阅读说明：本技术 混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂及其制备方法和应用 (Suspension artemisia rupestris total flavone nano inclusion preparation and preparation method and application thereof ) 是由 哈木拉提·哈斯木 王涛 胡梦颖 谭为 徐磊 孙玉华 顾政一 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物提取物及其制备方法技术领域,是一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂及其制备方法和应用,前者按照下述步骤得到：粉碎的一枝蒿与乙醇溶液混合、回流提取并过滤,将过滤液减压回收、浓缩得一枝蒿浸膏,用聚酰胺柱纯化,得到一枝蒿总黄酮部位提取物,并进行纳米饱和,得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂。本发明制备方法简便、易操作,得到的混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂通过体外抗乙肝病毒,证实在抗乙肝病毒作用方面具有活性,从而为混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面提供了新的途径。(The invention relates to the technical field of plant extracts and preparation methods thereof, in particular to a suspension artemisia rupestris total flavone nano inclusion preparation and a preparation method and application thereof, wherein the suspension artemisia rupestris total flavone nano inclusion preparation is obtained according to the following steps: mixing the pulverized herba Achillea Wilsonianae with ethanol solution, reflux extracting, filtering, recovering filtrate under reduced pressure, concentrating to obtain herba Achillea Wilsonianae extract, purifying with polyamide column to obtain herba Achillea Wilsonianae total flavone extract, and performing nanometer saturation to obtain suspension herba Achillea Wilsonianae total flavone nanometer inclusion preparation. The preparation method is simple and convenient and easy to operate, and the obtained suspension artemisia rupestris total flavone nano inclusion preparation proves to have activity in the aspect of anti-hepatitis B virus effect through in vitro anti-hepatitis B virus, so that a new way is provided for the suspension artemisia rupestris total flavone nano inclusion preparation in the aspect of preparing anti-hepatitis B virus medicines.)

混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物提取物及其制备方法技术领域，是一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂及其制备方法和应用。

背景技术

新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)为菊科(Compositae)蒿属(ArtemisiaL.) 植物，为新疆地产药材。主要分布于新疆，中亚、欧州等地亦有分布。新疆主要分布沿天山山脉及阿尔泰山脉等地，一般生长在海拔1600至3000m的亚高山草原、针叶林开阔地。新疆一枝蒿性寒，味辛苦，具有清热退烧，消炎止痛，凉血解毒等功能，主治热性或胆液质性或血液质性疾病。新疆一枝蒿具有较高的药用价值，民间多采用全草入药，具有抗过敏、抗氧化、抗病毒、保肝降酶、诱导癌细胞凋亡、免疫调节多方面的作用。

化学成分研究表明，新疆一枝蒿全草含酮酸类、黄酮类、挥发油类、生物碱类、氨基酸类、内酯类等多种化学成分。对新疆一枝蒿化学成分研究采用了现代提取分离技术，首次从自然界得到倍半萜类化合物，并命名为一枝蒿酮酸和异一枝蒿酮酸；对新疆一枝蒿的抗病毒有效成分进行了系统的化学成分研究，分离得到了27个化合物。另有文献报道从新疆一枝蒿中分离得到紫花牡荆素、木犀草素、β-谷甾醇与胡萝卜苷和2 -苯氧基色原酮。

从新疆一枝蒿全草中分离得到了27个化合物，分别为一枝蒿酮酸(rupestonicacid，1)，金腰素乙(chrysosplenetin B，2)，洋艾素(artemetin，3)，7-甲氧基香豆素(herniarin，4)，异山柰甲黄素(isokaempferide，5)，香草酸(vanillic acid，6)，山柰素-3,3',4'-三甲醚(kaempferol 3,3',4'-trimethyl ether，7)，岳桦素(ermanine，8)，洋槐苷(Robinin，9)，槲皮素(Quercetin，10)，蒙花苷(linearin，11)，木犀草素(Luteolin，12)，蔗糖(13)，田蓟苷(tilianin，14)，木犀草素-7-O-葡萄糖苷(glucoteolin，15)，阿魏酸-4'-O-葡萄糖苷(β-D-3'-methoxy-4'-O- P-coumaroylglucoside，16)，甲基香豆酸乙酯 [3-(4- methoxyphenyl) -(E)-2- propenoic acid ethyl ester，17]，芦丁(18)，6-去甲氧基-4′-O-甲基茵陈色原酮-7-O-[ 6″-乙酰氧基) -β-D-葡萄糖苷 ( 6-demethox y-4′-O-methy lcapillarisin -7-O-( 6″-aceto xy ) -β-D-glucopyranoside,19] ,木犀草素-3-O-β- D-***糖苷(1uteolin-7-O-β-D-araboside,20),刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖苷(acacetin-7- O-β-D-glucopy ranoside,21),对羟基苯甲酸( p-hydroxybenzoic acid，22),胡萝卜苷( daucosterol, 23),花旗松素(taxifolin，24)，3-O-甲基花旗松素(3-O-methyltaxifolin，25)，陆地棉苷(Hirsutine，26),阿魏酸（27）。我们对挥发油中的成分也作过专门检测，共检测到39种成分并确证了其中的18种成分的结构及含量。

我们前期在化学分析的基础上比较了26个新疆一枝蒿不同提取物抗甲型流感病毒作用，结果发现4个新疆一枝蒿的提取物对流感病毒的抑制率达到了50％以上；并且对一枝蒿提取物酮酸类及黄酮类进行深入研究，发现其对呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒(PIV)的体外作用非常明显，说明新疆一枝蒿提取物对流感病毒、RSV及PIV都具有抑制作用。我们进一步的研究实验发现新疆一枝蒿提取物对甲、乙型流感病毒的IC50分别为118.88、136.88μg/ml，治疗指数为6.4、5.6；可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率；可明显抑制肺指数值，抑制率分别为27.93%、19.30%。

发明内容

本发明提供了一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其为一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面提供了新的途径。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂，按照下述步骤得到：第一步，取所需量的一枝蒿粉碎后与体积百分比为50%的乙醇溶液后混合均匀，得到第一混合溶液，其中，每1g的一枝蒿中加入10mL乙醇溶液；第二步，将第一混合溶液回流提取2次，每次回流提取时间为1小时至2小时，合并回流提取液并过滤，得到过滤液，再将过滤液减压回收、浓缩得到一枝蒿浸膏，其中，一枝蒿浸膏的相对密度为1.20至1.30；第三步，取一枝蒿浸膏分散于水中，得到第一混悬液，将第一混悬液中的上清液加入聚酰胺柱内，第一混悬液中剩余的一枝蒿浸膏颗粒继续加水至稀释后再次加入聚酰胺柱内，重复一枝蒿浸膏颗粒加水稀释后加入聚酰胺柱内的步骤，直至一枝蒿浸膏颗粒全部稀释加完，再依次向聚酰胺柱内加水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱后，收集50%乙醇洗脱液并浓缩干燥，得到一枝蒿总黄酮提取部位；第四步，将一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合溶解后，滴加至聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中并不断搅拌，得到第二混合溶液，其中，每3 mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中加入90 mg一枝蒿总黄酮提取部位；第五步，将第二混合溶液加入至20mL 1%的聚乙烯醇溶液并搅拌15h至20h后除去丙酮后，得到第二混悬液，第二混悬液离心后得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述第四步中，容器中的残留的一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合液，再用80%甲醇冲洗2次，冲洗液并入聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中；或/和，第五步中，容器中的残留的第二混合溶液用丙酮冲洗两次，冲洗液并入聚乙烯醇溶液中。

上述第二步中，过滤液减压回收、浓缩时，温度为45℃至60℃，压力为-0.08MPa至-0.10MPa；或/和，第三步中，洗脱液浓缩干燥时，温度为45℃至60℃。

上述聚酰胺柱内聚酰胺粉粒度为30目至60目。

上述第五步中，第二混悬液离心温度为15℃至25℃，离心转速为5000 rpm/10min。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，取所需量的一枝蒿粉碎后与体积百分比为50%的乙醇溶液后混合均匀，得到第一混合溶液，其中，每1g的一枝蒿中加入10mL乙醇溶液；第二步，将第一混合溶液回流提取2次，每次回流提取时间为1小时至2小时，合并回流提取液并过滤，得到过滤液，再将过滤液减压回收、浓缩得到一枝蒿浸膏，其中，一枝蒿浸膏的相对密度为1.20至1.30；第三步，取一枝蒿浸膏分散于水中，得到第一混悬液，将第一混悬液中的上清液加入聚酰胺柱内，第一混悬液中剩余的一枝蒿浸膏颗粒继续加水至稀释后再次加入聚酰胺柱内，重复一枝蒿浸膏颗粒加水稀释后加入聚酰胺柱内的步骤，直至一枝蒿浸膏颗粒全部稀释加完，再依次向聚酰胺柱内加水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱后，收集50%乙醇洗脱液并浓缩干燥，得到一枝蒿总黄酮提取部位；第四步，将一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合溶解后，滴加至聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中并不断搅拌，得到第二混合溶液，其中，每3 mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中加入90 mg一枝蒿总黄酮提取部位；第五步，将第二混合溶液加入至20mL 1%的聚乙烯醇溶液并搅拌15h至20h后除去丙酮后，得到第二混悬液，第二混悬液离心后得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述第四步中，容器中的残留的一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合液，再用80%甲醇冲洗2次，冲洗液并入聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中；或/和，第五步中，容器中的残留的第二混合溶液用丙酮冲洗两次，冲洗液并入聚乙烯醇溶液中。

上述第二步中，过滤液减压回收、浓缩时，温度为45℃至60℃，压力为-0.08MPa至-0.10MPa；或/和，第三步中，洗脱液浓缩干燥时，温度为45℃至60℃。

上述聚酰胺柱内聚酰胺粉粒度为30目至60目。

上述第五步中，第二混悬液离心温度为15℃至25℃，离心转速为5000 rpm/10min。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面的应用。

本发明制备方法简便、易操作，得到的混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂通过体外抗乙肝病毒，证实在抗乙肝病毒作用方面具有活性，从而为混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面提供了新的途径。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂，按照下述步骤得到：第一步，取所需量的一枝蒿粉碎后与体积百分比为50%的乙醇溶液后混合均匀，得到第一混合溶液，其中，每1g的一枝蒿中加入10mL乙醇溶液；第二步，将第一混合溶液回流提取2次，每次回流提取时间为1小时至2小时，合并回流提取液并过滤，得到过滤液，再将过滤液减压回收、浓缩得到一枝蒿浸膏，其中，一枝蒿浸膏的相对密度为1.20至1.30；第三步，取一枝蒿浸膏分散于水中，得到第一混悬液，将第一混悬液中的上清液加入聚酰胺柱内，第一混悬液中剩余的一枝蒿浸膏颗粒继续加水至稀释后再次加入聚酰胺柱内，重复一枝蒿浸膏颗粒加水稀释后加入聚酰胺柱内的步骤，直至一枝蒿浸膏颗粒全部稀释加完，再依次向聚酰胺柱内加水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱后，收集50%乙醇洗脱液并浓缩干燥，得到一枝蒿总黄酮提取部位；第四步，将一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合溶解后，滴加至聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中并不断搅拌，得到第二混合溶液，其中，每3 mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中加入90 mg一枝蒿总黄酮提取部位；第五步，将第二混合溶液加入至20mL 1%的聚乙烯醇溶液并搅拌15h至20h后除去丙酮后，得到第二混悬液，第二混悬液离心后得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂。

实施例2：作为上述实施例的优化，第四步中，容器中的残留的一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合液，再用80%甲醇冲洗2次，冲洗液并入聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中；或/和，第五步中，容器中的残留的第二混合溶液用丙酮冲洗两次，冲洗液并入聚乙烯醇溶液中。

实施例3：作为上述实施例的优化，第二步中，过滤液减压回收、浓缩时，温度为45℃至60℃，压力为-0.08MPa至-0.10MPa；或/和，第三步中，洗脱液浓缩干燥时，温度为45℃至60℃。

实施例4：作为上述实施例的优化，聚酰胺柱内聚酰胺粉粒度为30目至60目。

实施例5：作为上述实施例的优化，第五步中，第二混悬液离心温度为15℃至25℃，离心转速为5000 rpm/10 min。

实施例6：混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂的制备方法，按照下述步骤进行：第一步，取所需量的一枝蒿粉碎后与体积百分比为50%的乙醇溶液后混合均匀，得到第一混合溶液，其中，每1g的一枝蒿中加入10mL乙醇溶液；第二步，将第一混合溶液回流提取2次，每次回流提取时间为1小时至2小时，合并回流提取液并过滤，得到过滤液，再将过滤液减压回收、浓缩得到一枝蒿浸膏，其中，一枝蒿浸膏的相对密度为1.20至1.30；第三步，取一枝蒿浸膏分散于水中，得到第一混悬液，将第一混悬液中的上清液加入聚酰胺柱内，第一混悬液中剩余的一枝蒿浸膏颗粒继续加水至稀释后再次加入聚酰胺柱内，重复一枝蒿浸膏颗粒加水稀释后加入聚酰胺柱内的步骤，直至一枝蒿浸膏颗粒全部稀释加完，再依次向聚酰胺柱内加水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱后，收集50%乙醇洗脱液并浓缩干燥，得到一枝蒿总黄酮提取部位；第四步，将一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合溶解后，滴加至聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中并不断搅拌，得到第二混合溶液，其中，每3 mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中加入90 mg一枝蒿总黄酮提取部位；第五步，将第二混合溶液加入至20mL 1%的聚乙烯醇溶液并搅拌15h至20h后除去丙酮后，得到第二混悬液，第二混悬液离心后得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂。

实施例7：该混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面的应用。

实施例8：该混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂，按照下述步骤得到：第一步，取所需量的一枝蒿粉碎后与体积百分比为50%的乙醇溶液后混合均匀，得到第一混合溶液，其中，每1g的一枝蒿中加入10mL乙醇溶液；第二步，将第一混合溶液回流提取2次，每次回流提取时间为1小时，合并回流提取液并过滤，得到过滤液，再将过滤液减压回收、浓缩得到一枝蒿浸膏，其中，一枝蒿浸膏的相对密度为1.20；第三步，取一枝蒿浸膏分散于水中，得到第一混悬液，将第一混悬液中的上清液加入聚酰胺柱内，第一混悬液中剩余的一枝蒿浸膏颗粒继续加水至稀释后再次加入聚酰胺柱内，重复一枝蒿浸膏颗粒加水稀释后加入聚酰胺柱内的步骤，直至一枝蒿浸膏颗粒全部稀释加完，再依次向聚酰胺柱内加水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇进行洗脱后，收集50%乙醇洗脱液并浓缩干燥，得到一枝蒿总黄酮提取部位；第四步，将一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合溶解后，滴加至聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中并不断搅拌，得到第二混合溶液，其中，每3 mL聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中加入90 mg一枝蒿总黄酮提取部位；第五步，将第二混合溶液加入至20mL1%的聚乙烯醇溶液并搅拌18h后除去丙酮后，得到第二混悬液，第二混悬液离心后得到混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂，其中，第四步中，容器中的残留的一枝蒿总黄酮提取部位与80%甲醇溶液混合液，再用80%甲醇冲洗2次，冲洗液并入聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒丙酮溶液中，第五步中，容器中的残留的第二混合溶液用丙酮冲洗两次，冲洗液并入聚乙烯醇溶液中，第二步中，过滤液减压回收、浓缩时，温度为45℃，压力为-0.08MPa，第三步中，洗脱液浓缩干燥时，温度为45℃，聚酰胺柱内聚酰胺粉粒度为30目，第五步中，第二混悬液离心温度为15℃，离心转速为5000 rpm/10 min。

根据本发明中实施例8得到的混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂进行抗乙肝病毒药效学实验：

1. HepG2.2.15细胞培养

1.1细胞复苏

取出HepG2.2.15细胞冻存管，置于37℃水浴中，快速摇动直至其完全溶解。将完全溶解后的细胞液移入无菌离心管中，加入5ml细胞培养液，轻轻吹打使之混匀，于1000rpm，离心5min，弃上清，如此反复用培养液洗涤3次。将洗涤后的HepG2.2.15细胞接种于培养瓶内，加入适量的培养液（200μg/ml G418），于37℃、5%CO2条件下培养。

细胞传代

待培养瓶内的HepG2.2.15细胞覆盖到瓶底75%以上时即可传代。弃掉瓶中的DMEM，加入2ml PBS，轻轻晃动瓶底，尽量洗去残余血清。反复操作两次，弃液。加入含0.25%胰蛋白酶的消化液1ml，使之与细胞充分接触，盖上瓶塞，平放于37℃孵箱中，作用约1分钟，当细胞层肉眼能见到变成淡白色或显微镜下细胞面出现针尖样小孔时，弃掉消化液。轻轻拍打培养瓶，使细胞脱落。加入2-3mlDMEM用吸管沿瓶壁吹打，使消化下的细胞充分混匀。将含有HepG2.2.15细胞的DMEM平均分入两个培养瓶中。分别将培养瓶放平，标记好细胞名称、代数、传代日期及实验者，静置于37℃孵箱中培养。

细胞HBV标志物分泌的动态测定

培养HepG2.2.15细胞，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液稀释至约1105/ml后，接种于24孔培养板内，待细胞长成单层。

于HepG2.2.15细胞培养的第3天，第5天，第7天，第9天，第11天分别收取细胞上清液，通过ELISA法检测上清中的HBsAg和HBeAg，酶标仪在450nm波长下测定每个孔的OD值，用实时荧光定量PCR法测定HBV DNA分泌情况。

一枝蒿总黄酮纳米包合制剂对HepG2.2.15细胞毒性作用（TC50、TC0）

通过检测CCK-8确定混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂、拉米夫定和一枝蒿总黄酮原制剂对于增殖的HepG2.2.15细胞所产生的细胞毒性作用。HepG2.2.15细胞铺于96孔板中（1×10⁶个细胞/孔），37℃，5%CO2孵箱培养过夜。加入不同浓度（0.025mg.ml^-1至0.8mg.ml^-1）的混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂，每个浓度分别加4个孔，同时设置拉米夫定（0.015625mg.ml^-1至0.5mg.ml^-1）和一枝蒿总黄酮原制剂（0.015625mg.ml^-1至0.5mg.ml^-1）阳性对照药物孔、正常细胞对照孔，37℃，5% CO2孵箱培养72小时之后，一枝蒿总黄酮纳米包合制剂和对照药物的细胞毒性测定按照CCK-8检测实验说明进行。每孔加入10ul CCK-8试剂，继续培养1h后终止培养，在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值。对相关数据得出的剂量曲线进行相关分析可以计算出对50%细胞产生毒性作用的药物浓度（TC50）和最大无毒浓度（TC0）。

抑制百分数（%）×100%=（正常细胞对照孔OD值-实验孔OD值）/正常细胞对照孔OD值×100%

4. 混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制作用

4.1混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用

取培养状态良好的HepG2.2.15细胞，加入胰蛋白酶，37℃消化，加培养液吹打，用培养液稀释至约1105/ml后，分别接种于24孔板，每孔1ml。37℃、5%CO2条件下培养，细胞生长至汇合时实验组加入不同浓度的药物。待测药物混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂最大无毒浓度连续两个2倍递比稀释浓度，每个浓度4个复孔培养，对照药拉米夫定和混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂最大无毒浓度组，从给药第3d起，每隔1d，更换等体积的各种药物并维持药物浓度不变，加药后第7天分别于各孔中吸取1000ul上清液于EP管中，同时补充同等体积的药液，上清置于-70℃保存。

法检测细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量(按照试剂盒说明书步骤进行操作)

抗原抑制率（%）=（正常细胞对照孔OD值-实验孔OD值）/正常细胞对照孔OD值×100%

4.2实时荧光定量 PCR方法检测细胞上清中HBV DNA含量（按照试剂盒说明书操作步骤进行操作）

HBV DNA抑制率（%）=（log对照组HBV DNA量-log实验组HBV DNA量）/log对照组HBV DNA量×100%

5.结果：

5.1. HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律

HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的规律如表1所示，从表1可见，随着培养时间的延长，HepG2.2.15细胞一直表达表面抗原HBsAg，但是HBeAg在培养第3d时相对表达较低，随着培养时间延长HBeAg表达达到平台期。

细胞HBV-DNA分泌规律

HepG2.2.15细胞HBV-DNA分泌规律如表2所示，从表2可见，随着培养时间延长，HepG2.2.15细胞一直产生病毒颗粒，表达HBV-DNA。

药物对HepG2.2.15细胞毒性作用

用回归方程计算混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂对细胞的TC50为1.175mg/ml,结果如表3所示。从表3可见，随着一枝蒿总黄酮纳米包合制剂浓度的增大，对HepG2.2.15细胞毒性也越大，但是在0.2mg/ml以下浓度时，药物对细胞生长抑制作用和正常细胞对照组比较没有统计学差异（p>0.05）。拉米夫定对HepG2.2.15细胞TC50：0.838mg/ml。在0.125mg/ml以下浓度时，药物对细胞生长抑制作用和正常细胞对照组比较没有统计学差异（p>0.05）。混悬液一枝蒿总黄酮原制剂对HepG2.2.15细胞TC50：0.238mg/ml，在浓度为0.015625mg/ml对细胞生长抑制作用和正常细胞对照组比较没有统计学差异（p>0.05）。

药物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响

混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂作用HepG2.2.15细胞7d后，高（0.2mg/ml）、中(0.1mg/ml)、低(0.05mg/ml)三个剂量组对HBsAg都有一定的抑制作用(p<0.05)，抑制率分别为39.37%，34.16%和27.68%；而高（0.2mg/ml）、中剂量组(0.1mg/ml)对HBeAg有抑制作用(p<0.05)，抑制率分别为17.87%和13.32%，结果见表4。

药物对HepG2.2.15细胞分泌HBV-DNA的影响

混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂作用HepG2.2.15细胞7d后，高（0.2mg/ml）、中(0.1mg/ml)两个剂量对HBV-DNA有抑制作用，抑制率分别为15.72%和9.22%，结果见表5。

因此，混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在最大无毒浓度以下，对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA有一定的抑制作用。

综上所述，本发明制备方法简便、易操作，得到的混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂通过体外抗乙肝病毒，证实在抗乙肝病毒作用方面具有活性，从而为混悬液一枝蒿总黄酮纳米包合制剂在制备抗乙肝病毒药物方面提供了新的途径。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。