阅读说明：本技术 一种半乳甘露聚糖的分离纯化方法 (Separation and purification method of galactomannan ) 是由 武建 袁润 张伟 曹毅 彭满菊 马敏滢 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种半乳甘露聚糖的分离纯化方法,包括如下步骤：取中性甘露聚糖酶溶液、植物胶,经酶解反应后,得到酶解液；将所述酶解液进行离心,得到离心液与离心沉淀物；将所述离心液采用中空纤维膜进行过滤,按照所述中空纤维膜的截留分子量,将离心液进行分离,得到不同分子量的离心液；将所述离心沉淀物干燥,并将不同分子量的离心液分别脱色浓缩、干燥,即得到不同分子量的半乳甘露聚糖。本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法,工艺简单,能源消耗低,能够满足膳食纤维提纯、精制的要求,能有效去除杂质,降低有效成分损失,产品纯度高,多糖得率高。(The invention provides a method for separating and purifying galactomannan, which comprises the following steps: taking a neutral mannase solution and vegetable gum, and carrying out enzymolysis reaction to obtain an enzymolysis solution; centrifuging the enzymolysis solution to obtain a centrifugate and a centrifugal precipitate; filtering the centrifugate by adopting a hollow fiber membrane, and separating the centrifugate according to the molecular weight cut-off of the hollow fiber membrane to obtain centrifugates with different molecular weights; and drying the centrifugal precipitate, and respectively decolorizing, concentrating and drying the centrifugates with different molecular weights to obtain the galactomannans with different molecular weights. The method for separating and purifying the galactomannan has the advantages of simple process and low energy consumption, can meet the requirements of purifying and refining dietary fiber, can effectively remove impurities, reduce the loss of effective components, and has high product purity and polysaccharide yield.)

一种半乳甘露聚糖的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种半乳甘露聚糖的分离纯化方法。

背景技术

膳食纤维是指能抗人体小肠消化吸收，而在人体大肠能部分或全部发酵的可食用的植物性成分、碳水化合物及其相类似物质的总和。一般是指不易被消化酶消化的多糖类食物成分，聚合度≥3的碳水化合物和木质素，其主要来自于植物的细胞壁(中国营养学会)。基于以上定义，膳食纤维包括很多不被人体小肠消化的物质，如纤维素、半纤维素、树胶、β-葡聚糖、胶质、木质素、葡聚糖、果聚糖、抗性淀粉和糊精等。

根据膳食纤维在水中溶解性不同，将其分为2个基本类型，即：水溶性膳食纤维(SDF)与不溶性膳食纤维(NDF)。其中，水溶性膳食纤维是可溶于温水或热水，且其水溶液能被4倍95％的乙醇再沉淀的那部分纤维，主要是细胞壁内的储存物质及分泌物，另外还包括微生物多糖和合成多糖，其组成主要是一些胶类物质，如果胶、树胶和粘液等，还有半乳甘露糖、葡聚糖、海藻酸钠、羧甲基纤维素和真菌多糖等，部分半纤维素。

膳食纤维的化学组成和结构决定了其理化性质，虽然膳食纤维在人体内不能被消化吸收，但却具有重要的生理功能。具体而言，可分为以下几个方面：(1)促进胃肠蠕动，减少便秘。膳食纤维促进肠胃蠕动，缩短了食糜在肠道内停留时间，加速粪便排出。膳食纤维在肠腔中被细菌产生的酶所酵解，先分解成单糖而后又生成短链脂肪酸。短链脂肪酸被利用后在肠腔内产生CO2并使酸度增加、粪便量增加以及加速肠内容物在结肠内的转移而使粪便易于排出，从而达到预防便秘的作用。(2)清道夫作用。由于膳食纤维中含有果胶、树胶、海藻多糖等结构，能明显增加小肠内容物的黏度，膳食纤维含有大量的羟基、羧基等集团，可以有效地减少饮食中的汞、镉、铅等重金属以及亚硝胺等有毒物质在肠道内的吸收；在接近胃pH的条件下，含水溶性纤维较多的水果纤维的吸附能力较强。此外，膳食纤维可抑制厌氧菌的生长和繁殖，有利于肠道有益菌合成供人体利用的维生素。另外，膳食纤维可减少病原菌从后肠向前肠转移，水不溶性膳食纤维对有害物质有较强的吸附毒素和病原菌的能力，还携带有其他生物活性物质，诸如植酸等，可抑制癌症的形成，减少结肠癌的发病率。(3)稳定血糖浓度，降低血液胆固醇水平。膳食纤维所形成的粘液在胃中形成胶基层，降低胃的排空率。在肠内阻碍消化酶与实务的接触，减缓小肠收缩，影响葡萄糖的吸收，舒服葡萄糖，降低肠液葡萄糖的有效浓度，影响α-淀粉酶对淀粉的降解作用，降低肠液中葡萄糖的释放速度，改善末梢组织对胰岛素的感受性，降低机体对胰岛素的作用，使葡萄糖的吸收率下降。(4)稳定肠道菌群平衡。人体肠道微生态系统包括微生物群落及其微环境，而肠壁内则分布着功能强大的免疫系统，以肠粘膜为界，两者相同作用、相互制约，处于动态平衡状态。人体肠道微生态在促进免疫系统发育、维持正常免疫功能、协同拮抗病原体入侵等方面发挥重要作用。保持健康的饮食***衡。另外，丁酸可以为结肠黏膜细胞提供能量，促进上皮细胞的增殖，维持肠黏膜的完整性，从而有益于养分的吸收并预防腹泻。肠内的腐生菌易在高pH环境中生长，结肠内的一些有益菌将膳食纤维降解产生短链脂肪酸，降低肠道内的pH值，从而抑制了腐生菌的生长。(6)膳食纤维具有持水膨胀的特性。膳食纤维具有亲水性的极性基团，因而具有持水性和溶胀性。膳食纤维比重小，遇水后体积增大，对肠道产生容积作用，进食后充填胃腔，需要较长时间来消化，延长胃排空的时间，减少动物饥饿引起的异常行为的发生。

总之，膳食纤维是一种多糖，它既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量。膳食纤维的生理功能:这类物质能刺激肠道蠕动，有利于粪便排出，可预防便秘、直肠癌、痔疮及下肢静脉曲张；可预防动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的发生；产生饱腹感，对肥胖病人进食有利，可作为减肥产品；改善耐糖量，可调节糖尿病病人的血糖水平，可作为糖尿病患者的食品；改善肠道菌群，维护肠道菌群平衡。

甘露寡糖是指由2-10个甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的寡糖，瓜尔胶来源的甘露寡糖中还含有α-1,6-糖苷键连接的半乳糖侧链。甘露寡糖具有性质稳定、低热量、降血糖等特点，是新一代功能食品配料理。因此，瓜尔胶来源的半乳甘露聚糖及可溶性膳食纤维具有非常广阔的市场前景。在瓜尔胶来源的半乳甘露聚糖制备工艺中，得到的多糖提取液的除杂脱色多采用絮凝沉淀、离心分离法，但絮凝法费用高、效率低、且添加絮凝剂引入的杂质需要在后续工艺中去除，同时沉淀物会吸附一部分半乳甘露聚糖，使收率降低。而对多糖的脱蛋白方法常用到Savage法、三氯乙酸(TCA)法、TCA-正丁醇法、酶法、盐酸法等，往往因多糖来源不同而存在差异，但都存在溶剂用量大，有机溶剂残留，引入杂质等问题。

为解决上述问题，中国专利文献CN105861595A中公开一种利用瓜尔胶快速制备半乳甘露聚糖的方法，其包括瓜尔胶片清洗、破碎、酶解、超滤、脱色膜过滤、滤液浓缩、干燥、超微粉碎的步骤。其中，采用超滤及脱色膜过滤的方式，可以得到较高收率及产品纯度。但是，上述方法得到的半乳甘露聚糖的产品收率及产品纯度仍然不够理想，也无法对不同分子量的产品进行分离。

发明内容

本发明的解决的技术问题在于现有技术中制备半乳甘露聚糖的方法存在产品收率及产品纯度不佳、且无法对不同分子量的产品进行分离的问题，进而提供一种能有效去除杂质、降低有效成分损失，且能够对不同分子量的产品进行分离的半乳甘露聚糖的分离纯化方法。

为了解决上述问题，本发明提供一种半乳甘露聚糖的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)取中性甘露聚糖酶溶液、植物胶，经酶解反应后，得到酶解液；

(2)将步骤(1)中得到的所述酶解液进行离心，得到离心液与离心沉淀物；

(3)将步骤(2)中的所述离心液采用中空纤维膜进行过滤，按照所述中空纤维膜的截留分子量，将离心液进行分离，得到不同分子量的离心液；

(4)将步骤(2)中的所述离心沉淀物干燥，并将步骤(3)中不同分子量的离心液分别脱色浓缩、干燥，即得到不同分子量的半乳甘露聚糖。

优选地，步骤(1)中，所述植物胶为刺槐豆胶、瓜尔胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶中的一种或多种。

优选地，步骤(1)中，所述中性甘露聚糖酶溶液采用pH值为5.5～7.0的蒸馏水与中性甘露聚糖酶配制而成；所述中性甘露聚糖酶溶液的用量为每1g所述植物胶1000U。

优选地，步骤(1)中，所述酶解反应的反应温度为50℃，反应时间为8h。

优选地，还包括对步骤(1)中得到的所述酶解液进行酶灭活的步骤；具体如下：将所述酶解液置于超高温灭菌设备中，进行杀菌灭活。

优选地，步骤(4)中，对不同分子量的离心液进行脱色浓缩后，采用喷雾干燥，得到所述半乳甘露聚糖的糖干粉。

优选地，步骤(3)中：过滤的温度为30-50℃；过滤的进料压力为0.1-0.5Mpa，出料压力为0.1-0.3Mpa；

所述中空纤维膜的膜组件为卷式或者管式膜组件；所述中空纤维膜为聚苯乙烯膜、醋酸纤维膜、聚醚砜膜、聚砜膜、聚酰胺膜中的一种或多种。

优选地，步骤(3)中，所述中空纤维膜包括截留分子量分别为200kDa、50kDa、2kDa的中空纤维膜，经截留，得到分子量大于200kDa的离心液、分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液。

优选地，步骤(4)中，将步骤(2)中的所述离心沉淀物与分子量大于200kDa的离心液共同干燥，并将步骤(3)中分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液分别脱色浓缩、干燥。

优选地，当所述植物胶的底物浓度大于或等于0.15kg/L时，步骤(3)中，所述中空纤维膜还包括截留分子量为300kDa的中空纤维膜。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，工艺简单，能源消耗低，降低成本，过程无相变，保持原有物质特性，且避免采用有机试剂，无溶剂残留问题，能够满足膳食纤维提纯、精制的要求；

(2)本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，采用膜分离技术，效率高，能有效去除杂质，降低有效成分损失，半乳甘露聚糖的损失率≤10％；产品纯度可达到99％以上，多糖得率高，产品收率可提高20-50％；

(3)本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，通过多个中空纤维膜的设置，截留不同分子量的离心液，可实现分级分离，易于连续化和自动化操作，缩短生产周期；

(4)本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，可建立易于快速检测的方法，通过中间检测对最终制备产品进行分析判断，以便于实现产品质量把控。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明各实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例中注明具体试剂的生产厂家、型号者，也仅为举例，不同厂家、型号的原料并不影响本发明技术方案的实施及技术效果的实现。

本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)取中性甘露聚糖酶溶液、植物胶，经酶解反应后，得到酶解液；将所述酶解液置于超高温灭菌设备UHT中,进行杀菌灭活。

其中，所述植物胶为刺槐豆胶、瓜尔胶、田菁胶、胡芦巴胶、塔拉胶中的一种或多种；所述中性甘露聚糖酶为市售获得，所述中性甘露聚糖酶溶液采用pH值为5.5～7.0的蒸馏水与中性甘露聚糖酶配制而成；所述中性甘露聚糖酶溶液的用量为每1g所述植物胶1000U。

(2)将步骤(1)中得到的所述酶解液进行离心，得到离心液与离心沉淀物；经检测，离心后离心液的糖浓度在5-25％，粘度在10-200cps。

(3)将步骤(2)中的所述离心液采用中空纤维膜进行过滤，按照所述中空纤维膜的截留分子量，将离心液进行分离，得到不同分子量的离心液；

其中，过滤的温度为30-50℃；过滤的进料压力为0.1-0.5Mpa，出料压力为0.1-0.3Mpa；所述中空纤维膜的膜组件为卷式或者管式膜组件；所述中空纤维膜为聚苯乙烯膜、醋酸纤维膜、聚醚砜膜、聚砜膜、聚酰胺膜中的一种或多种。

作为本发明的优选实现方式，所述中空纤维膜包括截留分子量分别为200kDa、50kDa、2kDa的中空纤维膜，经截留，得到分子量大于200kDa的离心液、分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液。

当所述植物胶的底物浓度大于或等于0.15kg/L时，步骤(3)中，所述中空纤维膜还包括截留分子量为300kDa的中空纤维膜。

(4)将步骤(2)中的所述离心沉淀物干燥，并将步骤(3)中不同分子量的离心液分别脱色浓缩、干燥，即得到不同分子量的半乳甘露聚糖。

作为本发明的优选实现方式，将步骤(2)中的所述离心沉淀物与分子量大于200kDa的离心液共同干燥，并将步骤(3)中分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液分别脱色浓缩、采用喷雾干燥，得到所述半乳甘露聚糖的糖干粉。

实施例1

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)于500L酶解罐中加入400L的pH值为5.5的蒸馏水，加入中性甘露聚糖酶，使所述中性甘露聚糖酶溶液的用量为每1g所述植物胶1000U；向所述中性甘露聚糖酶溶液中加入所述植物胶，本实施例中，所述植物胶为刺槐豆胶，用量为60kg。经酶解反应后，得到酶解液；所述酶解反应的反应温度为50℃，反应时间为8h；然后，将所述酶解液置于超高温灭菌设备UHT中，进行杀菌灭活。

(2)将步骤(1)中得到的所述酶解液进行离心，得到离心液与离心沉淀物；

(3)将步骤(2)中的所述离心液采用中空纤维膜进行过滤，过滤的温度为30℃；过滤的进料压力为0.3Mpa，出料压力为0.2Mpa；所述中空纤维膜的膜组件为卷式或者管式膜组件；所述中空纤维膜为聚苯乙烯膜。所述中空纤维膜包括截留分子量分别为300kDa、200kDa、50kDa、2kDa的中空纤维膜，经截留，得到分子量大于300kD的离心液、分子量小于300kDa且大于200kDa的离心液、分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液。

随着底物浓度的提高，一方面单位体积杂质含量也升高，另一方面酶解后单位体积糖浓度升高，粘度会有一定程度升高，会影响膜过滤效率。因此，通过截留分子量为300kDa的中空纤维膜的设置，先过截留分子量300kDa进行粗分离，形成粗过滤液，可减少杂质含量，提高膜过滤效率。

(4)将步骤(2)中的所述离心沉淀物、步骤(3)中分子量大于300kDa、分子量小于300kDa且大于200kDa的离心液共同干燥，并将步骤(3)中分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液(其为寡糖液)分别脱色浓缩、采用喷雾干燥，得到所述半乳甘露聚糖的糖干粉。

实施例2

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)于500L酶解罐中加入400L的pH值为7.0的蒸馏水，加入中性甘露聚糖酶，使所述中性甘露聚糖酶溶液的用量为每1g所述植物胶1000U；向所述中性甘露聚糖酶溶液中加入所述植物胶，本实施例中，所述植物胶为田菁胶，用量为20kg。经酶解反应后，得到酶解液；所述酶解反应的反应温度为50℃，反应时间为8h；然后，将所述酶解液置于超高温灭菌设备UHT中,进行杀菌灭活。

(2)将步骤(1)中得到的所述酶解液进行离心，得到离心液与离心沉淀物；

(3)将步骤(2)中的所述离心液采用中空纤维膜进行过滤，过滤的温度为50℃；过滤的进料压力为0.5Mpa，出料压力为0.1Mpa；所述中空纤维膜的膜组件为卷式或者管式膜组件；所述中空纤维膜为醋酸纤维膜。所述中空纤维膜包括截留分子量分别为200kDa、50kDa、2kDa的中空纤维膜，经截留，得到分子量大于200kDa的离心液、分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液。

(4)将步骤(2)中的所述离心沉淀物与步骤(3)中分子量大于200kDa的离心液共同干燥，并将步骤(3)中分子量小于200kDa的离心液、分子量小于50kDa的离心液、分子量小于2kDa的离心液(其为寡糖液)分别脱色浓缩、采用喷雾干燥，得到所述半乳甘露聚糖的糖干粉。

实施例3

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)于500L酶解罐中加入400L的pH值为6.2的蒸馏水，加入中性甘露聚糖酶，使所述中性甘露聚糖酶溶液的用量为每1g所述植物胶1000U；向所述中性甘露聚糖酶溶液中加入所述植物胶，本实施例中，所述植物胶为瓜尔胶，用量为40kg。经酶解反应后，得到酶解液；所述酶解反应的反应温度为50℃，反应时间为8h；然后，将所述酶解液置于超高温灭菌设备UHT中,进行杀菌灭活。

(2)将步骤(1)中得到的所述酶解液进行离心，得到离心液与离心沉淀物；

(3)将步骤(2)中的所述离心液采用中空纤维膜进行过滤，过滤的温度为40℃；过滤的进料压力为0.3Mpa，出料压力为0.3Mpa；所述中空纤维膜的膜组件为卷式或者管式膜组件；所述中空纤维膜为聚醚砜膜。所述中空纤维膜为截留分子量为200kDa的中空纤维膜，经截留，得到分子量大于200kDa的离心液、分子量小于200kDa的离心液。

(4)将步骤(2)中的所述离心沉淀物与步骤(3)中分子量大于200kDa的离心液共同干燥，并将步骤(3)中分子量小于200kDa的离心液脱色浓缩、采用喷雾干燥，得到所述半乳甘露聚糖的糖干粉。

实施例4

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，与实施例1中的方法相同，区别仅在于：将刺槐豆胶替换为胡芦巴胶。

实施例5

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，与实施例1中的方法相同，区别仅在于：将刺槐豆胶替换为塔拉胶。

实施例6

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，与实施例1中的方法相同，区别仅在于：将所述中空纤维膜替换为聚苯乙烯膜与醋酸纤维膜的复合膜。

实施例7

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，与实施例1中的方法相同，区别仅在于：将所述中空纤维膜替换为聚苯乙烯膜、醋酸纤维膜、聚醚砜膜的复合膜。

实施例8

本实施例所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，与实施例1中的方法相同，区别仅在于：将所述中空纤维膜替换为聚砜膜、聚酰胺膜的复合膜。效果试验例

为验证本发明的半乳甘露聚糖的分离纯化方法的技术效果，采用如下方法进行实验：

分别按照实施例1-8中的方法进行半乳甘露聚糖的分离纯化，将得到的半乳甘露聚糖的糖干粉进行称重，计算产品收率，并检测产品的纯度。结果见下表。

上述实验得到的实验结果如下：

组别	产品收率	产品纯度
			实施例1	82.3％	90.3％
实施例2	80.1％	95.2％
			实施例3	79.6％	92.1％
实施例4	82.1％	98.1％
			实施例5	81.9％	91.7％
实施例6	82.1％	93.0％
			实施例7	91.5％	99.1％
实施例8	80.0％	87.2％

由此可见，本发明所述的半乳甘露聚糖的分离纯化方法，能有效去除杂质，降低有效成分损失，半乳甘露聚糖的损失率≤10％；产品纯度可达到99％以上，多糖得率高，相较于传统分离纯化方法，产品收率可提高20-50％，最高可达到91.5％；避免传统沸水浴进行灭酶，降低成本。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。