮液泵入到电穿孔池中，施加脉冲为1200V(脉冲宽度为1ms，脉冲个数为2个)，将电穿孔的细胞加入新鲜的培养基，并转至37℃、5％CO₂气氛的培养箱中进行细胞培养；24h后，拍摄荧光显微图像，成功转染的细胞将发射507nm绿色，当它们被488nm光激发时的荧光。细胞转染结果如图5所示，经测定，其成活率可以达到80％以上，且转染率可以达到90％以上。

最后，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。