一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用
阅读说明：本技术 一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用 (Small peptide and application thereof in inhibiting opiate addiction and tolerance ) 是由 周培岚 苏瑞斌 张艺馨 卢凤凤 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及涉及一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用,所述小肽氨基酸序列为:N’-Leu-Lys-Gln-Gln-Val-Lys-Ile-Phe-Glu-Glu-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Arg-Ser-Asp-Arg-Glu-Arg-C’。本发明还提供一种具有抑制阿片成瘾和耐受性的药品,其含有的抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分为上述小肽。本发明明确给出具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分的小肽的氨基酸序列,其中的氨基酸可以由功能类似的同性氨基酸进行替换。本发明提供的小肽及修饰过的短肽,能显著提高阿片的镇痛效果,延长镇痛时间,抑制阿片耐受作用,阿片镇痛耐受被抑制则成瘾性相应的也被抑制。本发明还提出可通过固相合成法人工合成该小肽,使之有望发展成为抗阿片成瘾肽并能批量生产。(The invention relates to a small peptide and application thereof in inhibiting opiate addiction and tolerance, wherein the amino acid sequence of the small peptide is N '-Leu-Lys-Gln-Gln-Val-Lys-Ile-Phe-Glu-Glu-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Arg-Ser-Asp-Arg-Glu-Arg-C'. The invention also provides a medicine for inhibiting opiate addiction and tolerance, which contains the active ingredient for inhibiting opiate addiction and tolerance as the small peptide. The invention specifically provides an amino acid sequence of a small peptide with an active ingredient for inhibiting opiate addiction and tolerance, wherein the amino acid can be replaced by functionally similar homologous amino acid. The small peptide and the modified short peptide provided by the invention can obviously improve the analgesic effect of opium, prolong the analgesic time and inhibit the tolerance of opium, and the addiction is correspondingly inhibited if the analgesic tolerance of opium is inhibited. The invention also provides a method for artificially synthesizing the small peptide by a solid phase synthesis method, so that the small peptide is expected to be developed into the anti-opioid addiction peptide and can be produced in batches.)
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用。
背景技术
阿片类药物具有强悍的镇痛效果，在一些国家被大量滥用，但是阿片类药物容易产生耐受性和依赖性，造成了现在世界瞩目的“阿片药物危机”，此类物质成瘾性强、戒断症状严重、复发率高，目前国内外大多数学者将阿片成瘾称为“药物依赖性脑病”，根治极为困难。
为了阐明阿片成瘾的机制，解决阿片依赖耐受，国内外学者对非阿片受体作用系统和阿片受体作用系统本身进行了大量的研究，并取得了重要进展。比如，现在已知，μ阿片受体(μopioid receptor，MOR)是介导阿片镇痛、成瘾的关键受体，国外研究者筛选得到了一系列MOR相互作用蛋白：丝蛋白A(Filamin A)、Periplakin、PKCI、RGS4和PLD2等等，这些蛋白与阿片受体的相互作用后影响了激动剂对阿片受体的激活效应，进一步提示阿片受体激活后并非完全局限于与公认的G蛋白偶联，可能有更多或者更加特异性的蛋白参与了阿片受体后的调节，ABIN1蛋白有可能是其中之一。ABIN1又名为TNIP1(TNFα-inducedprotein 3(TNFAIP3)-interacting protein 1，TNIP1)，是TNF诱导蛋白3(A20)相互作用蛋白，ABIN1含有两个高度保守的主要功能结构域AHD(ABIN homology domains)和UBAN(Ubiquitin binding in ABIN and NEMO)区域。通过筛选***依赖大鼠脑cDNA文库发现μ阿片受体C末端与ABIN1存在相互作用，ABIN1过表达可抑制μ阿片受体激活、磷酸化、泛素化、内吞及脱敏，ABIN1过表达后，能够下调GRK2、Smurf2和βarrestin2的mRNA水平，这可能是ABIN1抑制MOR磷酸化与内吞的机制之一。ABIN1是μ阿片受体(MOR)的相互作用蛋白，具有两个活性结构域AHD和UBAN。
但是进一步的研究，比如关于究竟ABIN1的什么基团与μ阿片受体存在相互作用？通过什么机制调节？如何将有效的活性基团筛选出来并成功应用于药品还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用，解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提出一种小肽，所述小肽氨基酸序列为:N’-Leu-Lys-Gln-Gln-Val-Lys-Ile-Phe-Glu-Glu-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Arg-Ser-Asp-Arg-Glu-Arg-C’。
进一步，所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸可替换为功能类似的同性氨基酸，具体如下：从N端开始，第1位的Leu替换为Ala、Met、Pro、Val或Ile其中之一，第5位的Val替换为Ala、Met、Pro、Leu或Ile其中之一，第8位的Phe替换为Trp或Tyr，第9位的Glu替换为Asp，第11位的Asp替换为Glu，第15位的Glu替换为Asp，第16位的Arg替换为Lys或His，第18位的Asp替换为Glu。
进一步，本发明提供一种修饰后的短肽，所述短肽由上述小肽与穿膜肽连接而得，所述穿膜肽与所述小肽的N端或C端通过共价键相连。
进一步，所述穿膜肽与所述小肽的N端通过共价键相连。
进一步，所述穿膜肽为TAT,其氨基酸序列为:
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln。
本发明还提供一种具有抑制阿片成瘾和耐受性的药品，其含有的抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分为上述小肽。
进一步，本发明提供一种具有抑制阿片成瘾和耐受性的药品，其含有的抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分为上述修饰后的短肽。
本发明提供的具有抑制阿片成瘾和耐受性的药品，所述药品为注射剂，通过静脉给药或脑室给药。
本发明提供的小肽、修饰后的短肽、具有抑制阿片成瘾和耐受性的药品都应用于抑制阿片成瘾和耐受性。
本发明同时提供上述小肽的人工合成方法，采用固相合成法，其步骤为，先将第一个氨基酸与氨基酸保护剂及树脂结合，然后脱第一个氨基酸保护基，再加缩合试剂与第二个氨基酸结合，同样的操作直到最后一个氨基酸结合上，经HPLC纯化后获得。
本发明的有益效果是：
1、明确给出具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分的小肽的氨基酸序列：现有技术只研究到ABIN1是μ阿片受体(MOR)的相互作用蛋白，具有两个活性结构域AHD和UBAN，但仅用目前的研究成果达不到药品生产的需求。本发明通过将AHD区域切分为4个剪接体AHD1/AHD2/AHD3/AHD4进行研究发现，AHD2的21个氨基酸残基序列是具有抗成瘾性和抗耐受性的活性区域，这一段小肽可通过氢键、盐桥、π-阳离子和疏水作用等相互作用与hMOR1蛋白紧密结合。因此，本发明的技术方案明确给出具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分为一种小肽，其氨基酸序列为N’-Leu-Lys-Gln-Gln-Val-Lys-Ile-Phe-Glu-Glu-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Arg-Ser-Asp-Arg-Glu-Arg-C’，其中的氨基酸可以由功能类似的同性氨基酸进行替换。本发明还提出可通过固相合成法人工合成该小肽，使之有望发展成为抗阿片成瘾肽并能批量生产。
2、给出将上述小肽修饰后的短肽，使之能通过血脑屏障起作用：单纯的肽无论静脉还是脑室给药，很难穿透细胞膜，而且在血液或者组织液很容易被蛋白酶降解，因此尽管获得具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性小肽的氨基酸序列，也不能真正发挥作用。本发明提出将筛选出来的具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性小肽加上穿膜肽，可以进入细胞内发生作用。穿膜肽包括TAT、Angiopep-2、T7等，可以上述活性小肽分别连接来达到透膜效果，本发明实施例中优选TAT，氨基酸序列为N’-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-C’，与上述小肽N端通过共价键连接，获得较好的效果。
3、提出具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分的小肽在药品中使用：以注射剂方式为主，通过静脉和脑室给药。静脉给药方便，将来用于病人依从性好，脑室给药，用药量少，药物在中枢系统浓度高，药效可能会好一些。由于修饰了穿膜肽，通过静脉给药加大剂量也能透过血脑屏障，方便了药品的实际使用操作。
4、提出具有抑制阿片成瘾和耐受性的活性成分的小肽的人工合成方法：本发明提供的活性小肽仅有21个氨基酸,穿膜肽只有十几个氨基酸，总长度不超过40个左右氨基酸，采用人工固相合成法是相对经济的一种方法并可实现批量生产。
5、修饰过的短肽，能显著提高阿片的镇痛效果，延长镇痛时间，抑制阿片耐受，相应的对阿片成瘾具有抑制作用：实施例中显示，TAT-AHD2能显著延长阿片镇痛时间，随着给药时间的延长，H2O加***组和TAT-AHD3加***组的镇痛作用出现下降，即***耐受，而TAT-AHD2预先给药能够明显抑制***的耐受作用，阿片镇痛耐受被抑制则成瘾性相应的也被抑制。
附图说明
图1：ABIN-1及其突变体结构模式图
图2：免疫共沉淀检测ABIN-1及其突变体与MOR相互作用电泳图
图3：免疫共沉淀验证AHD2与MOR的相互作用
图4：免疫共沉淀验证AHD2与β-arrestin2的相互作用
图5：AHD2对激动剂作用后MOR磷酸化的抑制
图6：ABIN-1不同剪接体对激动剂作用后MOR磷酸化的影响
图7：GalaxyPepDock(A)、CABS(B)预测的复合物结构
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：通过免疫共沉淀法研究ABIN1的不同剪接体与MOR相互作用的实验及结果
将ABIN-1结构功能域区分为4个剪接体AHD1-4，其氨基酸序列如下：
AHD1:
Glu-Tyr-Gln-Glu-Lys-Glu-Ile-Gln-Arg-Leu-Asn-Lys-Ala-Leu-Glu-Glu-Ala-Leu-Ser；
AHD2：
Leu-Lys-Gln-Gln-Val-Lys-Ile-Phe-Glu-Glu-Asp-Phe-Gln-Arg-Glu-Arg-Ser-Asp-Arg-Glu-Arg；
AHD3：
Glu-Lys-Lys-Val-Lys-Met-Leu-Glu-Gln-Gln-Arg-Ser-Glu-Leu-Leu-Glu-Val-Asn-Lys-Gln-Trp-Asp-Gln-His-Phe-Arg-Ser-Met-Lys-Gln-Gln-Tyr-Glu-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Leu；
AHD4:
Phe-Glu-Arg-Leu-Val-Lys-Glu-Asn-Ser-Arg-Leu-Lys-Glu-Lys-Met-Gln-Gly-Ile；
以ABIN-1全长为模板结构，通过PCR法构建ABIN-1短截AHD1-4的4个突变体：pcDNA3.1/myc-His-ABIN-1-AHD1-DEL(ABIN-1-AHD1-DEL)、
pcDNA3.1/myc-His-ABIN-1-AHD2-DEL(ABIN-1-AHD2-DEL)、
pcDNA3.1/myc-His-ABIN-1-AHD3-DEL(ABIN-1-AHD3-DEL)、
pcDNA3.1/myc-His-ABIN-1-AHD4-DEL(ABIN-1-AHD4-DEL)表达质粒，其结构模式图如图1所示。
ABIN-1突变体构建方法如下：首先，针对目标区域设计引物，将目标区域从ABIN-1全长中截去，ABIN-1全长剩余两部分，再设计引物将剩余部分对接，而后与pcDNA3.1/myc-His空载体连接，完成ABIN-1突变体质粒构建(如图1所示)。把ABIN-1野生型全长和4个突变体分别与Flag-MOR共同瞬转到HEK293细胞24h后，收取全细胞蛋白后加入Anti-Flag抗体过夜，以免疫沉淀MOR，第二天再加入耦合IgG的磁珠充分与Anti-Flag结合，Anti-Flag与Flag-MOR结合，将MOR带到磁珠上。充分孵育后最后加1×上样缓冲液煮沸，收集蛋白进行western blot验证。若MOR与ABIN-1存在相互作用，则Flag-MOR会与ABIN-1结合，ABIN-1被富集在磁珠上，最终在结果中可以显现ABIN-1的条带。按照上述原理，如下图所示，ABIN-1全长与MOR存在相互作用，证明免疫共沉淀体系可以用于突变体相互作用研究的实验中。
(1)把ABIN-1的4个剪接体和MOR共同转染HEK293细胞后，通过免疫共沉淀研究ABIN-1的4个剪接体与MOR的相互作用，与阴性对照IgG相比较，ABIN-1全长在分别截去AHD1、AHD3、AHD4后仍然与MOR存在相互作用，而截去AHD2后没有富集到ABIN-1条带(图2)，显示把AHD2剪掉后，ABIN-1与MOR没有相互作用了，初步说明AHD2区可能是ABIN-1与MOR相互作用的关键区域。
(2)pCMV-Entry-Flag-MOR和pEGFP-N3-AHD2
(pcDNA3.1-myc-hisB-ABIN-1做对照)共同转染HEK293细胞后，通过免疫共沉淀实验发现AHD2与MOR有相互作用(图3)。用同样的方法进一步研究发现AHD2与β-arrestin2也有相互作用(图4)。
(3)在HEK293细胞，共同转染pCMV-Entry-Flag-MOR和pEGFP-N3-AHD2(pcDNA3.1-myc-hisB-ABIN-1做对照)24小时后，弃培养基，加MOR激动剂DAMGO(10μM)作用10min后，收集全细胞蛋白进行蛋白免疫电泳，用anti-Ser375磷酸化抗体检测MOR的磷酸化水平，从图5可见，AHD2和ABIN-1一致，能够明显抑制DAMGO引起的受体磷酸化。此外，把ABIN-1-AHD1/AHD2/AHD3/AHD4-DEL和MOR共同转染HEK293细胞后，可以观察到AHD3结构域剪切后，和ABIN-1全长一致，对DAMGO引起的磷酸化有明显抑制作用，即AHD3结构域不参与ABIN-1MOR功能的影响。与AHD2结构域类似，AHD1/AHD4结构域剪切后的ABIN-1对DAMGO引起的MOR磷酸化的抑制作用基本消失，和对照载体(vector)相当(图6)，说明AHD1/AHD4结构域虽然不参与MOR相互作用，但参与MOR磷酸化的抑制。AHD3既对MOR磷酸化没有影响，也与MOR没有相互作用，可以做为AHD2的对照肽研究。
实施例2：验证AHD2的抗阿片成瘾及耐受功效，并且确定具有活性功能的氨基酸序列结构
从SWISS-MODEL中获取hMOR1蛋白的三维结构；使用Pep2d预测AHD2的二级结构；使用在线工具GalaxyPepDock和CABS预测hMOR1和AHD2复合物的三维结构，如图7所示，A为GalaxyPepDock预测、B为CABS预测，淡色区域为hMOR1蛋白，深色区域为AHD2，可见hMOR1蛋白由7段α螺旋形成一个较深的口袋，AHD2小肽结合在该口袋中，小肽两端的氨基酸均靠近口袋外部，而不是伸入口袋内部，因此，所预测的蛋白-小肽复合物构象可反映全长hABIN-1的AHD2区域与hMOR1的结合模式。
采用UCSF DOCK 6.9对上述复合物结构进行结合力评分。打分结果(表1)表明，上述蛋白-小肽复合物的Model 1组的Grid Score为负值(Grid Score＝-206.53kcal/mol)，表明AHD2多肽与hMOR1蛋白可发生较强结合(一般认为大于-70kcal/mol则为高强度)；对照的Model 2组的Grid Score为正值，表明两者不能结合。结合对多肽的二级结构预测，对照的Model 2中α螺旋的比例较小，卷曲比例较大，可能这是导致它结合不好的原因之一。
表1分子对接打分情况(单位：kcal/mol)。
进一步分析蛋白-小肽复合物相互作用，发现AHD2在ABIN-1全长(636AA)的位置为Leu462-Asp472，这段残基结合在hMOR1蛋白口袋中，Phe473-Arg482段则贴在口袋外侧的蛋白表面。表2和表3展示了AHD2小肽与hMOR1蛋白的重要相互作用。AHD2小肽中的Glu470、Asp472、Glu476、Arg477、Asp479均与hMOR1蛋白的氨基酸形成盐桥作用，其中Glu470、Asp472、Asp479还参与了氢键的形成。此外AHD2小肽的Gln465、Phe469和Arg475分别与hMOR1蛋白的Arg181、Glu343和Phe349形成氢键。多个氢键和盐桥作用为蛋白与AHD2小肽的结合提供了较强的静电力(Grid_es＝-60.51kcal/mol)。除了静电力方面的贡献，AHD2小肽上Leu462、Val466、Phe469与hMOR1蛋白上多个氨基酸形成疏水作用，其中Phe469还与hMOR1蛋白Arg167形成π-阳离子共轭作用(经测算，芳环中心与胍基氮原子距离为)。疏水作用和π-阳离子共轭作用为小肽结合hMOR1蛋白提供了较强的范德华力(Grid_vdw＝-146.02kcal/mol)。综上所述，AHD2的氨基酸残基通过氢键、盐桥、π-阳离子和疏水作用等相互作用与hMOR1蛋白紧密结合(表2、表3)，是AHD发挥作用的主要活性基团。
表2 hABIN-1AHD2与hMOR1氢键作用氨基酸
表3 hABIN-1AHD2与hMOR1盐桥、π-阳离子共轭及疏水作用氨基酸
实施例3制备TAT修饰的短肽
采用固相合成法合成AHD2，其步骤为，先将第一个氨基酸与氨基酸保护剂及树脂结合，然后脱第一个氨基酸保护基，再加缩合试剂与第二个氨基酸结合，同样的操作直到最后一个氨基酸结合上，经HPLC纯化后获得。选用穿膜肽TAT,其氨基酸序列为:
N’-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Gln-C’，将穿膜肽TAT与所述AHD2小肽的N端通过共价键相连，获得修饰后的短肽TAT-AHD2。
实施例4验证TAT修饰短肽对***急性镇痛作用的影响
C57/B6雄性小鼠，在实验环境中饲养1-2天，随机分为2组，TAT-AHD2给药前用热辐射甩尾仪检测小鼠甩尾的时间(s)，为小鼠的基础痛域，然后分别给予TAT-AHD2(5mg/kg,i.v.)和TAT-AHD2(25μg,i.c.v.),给药后30min,测小鼠的热辐射甩尾时间，通过如下公式计算最大镇痛百分率＝(给药后甩尾时间-基础值)/(8-基础值)*100％，结果见表4，可见TAT-AHD2静脉给药对小鼠痛域没有明显影响，而TAT-AHD2在脑室给药后，痛域虽然有所上调，但个体差异较大，TAT-AHD2本身为MOR相互作用蛋白，主要靠影响MOR功能来发挥作用，所以AHD2自身可能没有明显镇痛作用。
表4 TAT-AHD2不同给药途径给药后对小鼠热辐射甩尾的镇痛作用
TAT-AHD2静脉给药后15min皮下给予***，从表5可见，与对照比较，TAT-AHD2能够明显增强***的镇痛作用，延长***镇痛时间达6小时。同样，TAT-AHD2在脑室给药后，也能明显增强***的镇痛作用，这一作用持续至给药后24小时(表6)。以上结果提示，TAT-AHD2在脑室给药后生物利用度高，维持时间长。
表5 TAT-AHD2(5mg/kg)静脉给药对***(2.5mg/kg,s.c)镇痛作用的影响
注：n＝10,平均值±标准误。**P<0.01，*P<0.05同一时间与溶媒组比较，双因素方差分析。
表6 TAT-AHD2(5nmol)脑室给药对***(2.5mg/kg,s.c)镇痛作用的影响
注：n＝10,平均值±标准误。***P<0.001同一时间与溶媒组比较，双因素方差分析。
C57/B6雌性小鼠，在实验环境中饲养1-2天，随机分为2组，用热板仪55℃测小鼠添后足或跳跃的时间，在给药前先测基础痛阈，然后脑室给予TAT-AHD2(5nmol)，灭菌水做对照，给药后15min后皮下注射***(7.5mg/kg)，***给药后1、2、6h用55℃热板检测小鼠添后足或跳跃的时间，通过如下公式计算最大镇痛百分率＝(给药后添足时间-基础值)/(60-基础值)*100％，从结果(表7)可见，TAT-AHD2也能明显增强***在小鼠热板模型上的镇痛作用。
表7 TAT-AHD2(5nmol,i.c.v)对***(7.5mg/kg,s.c)镇痛作用的影响(55℃热板)
注：n＝10,平均值±标准误。***P<0.001,*P<0.05同一时间与溶媒组比较，双因素方差分析。
实施例5验证TAT修饰短肽对***慢性给药作用的影响
C57/B6小鼠共30只，在实验环境中饲养2-3天，随机分为3组，每天给药两次，上午8:00点开始，在给药前热板(55℃)测定动物基础痛域，随后分别脑室给药2.5微升的灭菌水、TAT-AHD2、TAT-AHD3(对照)，15min后皮下给药***(Mor,10mg/kg),***给药30min测痛域。下午6:00各组动物只给***(10mg/kg)，连续给药及测痛域7天。从表8可见，对照组***(10mg/kg)在第一天给药后，镇痛百分率62.51％，而TAT-AHD2(5nmol/5μl,i.c.v)能够明显增强***的镇痛作用,使镇痛率升至82.53％，为了进一步排除穿模肽对***镇痛作用影响，用TAT-AHD3做对照，可以看到，TAT-AHD3(5nmol/5μl,i.c.v)对***的镇痛作用没有影响。但随着给药时间的延长，H2O加***组和TAT-AHD3加***组的镇痛作用出现下降，即***耐受，而TAT-AHD2预先给药能够明显抑制***的耐受作用。
表8 TAT-AHD2(5nmol/5μl,i.c.v)预先给药抑制***的镇痛耐受
注：n＝10,平均值±标准误。**P<0.01,*P<0.05同一时间与溶媒组或TAT-AHD3组比较，双因素方差分析。
综上可见，在***急性镇痛作用不同模型上，TAT-AHD2无论是脑室给药还是静脉给药，皆能增强***的镇痛作用和延长镇痛时间。在***慢性给药躯体依赖模型上，***联合TAT-AHD2药物组在给药后第1到第7天，较***联合溶媒组及对照肽TAT-AHD3组镇痛作用明显增强,能够明显抑制***的镇痛耐受。TAT-AHD2抑制***的耐受的机制可能与MOR和β-arrestin-2相互作用后对胞内信号通路的影响有密切的相关性。
既然TAT-AHD2能够明显抑制***耐受，理论上就能够抑制阿片成瘾，有关TAT-AHD2对阿片精神依赖影响的实验没有开展。但是ABIN-1全长在中枢过表达后能够明显抑制***的精神依赖行为，AHD2是ABIN-1与MOR相互作用的结构功能域，并且能明显抑制***耐受，所以AHD2对***的精神依赖应该有明显抑制。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。