具体实施方式

以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1重组胶原蛋白的制备

1.确定如下所示的包含重组胶原蛋白的氨基酸序列：

MHHHHHHADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGFEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDLVPRGSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP。

2.构建重组胶原蛋白的表达菌株

合成编码上述1中所述氨基酸序列的核苷酸序列，构建含有该核苷酸序列的表达质粒，通过DNA测序确认质粒成功合成；将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株，将转化成功的阳性克隆菌株加入甘油后，保存于-80度冰箱备用；

3.重组胶原蛋白的制备与纯化

取微量冻存的重组胶原蛋白表达菌株，IPTG诱导培养，利用胰蛋白酶处理后，层析纯化得到重组胶原蛋白，冻干保存，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如下所示：

GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP。

实施例2重组胶原蛋白的检测

1.圆二色谱检测

将实施例1制备的重组胶原蛋白分别溶于PBS缓冲溶液(pH 7.0)、醋酸钠缓冲溶液(pH3.0)和乙二醇中，终浓度均为1mg/mL。利用圆二色谱仪对上述重组胶原蛋白溶液进行光谱扫描，扫描波长为210-260nm，扫描温度为4℃，波长步进为0.5nm，平均时间0.5秒，CD光谱均为三次扫描的平均值。

结果如图1所示，本发明实施例1制备的重组胶原蛋白在220nm左右均具有正峰，符合胶原蛋白的三重螺旋结构特征，为三重螺旋结构的重组胶原蛋白。

2.细胞毒性实验

将完全贴壁生长的HeLa细胞用0.25％胰酶消化，用完全培养液(1％FBS，2％Penicillin–Streptomycin，DMEM培养基)配制成细胞密度为1×10⁵个/mL的细胞悬液。分别移取100μL细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h。吸出完全培养液，在实验组中加入经高糖DMEM培养基稀释的不同浓度的实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mg/ml)，每个浓度设置4个复孔；对照组为向细胞中加入等量未添加重组胶原蛋白的高糖DMEM培养基，空白组为不含细胞的等量DMEM培养基，继续于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养24h。向各组加入CCK-8试剂10μL，细胞培养箱内孵育1-4h，使用酶联免疫检测仪在450nm波长下测各孔吸光度值(OD值)。根据各组的吸光度均值按照如下公式计算细胞存活率：

实验结果如图2所示，加入不同浓度的本发明实施例1制备的重组胶原蛋白后，细胞存活率均为100％以上，无细胞毒性，安全性良好。

3.细胞增殖实验

取生长至培养皿面积70％-80％的人皮肤成纤维细胞(HFF-1)，0.25％胰酶消化，用完全培养液制成细胞密度为1×10⁵个/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。细胞培养24h后，吸出完全培养液。在实验组中加入高糖DMEM培养基稀释的0.1mg/ml的实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(设置4个复孔)；对照组为向细胞中加入等量未添加重组胶原蛋白的高糖DMEM培养基，空白组为不含细胞的等量DMEM培养基，继续于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中分别培养24h、48h、72h和96h。每隔一段时间，向各组加入CCK-8试剂10μL，细胞培养箱内孵育1-4h，使用酶联免疫检测仪在450nm波长下测各孔吸光度值(OD值)。根据各组的吸光度均值按照如下公式计算细胞的相对增殖率(RGR)：

实验结果如图3所示，与空白对照组(100％)相比，加入本发明实施例1制备的重组胶原蛋白的实验组在培养至第24h、48h、72h和96h的细胞相对增殖率均大于100％，且随着时间的增加而呈增加的趋势，表明本发明实施例1制备的重组胶原蛋白可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖。

4.细胞黏附实验

用PBS将本发明实施例1制备的重组胶原蛋白稀释至0.1mg/mL，选用未TC处理的24孔细胞培养板，分别用1％热变性BSA，0.1mg/mL实施例1制备的重组胶原蛋白处理孔板，每孔500μL样品，并于4℃冰箱中孵育24h。将生长至培养皿面积70％-80％的小鼠成纤维细胞(L929)用高糖DMEM培养基制成细胞密度为3×10⁵个/mL的细胞悬液；将24孔板中的液体吸出，每孔加入500μL小鼠成纤维细胞悬液；5h后通过倒置显微镜观察细胞黏附效果。

实验结果如图4所示，在牛血清白蛋白(BSA)中生长的成纤维细胞呈圆形、未铺展的状态，而在重组胶原蛋白中生长的成纤维细胞大多呈铺展、黏附的状态，表明本发明实施例1制备的重组胶原蛋白具有良好的细胞黏附性能。

5.皮肤刺激性实验

(1)实验过程

剃除新西兰白兔背部脊柱两侧背毛，面积约10cm×15cm，再使用脱毛膏涂敷1-2分钟后洗去。脱毛完毕，在背部划分好四个相同面积的区域并用标记笔标记。脱毛24h后，将浸润本实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(1mg/ml)的无纺布(2.5cm×2.5cm)平整贴敷于每只兔子背部皮肤的两个区域，另两个区域作为对照，再用去除药物部分的创可贴固定。4h后，剪去创可贴，移除无纺布，并用温水轻轻擦洗试验部位。去除无纺布1h后，观察各白兔背部的四个实验和对照区域的接触部位是否有红斑或焦痂形成。按照GB/T 16886.10-2005进行评分并记录红斑和焦痂形成：无红斑，0分；极轻微红斑(勉强可见)，1分；清晰红斑，2分；中度红斑，3分；重度红斑(紫红色)至焦痂形成，4分。水肿形成：无水肿，0分；极轻微水肿(勉强可见)，1分；清晰水肿(肿起，不超出区域边缘)，2分；中度水肿(肿起约1mm)，3分；重度水肿(肿起超过1mm，并超出接触区)，4分。两项评分之和为其总分。根据GB/T16886.10-2005对刺激的评价标准评价产品有无刺激性。此外，观察并记录去除无纺布的24h、48h和72h各时间点在接触部位的红斑和水肿情况。

(2)实验结果

皮肤刺激性反应皮肤表观图：去除无纺布后的1h、24h、48h、72h观察各白兔背部的四个实验和对照区域，观察接触部位是否有红斑或焦痂形成，按评分标准进行评分并记录，结果如图5所示，每个时间点实验组兔子的试验部位均无红斑或焦痂形成，与对照部位皮肤状态相近，按评分标准，应记录为0分；也无水肿，与对照部位皮肤状态相近，按评分标准，应记录为0分。

皮肤刺激性反应评分：根据表1所示，含有本实施例1制备的重组胶原蛋白的敷料对于4只新西兰兔的背部皮肤刺激性评分平均分为0分；根据皮肤刺激性强度分级，评分为0分表明皮肤接触局部无异常改变，即无刺激性。

表1皮肤刺激性评分表

综上实验表明，本发明实施例1制备的重组胶原蛋白为三重螺旋结构的重组胶原蛋白，无细胞毒性和刺激性，安全性良好；而且可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖，具有良好的细胞黏附性能。

实施例2紫外损伤皮肤修复实验

(1)实验过程

剃除新西兰白兔背部脊柱两侧背毛，面积约10cm×15cm，再使用脱毛膏涂敷1-2分钟后洗去。脱毛完毕，在背部划分好四个相同面积的区域并用标记笔标记。脱毛24h后，将浸润本实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(1mg/ml)的无纺布(2.5cm×2.5cm)平整贴敷于每只兔子背部皮肤的两个区域，另两个区域作为对照，再用去除药物部分的创可贴固定。4h后，剪去创可贴，移除无纺布，并用温水轻轻擦洗试验部位。去除无纺布1h后，观察各白兔背部的四个实验和对照区域的接触部位是否有红斑或焦痂形成。按照GB/T 16886.10-2005进行评分并记录红斑和焦痂形成：无红斑，0分；极轻微红斑(勉强可见)，1分；清晰红斑，2分；中度红斑，3分；重度红斑(紫红色)至焦痂形成，4分。水肿形成：无水肿，0分；极轻微水肿(勉强可见)，1分；清晰水肿(肿起，不超出区域边缘)，2分；中度水肿(肿起约1mm)，3分；重度水肿(肿起超过1mm，并超出接触区)，4分。两项评分之和为其总分。根据GB/T16886.10-2005对刺激的评价标准评价产品有无刺激性。此外，观察并记录去除无纺布的24h、48h和72h各时间点在接触部位的红斑和水肿情况。

(2)实验结果

皮肤刺激性反应皮肤表观图：去除无纺布后的1h、24h、48h、72h观察各白兔背部的四个实验和对照区域，观察接触部位是否有红斑或焦痂形成，按评分标准进行评分并记录，结果如图5所示，每个时间点实验组兔子的试验部位均无红斑或焦痂形成，与对照部位皮肤状态相近，按评分标准，应记录为0分；也无水肿，与对照部位皮肤状态相近，按评分标准，应记录为0分。

皮肤刺激性反应评分：根据表2所示，含有本实施例1制备的重组胶原蛋白的敷料对于4只新西兰兔的背部皮肤刺激性评分平均分为0分；根据皮肤刺激性强度分级，评分为0分表明皮肤接触局部无异常改变，即无刺激性。

表2皮肤刺激性评分表

综上实验表明，本发明实施例1制备的重组胶原蛋白为三重螺旋结构的重组胶原蛋白，无细胞毒性和刺激性，安全性良好；而且可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖，具有良好的细胞黏附性能。

实施例2紫外损伤皮肤修复实验

1.实验过程

选用30只SPF级的健康成年小鼠，雌性，体重为27±2g。用理发器对小鼠背部进行剃毛，再用脱毛膏进行脱毛，脱毛区域约为2×4cm。对小鼠随机分为6组：空白组、模型组、实验组(实施例1制备的重组胶原蛋白溶液，浓度为1.5mg/ml)、对照组1(市售鱼胶原蛋白溶液，浓度为1.5mg/ml)、对照组2(市售猪胶原蛋白溶液，浓度为1.5mg/ml)，对照组3(市售牛胶原蛋白溶液，胶原蛋白浓度为1.5mg/ml)。其中空白组除脱毛外不做任何处理；模型组不做任何修复处理。

建立无毛小鼠的紫外损伤模型：用连续波长的UVA(波长：320-440nm)和UVB(280-320nm)紫外灯管对模型组和实验组小鼠进行照射，照射剂量用紫外辐照计进行定量，UVA和UVB的照射总量均为100mJ/cm²，可造成小鼠背部皮肤急性皮肤炎症。

处理：照射后1h，分别用本发明实施例1制备重组胶原蛋白溶液、市售鱼胶原蛋白溶液、市售猪胶原蛋白溶液、市售牛胶原蛋白溶液对相应的实验组和对照组小鼠损伤皮肤处进行涂抹处理，剂量为4ml/天。治疗第2天、第4天对小鼠进行脱臼处死并取材背部皮肤，立即将皮肤组织冷冻；取部分采集的皮肤组织，用10％中性甲醛进行固定48h。对固定后的皮肤组织进行取材、浸蜡、脱水、透明、包埋，然后进行石蜡切片，切片厚度为3.5μm。

为了观察小鼠在治疗前后的皮肤组织学差异，对小鼠治疗第2天和第4天的皮肤切片进行了HE染色以观察细胞核和表皮的形态，对皮肤切片进行Masson染色以进行胶原纤维形态变化的观察。

HE染色：对石蜡切片进行脱蜡和脱水处理后进行HE染色，水浸洗后用苏木素染色5-8min，流水冲洗1min；分化液分化1-3s，冲洗1min；返蓝液返蓝30-60s；浸于95％乙醇中醇化1min；醇溶性伊红浸染5-8s；浸于95％乙醇I、II各2-3s；浸于100％乙醇I、II脱水各1min；电吹风吹干；二甲苯透明5-15min；中性树胶封片，室温下晾干，拍照。

Masson染色：对石蜡切片进行脱蜡和脱水处理后进行Masson三色染色，用Weigert铁苏木素染色5-10min，冲洗；分化液分化5-15s，水洗；返蓝液返蓝1-5min，水洗；丽春红品红染色5-10min；弱酸洗1min；磷钼酸溶液洗1-2min；弱酸洗1min；苯胺蓝染色2min；95％的乙醇快速脱水；无水乙醇I、II、III各5-10s；二甲苯I、II、III各1-2min；中性树胶封固。

2.实验结果

2.1小鼠皮肤HE染色结果

空白组小鼠除脱毛外未进行紫外照射及治疗，从图6可以看到，脱毛后第2天时，可观察到空白组小鼠的皮肤表皮层的下层呈波浪状起伏，其中表皮向下生长形成皮突；小鼠背部皮肤较薄，颗粒层和透明层不明显，可见基底层和棘层；真皮主要由乳头层和网织层组成，两者间无明显界限，纤维致密有序，细胞核形态良好，无炎性细胞，附属器形态良好。第4天时，空白组小鼠皮肤附属器从表皮延伸至真皮，真皮层纤维连续，呈有序排列，细胞核形态良好，无炎性细胞，皮下脂肪及网状纤维形态良好。可见，空白组小鼠在第2天及第4天时皮肤整体呈健康状态。

紫外照射后的模型组的小鼠未进行治疗，从图6可以看到，紫外照射第2天的皮肤HE染色结果显示，小鼠皮肤表皮全层受损，局部基底层水肿，局部结构缺失；真皮层血管扩张充血明显，网织层疏松水肿，观察到大量炎性细胞浸润。第4天，小鼠皮肤表皮结构比第二天较完整但水肿增厚，真皮层纤维明显变粗，更加疏松，纤维间基质增多，有大量炎性细胞浸润。可见，在未进行任何治疗的情况下，在紫外光损伤后第四天，小鼠皮肤水肿持续加剧，炎性细胞浸润持续增多，损伤程度加剧。

实验组的小鼠在紫外照射后1h，用本发明实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行涂抹治疗。从图6可以看出，实验组经本发明实施例1制备的重组胶原蛋白溶液治疗第2天后，小鼠表皮层水肿增厚，有炎性细胞浸润；到第4天时，表皮水肿消退，真皮结构完整，胶原纤维紧密排列，附属器及皮下脂肪形态良好。对比模型组可见，本发明实施例1制备的重组胶原蛋白溶液对于紫外光损伤的皮肤修复效果良好，损伤后第四天，小鼠损伤皮肤恢复，与空白组健康小鼠的皮肤形态类似。

对照组1的小鼠在紫外照射后1h，用市售鱼胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图7可以看出，治疗至第2天时小鼠表皮层受损严重，真皮层疏松水肿，炎性细胞浸润，血管充血扩张明显。第4天时，表皮结构较第二天完整但局部基底层水肿，棘层松解，真皮层疏松水肿，纤维变粗，基质增多，附属器数量明显减少，毛囊受损严重，炎性细胞浸润。结果表明，对照组1修复效果不明显。

对照组2的小鼠在紫外照射后1h，用市售牛胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图7可以看到，治疗至第2天时，小鼠表皮损伤明显，结构不完整，部分表皮脱落，真皮层水肿，纤维变粗、断裂，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)，血管扩张充血。第4天时，小鼠皮肤表皮结构较第二天完整但不连续，局部有断裂；真皮层水肿，纤维变粗、断裂更加明显，血管扩张充血；附属器数量明显减少。结果表明，对照组2修复效果不明显。

对照组3的小鼠在紫外照射后1h，用市售猪胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图7可以看到，治疗至第2天时，小鼠表皮层损伤明显，结构不完整，局部基底层受损；真皮疏松水肿，炎性细胞浸润，毛囊受损(纤维鞘萎缩乃至消失)。第4天时，表皮结构较第二天完整但局部缺损，伤及基底层，伴有棘层松解；真皮层疏松水肿，纤维变粗，基质增多；附属器数量明显减少，毛囊受损严重，炎性细胞浸润。结果表明，对照组3修复效果不明显。

可见，本发明实施例1制备的重组胶原蛋白对紫外损伤小鼠皮肤具有显著的修复作用，且修复效果优于市售鱼胶原蛋白、市售牛胶原蛋白、市售猪胶原蛋白。

2.2小鼠皮肤Masson染色结果

空白组的小鼠除脱毛外未进行紫外照射及治疗。从图8可以看到，第2天时，空白组小鼠皮肤真皮乳头层内胶原纤维纤细并交织成网；此外，毛-皮脂腺单位、外泌汗腺、顶泌汗腺均被纤细网状胶原包绕，而血管也是被纤细薄层胶原纤维所环绕；网状层的胶原纤维是真皮最大的组成部分，其间的胶原纤维形成粗大的纤维束，在纵切面上呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间。第4天时，小鼠皮肤真皮层胶原纤维致密连续，附属器数目及形态良好，被胶原纤维围绕；胶原纤维形成较均匀粗大的纤维束，在纵切面上呈轻微的波浪状，在水平面上向各个方向延伸，成纤维细胞散布在胶原纤维之间。可见，空白组小鼠在第2天及第4天时皮肤真皮层胶原纤维、附属器形态良好，呈健康状态。

紫外照射后的模型组的小鼠未进行治疗。如图8所示，紫外照射模型组小鼠第2天皮肤真皮层胶原纤维排列紊乱，胶原纤维明显减少、断裂、破碎、变粗、卷曲扭结、聚集成团；第4天时真皮层胶原纤维更加粗大，聚集成更大的胶原束，真皮层血管充血扩张。可见，在未进行任何治疗的情况下，在紫外光损伤后第四天时，小鼠皮肤胶原纤维损伤持续加剧。

实验组的小鼠在紫外照射后1h，用本发明实施例1制备的重组胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行涂抹治疗。如图8所示，治疗至第2天时，小鼠皮肤真皮层胶原纤维排列紊乱，胶原纤维明显减少、并且发生断裂、破碎、卷曲；第4天时真皮层胶原纤维明显增多，排列致密有序，附属器形态正常，连续的胶原纤维呈轻微的波浪状，成纤维细胞分布在胶原纤维之间。对比模型组，重组胶原蛋白溶液对紫外损伤皮肤真皮层胶原纤维的修复效果良好，胶原纤维恢复到类似空白组的健康状态。

对照组1的小鼠在紫外照射后1h，用市售鱼胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图9可以看出，治疗至第2天时真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭结、聚集，血管充血扩张；第四天时真皮层胶原纤维断裂、聚集成块，排列疏松，炎性细胞浸润。结果表明，对照组1修复效果不明显。

对照组2的小鼠在紫外照射后1h，用市售牛胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图9可以看出，治疗至第2天时，真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭结、聚集，血管扩张充血；第4天时真皮层胶原纤维断裂、聚集成块，排列疏松，血管充血扩张，炎性细胞浸润。结果表明，对照组2修复效果不明显。

对照组3的小鼠在紫外照射后1h，用市售猪胶原蛋白溶液(1.5mg/ml，4ml/天)进行治疗。从图9可以看到，治疗第2天时，真皮层胶原纤维明显减少、断裂、扭曲聚集，炎性细胞浸润；第四天时真皮层胶原纤维断裂、聚集，排列疏松。结果表明，对照组3修复效果不明显。

可见，本发明提供的重组胶原蛋白对紫外损伤小鼠皮肤具有显著的修复作用，且效果优于市售鱼、牛和猪胶原蛋白。

综上所述，本发明提供的重组胶原蛋白对紫外损伤小鼠皮肤具有显著的修复作用，能够促进紫外损伤皮肤真皮层胶原纤维的恢复，且效果显著优于市售的多种胶原蛋白产品。