阅读说明：本技术 一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用 (Fusion protein for resisting African swine fever virus and preparation method and application thereof ) 是由 王学庆 王楠 王嘉轩 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用,属于基因工程技术领域,所述抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白,包括结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白,所述结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白通过连接肽连接；所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ或抗病毒多肽IFN-α；其中猪自身免疫调节剂蛋白能够在病毒侵染的第一时间激活猪体内免疫系统,激活抗病毒反应；抗病毒多肽直接作用于病毒,抑制病毒在体内的复制,破坏病毒结构；二者协同作用,实现非洲猪瘟预防与治疗。本发明提供的预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物具有广谱抗病功能,残留小、无污染、无耐药性、无药物残留等优点,在病毒感染早期使用,防控效果显著。(The invention provides a fusion protein for resisting African swine fever virus, a preparation method and an application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering, wherein the fusion protein for resisting African swine fever virus comprises a structure protective peptide DNBLK1 and an active protein, wherein the structure protective peptide DNBLK1 is connected with the active protein through a connecting peptide; the active protein is pig autoimmune regulator protein INF-gamma or antiviral polypeptide IFN-alpha; wherein the pig autoimmune regulator protein can activate the immune system in the pig body at the first time of virus infection and activate antiviral reaction; the antiviral polypeptide directly acts on the virus, inhibits the replication of the virus in vivo and destroys the virus structure; the two have synergistic effect to realize prevention and treatment of African swine fever. The drug for preventing and/or treating African swine fever provided by the invention has the advantages of broad-spectrum disease resistance, small residue, no pollution, no drug resistance, no drug residue and the like, and is used in the early stage of virus infection, and the prevention and control effect is obvious.)

一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，双链DNA病毒。它是目前唯一的DNA虫媒病毒。至今还没有发现与ASFV血清学相关的病毒。ASFV是一个很复杂的病毒，已被鉴定的结构蛋白有28种，编码的200多种蛋白中，有超过一半功能至今未知，在被感染的巨噬细胞中，已被鉴定出100种以上的病毒诱导蛋白，其中至少50种能与感染猪或康复猪的血清反应，40种能与病毒粒子相结合。ASFV至少有8个血清型，抗原易变异，不产生典型中和抗体，这些都是非洲猪瘟病毒有效疫苗面世的障碍。ASFV对热、腐败、干燥的抵抗力较强。病毒可在56℃的环境下存活2小时、4℃下存活6个月、在干燥的室温环境下可存活2年，而在-20℃下几乎可无限期的存活。在pH值范围为3至10的环境下，病毒十分稳定。且目前对于病毒的免疫保护机制不清楚，ASFV对通过免疫逃逸逃避宿主免疫防御系统，这些都是疫苗的研制待攻克的难题。

基因缺失疫苗、减毒活疫苗是目前疫苗研发的主要方向，但存在安全隐患，且在后续应用上存在一定问题，比如：疫苗免疫与野毒感染的诊断方法的建立，病毒变异甚至恢复毒力，要确保疫苗毒株的安全性、遗传稳定性、免疫原性，基因缺失疫苗及减毒活疫苗需要严格评估程序。

在养殖业中滥用兽药的现象普遍存在，在我国情况尤为严重。滥用兽药的直接后果是导致兽药在动物性食品中的残留，摄入人体后，影响人类的健康。兽药残留已逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点问题。药物残留不仅可以直接对人体产生急慢性毒性作用，引起细菌耐药性的增加，还可以通过环境和食物链的作用间接对人体健康造成潜在危害。而且兽药残留还影响我国养殖业的发展和走向国际市场。细菌对抗生素的耐药率逐年上升，居高不下，而且耐药菌产生之快、传播之迅速、耐药率与耐药水平之高是以前少有的，这样的情况下，就需要使用一些低残留、不产生耐受性的治疗药物。而病毒类流行病的爆发，类似于非洲猪瘟、蓝耳病等，更是抗生素类兽药无法企及治愈控制的。

而蛋白质类药物在使用上存在刺激机体免疫原性，易被循环系统蛋白酶等代谢清除，定位给药困难，性质不稳定，容易高温变性，价格昂贵等应用问题，特别是难以口服应用，口服后经口腔消化系统后，易被胃蛋白酶、胰蛋白酶酶等消化道酶消化降解，丧失活性功能，无法进入血液循环系统，发挥药效。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用；所述抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白包括结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白，所述活性蛋白包括猪自身免疫调节剂蛋白IFN-γ或抗病毒多肽IFN-α；其中猪自身免疫调节剂蛋白能够在病毒侵染的第一时间激活猪体内免疫系统，激活抗病毒反应，为猪自身对抗外来病毒入侵做好应对准备，杀灭病毒；抗病毒多肽直接作用于病毒，抑制病毒在体内的复制，破坏病毒结构；二者协同作用，实现非洲猪瘟预防与治疗。二者皆为蛋白类物质，与猪体内天然抗病毒蛋白结构一致，联合使用具有广谱抗病功能，残留小、无污染、无耐药性、无药物残留等优点，在病毒感染早期使用，防控效果显著。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白，包括结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白，所述结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白通过连接肽连接；所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ或抗病毒多肽IFN-α。

优选的，所述结构保护性肽DNBLK1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ的氨基酸序列如SEQID No.2所示；所述抗病毒多肽的序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，当所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ时，所述融合蛋白为DN-γ，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，当所述活性蛋白为抗病毒多肽IFN-α时，所述融合蛋白为DN-α，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明提供了编码所述的融合蛋白的融合基因，编码所述融合蛋白DN-γ的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，编码所述融合蛋白DN-α的基因的如SEQ ID No.8所示。

本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒的融合基因的表达载体，包括所述的基因和初始载体。

优选的，所述初始载体为载体piczA。

本发明提供了所述的融合蛋白、所述的融合基因、所述的表达载体在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物中的应用。

本发明提供了一种预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物，以所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α为活性成分。

优选的，所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α的质量比为1：(0.5～1.5)。

优选的，所述药物还包括益生菌，所述益生菌包括酵母和芽孢杆菌。

优选的，所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α的总质量与酵母、芽孢杆菌的质量比为1:(80～120):(80～120)。

本发明提供了一种抗非洲病毒的饲料，包括所述的药物和常规猪饲料。

本发明的有益效果：本发明提供的抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白，包括结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白，所述结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白通过连接肽连接；所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ或抗病毒多肽IFN-α。其中猪免疫调节蛋白能够在病毒侵染的第一时间迅速激活猪体内免疫系统活力，激活抗病毒反应，为猪自身对抗外来病毒入侵做好应对准备；所述抗病毒多肽直接作用于病毒，抑制病毒在体内的复制，破坏病毒结构；二者协同作用，能够实现非洲猪瘟预防与治疗。同时所述猪免疫调节蛋白和抗病毒多肽皆为蛋白类物质，与猪体内天然抗病毒蛋白结构一致，联合使用具有广谱抗病功能，残留小、无污染、无耐药性、无药物残留等优点，在病毒感染早期使用，防控效果显著。

本发明提供的预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物，以所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α为活性成分；药物稳定性好、药物副作用低，药物疗效时间长，口服给药对猪刺激小，避免猪接种疫苗后处于应激状态，给病毒可乘之机。

进一步的，本发明所述药物还包括益生菌，同时调节动物肠道健康。

本发明所述药物还可以作为饲料添加剂使用，解决口服给药难题，对病毒引起的常见病及高危流行病防控效果显著。

具体实施方式

本发明提供了一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白，包括结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白，所述结构保护性肽DNBLK1和活性蛋白通过连接肽连接；所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白INF-γ或抗病毒多肽IFN-α。

在本发明中，所述结构保护性肽DNBLK1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：RRRRRRRRHPAEPGSTVTTQNTASQTMS；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：GGGGSGGGGSGGGGS；所述猪自身免疫调节剂蛋白IFN-γ的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：MCDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGFPQEALGGNQVQKAQAMALVHEMLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRAFSSSRNL；所述抗病毒多肽IFN-α的序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

QAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASK。

在本发明中，当所述活性蛋白为猪自身免疫调节剂蛋白IFN-γ时，所述融合蛋白为DN-γ，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：RRRRRRRRHPAEPGSTVTTQNTASQTMSGGGGSGGGGSGGGGSMCDLPQTHSLAHTRALRLLAQMRRISPFSCLDHRRDFGFPQEALGGNQVQKAQAMALVHEMLQQTFQLFSTEGSAAAWDESLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHRLTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRAFSSSRNL。

在本发明中，当所述活性蛋白为抗病毒多肽IFN-α时，所述融合蛋白为DN-α，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：RRRRRRRRHPAEPGSTVTTQNTASQTMSGGGGSGGGGSGGGGSQAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASK。

本发明还提供了编码所述的融合蛋白的融合基因，编码所述融合蛋白DN-γ的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：CGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATCCGGCGGAACCGGGCAGCACCGTGACCACCCAGAACACCGCGAGCCAGACCATGAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCTGCGATCTGCCGCAGACCCATAGCCTGGCGCATACCCGCGCGCTGCGCCTGCTGGCGCAGATGCGCCGCATTAGCCCGTTTAGCTGCCTGGATCATCGCCGCGATTTTGGCTTTCCGCAGGAAGCGCTGGGCGGCAACCAGGTGCAGAAAGCGCAGGCGATGGCGCTGGTGCATGAAATGCTGCAGCAGACCTTTCAGCTGTTTAGCACCGAAGGCAGCGCGGCGGCGTGGGATGAAAGCCTGCTGCATCAGTTTTGCACCGGCCTGGATCAGCAGCTGCGCGATCTGGAAGCGTGCGTGATGCAGGAAGCGGGCCTGGAAGGCACCCCGCTGCTGGAAGAAGATAGCATTCTGGCGGTGCGCAAATATTTTCATCGCCTGACCCTGTATCTGCAGGAAAAAAGCTATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATTGTGCGCGCGGAAGTGATGCGCGCGTTTAGCAGCAGCCGCAACCTG。

编码所述融合蛋白DN-α的基因的如SEQ ID No.8所示，具体如下：

CGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATCCGGCGGAACCGGGCAGCACCGTGACCACCCAGAACACCGCGAGCCAGACCATGAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAACGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAACGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAAACTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAACCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAACGGCAGCAGCGGCAAACTGAACGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAACCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAACGATCTGAGCCCGCGCAGCAACCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA。

本发明还提供了一种抗非洲猪瘟病毒的融合基因的表达载体，包括编码所述的融合蛋白的融合基因和初始载体。在本发明中，所述初始载体为优选为载体piczA。本发明对所述载体piczA的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售的载体piczA即可。在本发明中，所述融合基因优选的克隆于所述载体piczA的EcoRI和XhoI酶切位点之间。

本发明还提供了所述的融合蛋白、所述的融合基因、所述的表达载体在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物中的应用。

本发明还提供了一种预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物，以所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α为活性成分。在本发明中，所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α的质量比优选为1:(0.5～1.5)，更优选为1:1。在本发明中，所述药物优选的还包括益生菌，所述益生菌优选的包括酵母和芽孢杆菌；在本发明中，所述融合蛋白DN-γ和融合蛋白DN-α的总质量与酵母、芽孢杆菌的质量比优选为1:(80～120):(80～120)，更优选为1:(90～110):(90～110)，最优选为1:100:100。在本发明中，所述药物的饲喂剂量优选为每头猪每天饲喂0.8～1.2g，更优选为1.0g。

本发明还提供了一种抗非洲病毒的饲料，包括所述的药物和常规猪饲料。本发明对所述常规饲料没有特殊限定，采用本领域常规的猪饲料即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

DN-α片段的扩增：

(1)以合成的IFN-α全基因序列(SEQ ID No.9所示)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到IFN-α片段：

TGCGATCTGCCGCAGACCCATAGCCTGGCGCATACCCGCGCGCTGCGCCTGCTGGCGCAGATGCGCCGCATTAGCCCGTTTAGCTGCCTGGATCATCGCCGCGATTTTGGCTTTCCGCAGGAAGCGCTGGGCGGCAACCAGGTGCAGAAAGCGCAGGCGATGGCGCTGGTGCATGAAATGCTGCAGCAGACCTTTCAGCTGTTTAGCACCGAAGGCAGCGCGGCGGCGTGGGATGAAAGCCTGCTGCATCAGTTTTGCACCGGCCTGGATCAGCAGCTGCGCGATCTGGAAGCGTGCGTGATGCAGGAAGCGGGCCTGGAAGGCACCCCGCTGCTGGAAGAAGATAGCATTCTGGCGGTGCGCAAATATTTTCATCGCCTGACCCTGTATCTGCAGGAAAAAAGCTATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATTGTGCGCGCGGAAGTGATGCGCGCGTTTAGCAGCAGCCGCAACCTG(SEQ ID No.9)

PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。

PCR反应程序如下：

95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min

IFNα-FW:caaactatgtctatgtgtgacttgccacaaactcac(SEQ ID No.10)

IFNα-Rev：ccgctcgagcaagtttctagaagaagagaaagc(划线部分为XhoI酶切位点)(SEQ ID No.11)

(2)以合成的DNBLK1基因序列(SEQ ID No.12)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到DNBLK1片段：

cgccgccgccgccgccgccgccgccatccggcggaaccgggcagcaccgtgaccacccagaacaccgcgagccagaccatgagc(SEQ ID No.12)

PCR反应体系：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。

PCR反应程序如下：

95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min。

引物DK-Fw-1：

ccggaattcatgagaagaaggagaagaaggagaagacac(划线部分为EcoRI酶切位点)(SEQID No.13)

引物DK-Rev-1：gtggcaagtcacacatagacatagtttgagacgc(SEQ ID No.14)

(3)将上述IFN-α片段和DNBLK1片段等体积混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：

95℃ 2minutes；95℃ 20seconds，50℃ 20seconds，72℃ 30s10个循环；72℃5min。

以步骤3产物为模板，用引物DK-Fw-1和IFNα-Rev进行PCR，得到DN-α融合片段。

PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。

PCR反应程序如下：

95℃ 2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min。

DN-γ片段的扩增

(1)以合成的IFN-γ全基因序列(SEQ ID No.15)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到IFN-γ片段：

CAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAACGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAACGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAAACTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAACCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAACGGCAGCAGCGGCAAACTGAACGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAACCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAACGATCTGAGCCCGCGCAGCAACCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA(SEQ ID No.15)

PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。

PCR反应程序如下：

95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min

IFNγ-FW:caaactatgtctatgcaagctccattcttcaagg(SEQ ID No.16)

IFNγ-Rev：ccgctcgagcaagtttctagaagaagagaaagc(其中划线部分为XhoI酶切位点)(SEQ ID No.17)

(2)以合成的DNBLK1基因序列(SEQ ID No.12)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到DNBLK1片段：

PCR反应程序如下：

95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，10s；72℃，5min

DK-Fw-1：

CCGGAATTCATGAGAAGAAGGAGAAGAAGGAGAAGACAC(其中划线部分为EcoRI酶切位点)(SEQ ID No.13)

DK-Rev-2：gaagaatggagcttgcatagacatagtttgagacgc(SEQ ID No.18)

(3)将上述IFN-γ片段和DNBLK1片段等体积混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：

95℃ 2minutes；95℃ 20seconds，50℃ 20seconds，72℃ 30s；10个循环，72℃5min。

以反应后产物为模板，引物DK-Fw-1和IFNγ-Rev进行PCR，得到DN-γ融合片段。

融合蛋白基因的克隆

将上述步骤中得到的基因片段DN-α、基因片段DN-γ分别连接到载体piczA上获得重组载体，具体步骤如下：将基因片段DN-α、DN-γ和载体piczA分别用EcoRI和XhoI双酶切，酶切后将2个片段分别与酶切后的载体进行连接，连接体系：10xligase buffer 1μl，载体片段1.5μl，基因片段DN-α(或者基因片段DN-γ)6.5μl，T4 DNA ligase 1μl，22℃，连接1h。连接后质粒转化大肠杆菌感受态DH5a。

转化后的大肠杆菌DH5a，涂布于含有100μg/ml zeocin的LB固体培养基平板上，37℃培养16-18h，分别挑选单克隆菌落至含zeocin的LB液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行PCR鉴定及双酶切鉴定。鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确后，提取质粒，SacI酶切使载体线性化。

酵母菌的转化

将10μg线性化后的质粒电转入酵母细胞中，Zeocin抗性平板上筛选阳性株。其中电转入的过程如下：

1.细胞准备：

1)在含5ml YPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30℃过夜。

2)取0.1～0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3～1.5。

3)在4℃，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

4)如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

5)如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。

2.转化：

1)取80μl上述细胞与10μg线性化DNA(溶于5～10ul的TE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。

2)在冰上放置5min。

3)电击参数：电压1.5kV；电容25μF；电阻200。电击时间为4～10msec进行电击。

4)立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。

5)分成200-600μl等份，涂于zeocin抗性平板上。

6)在30℃孵育平板至克隆产生。

融合蛋白的表达

融合蛋白的摇瓶表达

将上述筛选到的阳性菌株在YPD液体培养基中28～30℃培养24h后，按1％比例接种到新鲜的BMGY培养基中，28～30℃震荡培养至OD600达到2～6后，离心收集菌体用BMMY培养基重悬菌体至OD600为1～2，开始诱导，甲醇诱导浓度为1％。28℃培养，每12h补充0.5％体积的甲醇。诱导72h后，收集菌体。离心后菌体加入10％蔗糖冻干。

实施例3

为验证本发明的有益效果，进行以下试验，试验方法及结果如下：

(一)试验动物

某养殖场有一批生猪、1-5胎龄母猪，体重50-200kg，部分出现高热、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、皮肤发绀、厌食、精神沉郁、母猪流产等症状，用多种抗生素及退烧芍药无治疗无效，并短期内大量死亡。症状及剖检确诊为感染非洲猪瘟。

(二)临床试验

将制备得到的含有融合蛋白DN-α和DN-γ的酵母细胞按1:1的质量比混匀；然后按照每1g混合物，加入100g干酵母，100g芽孢杆菌混合均匀，在发病猪场随机选择病猪30头，作为给药组，对猪进行饲喂，按猪体重每百公斤喂食1g，连续喂食10天。另外，随机挑选均重7kg仔猪30头，进行喂养，观察生长情况。随机选择该批病猪20头，正常饲养作为对照组。

(三)试验结果

实验结果见表1。

表1药物治疗效果

实施例4

预防和/或治疗非洲猪瘟病的药物

将制备得到的含有融合蛋白DN-α和DN-γ的酵母细胞按1:1的质量比混匀；然后按照每1g混合物，加入100g干酵母，100g芽孢杆菌混合均匀获得药物，所述药物每头猪每天喂食量为1g，连续喂食10天为一个疗程。

2019年4月初，驻马店某养殖户生猪部分出现高热、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、皮肤发绀、厌食、精神沉郁、母猪流产等症状，用多种抗生素及退烧芍药无治疗无效，并短期内大量死亡。症状及剖检确诊为感染非洲猪瘟。

试用上述药物3天后，猪死亡率开始下降，其他生猪恢复正常采食，连续使用所述药物10日后，猪场再无生猪发病死亡。连续喂食2个疗程，整个猪场已基本达到复产效果。

河南省周口市某养殖场，生猪部分出现高热、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、皮肤发绀、厌食、精神沉郁、母猪流产等症状，用多种抗生素及退烧芍药无治疗无效，并短期内大量死亡；症状及剖检确诊为感染非洲猪瘟。使用前短期内死亡母猪及商品猪302头。2019年1月，对养殖场30头种母猪饲喂上述药物，其中有13头母猪采食差，喂食3天后，清除4头病情严重母猪后，对剩余母猪进行持续喂养，采食基本恢复正常，喂食上述药物5天后，进食量较之前有明显增加。连续喂食10天后，剩余26头母猪全部存活，生长良好。连续服用几个疗程后，种母猪产后体能恢复快，发情期提前。期间，产育仔猪存活率高。

2019年1月，对河南省周口市某养殖场30头商品猪进行喂养，其中9头商品猪进食差，喂食3天后，清除3头病情严重生猪，其他猪基本恢复正常进食，且不再出现新发病猪，喂食5天后，进食量较之前有明显增加。连续喂食10天，期间内，剩余27头生猪生长良好。

2019年1月，对河南省周口市某养殖场30头仔猪进行饲喂，10天后所有仔猪个体活跃，无腹泻及其他病症发生，采食良好，成活率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏芝海生物科技有限公司

<120> 一种抗非洲猪瘟病毒的融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Pro Ala Glu Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser

20 25

<210> 2

<211> 159

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp

20 25 30

His Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln

35 40 45

Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln

50 55 60

Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu

65 70 75 80

Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp

85 90 95

Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu

100 105 110

Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu

115 120 125

Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile

130 135 140

Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu

145 150 155

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 143

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Gln Ala Pro Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn

1 5 10 15

Ala Ser Thr Ser Asp Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile

20 25 30

Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln

35 40 45

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln

50 55 60

Ala Ile Gln Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg

65 70 75 80

Phe Leu Asn Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile

85 90 95

Lys Ile Pro Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu

100 105 110

Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys

115 120 125

Arg Lys Arg Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

130 135 140

<210> 5

<211> 202

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Pro Ala Glu Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Cys Asp Leu Pro

35 40 45

Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln

50 55 60

Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe

65 70 75 80

Gly Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln

85 90 95

Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe

100 105 110

Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu His Gln

115 120 125

Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val

130 135 140

Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser

145 150 155 160

Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln

165 170 175

Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val

180 185 190

Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu

195 200

<210> 6

<211> 186

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Pro Ala Glu Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Pro Phe Phe

35 40 45

Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Asp

50 55 60

Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Asn Trp Lys

65 70 75 80

Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr

85 90 95

Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg Ser

100 105 110

Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu Asn Gly Ser

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Ile Lys Ile Pro Val Asp

130 135 140

Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met

145 150 155 160

Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln

165 170 175

Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

180 185

<210> 7

<211> 603

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgccgccgcc gccgccgccg ccgccatccg gcggaaccgg gcagcaccgt gaccacccag 60

aacaccgcga gccagaccat gagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 120

ggcggcagct gcgatctgcc gcagacccat agcctggcgc atacccgcgc gctgcgcctg 180

ctggcgcaga tgcgccgcat tagcccgttt agctgcctgg atcatcgccg cgattttggc 240

tttccgcagg aagcgctggg cggcaaccag gtgcagaaag cgcaggcgat ggcgctggtg 300

catgaaatgc tgcagcagac ctttcagctg tttagcaccg aaggcagcgc ggcggcgtgg 360

gatgaaagcc tgctgcatca gttttgcacc ggcctggatc agcagctgcg cgatctggaa 420

gcgtgcgtga tgcaggaagc gggcctggaa ggcaccccgc tgctggaaga agatagcatt 480

ctggcggtgc gcaaatattt tcatcgcctg accctgtatc tgcaggaaaa aagctatagc 540

ccgtgcgcgt gggaaattgt gcgcgcggaa gtgatgcgcg cgtttagcag cagccgcaac 600

ctg 603

<210> 8

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cgccgccgcc gccgccgccg ccgccatccg gcggaaccgg gcagcaccgt gaccacccag 60

aacaccgcga gccagaccat gagcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc 120

ggcggcagcc aggcgccgtt ttttaaagaa attaccattc tgaaagatta ttttaacgcg 180

agcaccagcg atgtgccgaa cggcggcccg ctgtttctgg aaattctgaa aaactggaaa 240

gaagaaagcg ataaaaaaat tattcagagc cagattgtga gcttttattt taaatttttt 300

gaaattttta aagataacca ggcgattcag cgcagcatgg atgtgattaa acaggatatg 360

tttcagcgct ttctgaacgg cagcagcggc aaactgaacg attttgaaaa actgattaaa 420

attccggtgg ataacctgca gattcagcgc aaagcgatta gcgaactgat taaagtgatg 480

aacgatctga gcccgcgcag caacctgcgc aaacgcaaac gcagccagac catgtttcag 540

ggccagcgcg cgagcaaa 558

<210> 9

<211> 474

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tgcgatctgc cgcagaccca tagcctggcg catacccgcg cgctgcgcct gctggcgcag 60

atgcgccgca ttagcccgtt tagctgcctg gatcatcgcc gcgattttgg ctttccgcag 120

gaagcgctgg gcggcaacca ggtgcagaaa gcgcaggcga tggcgctggt gcatgaaatg 180

ctgcagcaga cctttcagct gtttagcacc gaaggcagcg cggcggcgtg ggatgaaagc 240

ctgctgcatc agttttgcac cggcctggat cagcagctgc gcgatctgga agcgtgcgtg 300

atgcaggaag cgggcctgga aggcaccccg ctgctggaag aagatagcat tctggcggtg 360

cgcaaatatt ttcatcgcct gaccctgtat ctgcaggaaa aaagctatag cccgtgcgcg 420

tgggaaattg tgcgcgcgga agtgatgcgc gcgtttagca gcagccgcaa cctg 474

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caaactatgt ctatgtgtga cttgccacaa actcac 36

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccgctcgagc aagtttctag aagaagagaa agc 33

<210> 12

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cgccgccgcc gccgccgccg ccgccatccg gcggaaccgg gcagcaccgt gaccacccag 60

aacaccgcga gccagaccat gagc 84

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ccggaattca tgagaagaag gagaagaagg agaagacac 39

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtggcaagtc acacatagac atagtttgag acgc 34

<210> 15

<211> 429

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

caggcgccgt tttttaaaga aattaccatt ctgaaagatt attttaacgc gagcaccagc 60

gatgtgccga acggcggccc gctgtttctg gaaattctga aaaactggaa agaagaaagc 120

gataaaaaaa ttattcagag ccagattgtg agcttttatt ttaaattttt tgaaattttt 180

aaagataacc aggcgattca gcgcagcatg gatgtgatta aacaggatat gtttcagcgc 240

tttctgaacg gcagcagcgg caaactgaac gattttgaaa aactgattaa aattccggtg 300

gataacctgc agattcagcg caaagcgatt agcgaactga ttaaagtgat gaacgatctg 360

agcccgcgca gcaacctgcg caaacgcaaa cgcagccaga ccatgtttca gggccagcgc 420

gcgagcaaa 429

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

caaactatgt ctatgcaagc tccattcttc aagg 34

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ccgctcgagc aagtttctag aagaagagaa agc 33

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gaagaatgga gcttgcatag acatagtttg agacgc 36