阅读说明：本技术 一种生物合成乙醇胺的方法 (Method for biologically synthesizing ethanolamine ) 是由 周丽琴 方培华 王姝凝 杨美雪 邢晨光 刘刚 赵希景 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生物合成乙醇胺的方法,包括如下步骤：(1)在含有能够被酵母菌细胞代谢以促进生长和/或乙醇胺生产的碳源的发酵培养基中发酵培养经活化的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71,获得发酵液；(2)将上述发酵液中加入含丝氨酸的反应缓冲液中,进行反应,获得反应液；(3)将步骤(2)所得的反应液经纯化后,获得乙醇胺。本发明中的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71可用于大规模生物合成乙醇胺,乙醇胺的产量可以达到79g/L或更高。(The invention discloses a method for biologically synthesizing ethanolamine, which comprises the following steps: (1) fermentatively culturing the activated Torulaspora delbrueckii OMK-71 in a fermentation medium containing a carbon source capable of being metabolized by yeast cells to promote growth and/or ethanolamine production to obtain a fermentation broth; (2) adding the fermentation liquor into a reaction buffer solution containing serine for reaction to obtain a reaction solution; (3) and (3) purifying the reaction liquid obtained in the step (2) to obtain the ethanolamine. The Torulaspora delbrueckii OMK-71 in the invention can be used for large-scale biosynthesis of ethanolamine, and the yield of ethanolamine can reach 79g/L or higher.)

一种生物合成乙醇胺的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种生物合成乙醇胺的方法。

背景技术

乙醇胺(Monoethanolamine)，又名2-氨基乙醇、2-羧基乙胺、单乙醇胺、ETA或MEA，是一种无色、粘稠液体，具有氨的气味，其衍生物在自然界中广泛存在，例如磷脂酰乙醇胺，是生物膜的组成部分，尤其是原核生物膜的重要组成部分，其对血液凝结有重要作用；又如棕榈酰乙醇酰胺，是一种信号分子，可对大脑中的CB1受体起作用。其分子式为HOCH₂CH₂NH₂，该分子含有伯胺和伯醇，因此乙醇胺具有吸湿性，并能与水、大多数醇和多元醇混溶。其呈弱碱性，可与酸反应形成酯或盐。

乙醇胺的多种特性使其在工业中应用广泛，是生产洗涤剂、乳化剂、抛光剂、药物、腐蚀抑制剂和化学中间体的不可或缺的原料，具体如下：

乙醇胺可用作个人护理产品、化妆品、地板和瓷砖清洁剂、洗衣洗涤剂等产品中的表面活性剂。在这些类型的产品中，乙醇胺通过溶解油脂和混合其他重要成分来去除皮肤上的污垢和油脂。由于乙醇胺不会散发出强烈刺激性气味，乙醇胺也是染发剂等产品中的常见成分。

由于乙醇胺的乳化性质，乙醇胺还可用于气体处理、化学制造等工业应用。在炼油厂和天然气的气体处理过程中，乙醇胺有助于去除汽油中的污染物，如二氧化碳和硫化氢。乙醇胺可以非常有效地洗涤燃烧的煤、甲烷和沼气排放的二氧化碳。乙醇胺洗涤减少了碳排放，使传统的煤炭和沼气工业更现代、更健康、更具市场价值。化工生产厂在合成氨的过程中，也是利用乙醇胺脱除氨气中的二氧化碳。另外，乙醇胺与氨反应可得到乙二胺，它是常用螯合剂EDTA的前体。

乙醇胺还常用于发电厂的蒸汽循环中的水的碱化，包括具有加压水反应堆的核电厂，是“水的全挥发性处理(AVT)”的关键成分。由于乙醇胺不会因为其挥发性而积聚在蒸汽发生器(锅炉)和裂缝中，而是在整个蒸汽循环中相对均匀地分布，用乙醇胺进行水的碱化可以有效减少金属组分的腐蚀。乙醇胺还可以调节个人护理产品和化妆品的pH值，以防止其在储存过程中降解，增加其使用寿命。

在药物制剂中，乙醇胺主要用于制备乳液和提供缓冲作用。乙醇胺也是一种注射性硬化剂，可作为痔疮的治疗选择。可将2-5mL乙醇胺油酸盐注入痔疮正上方的粘膜中以引起溃疡和粘膜固定，从而防止痔疮从肛管下降。乙醇胺还可以作为塑料增塑剂，可增加塑料的韧性，同时使其更加柔软。

全球范围内，乙醇胺的生产主要集中在北美、欧洲、中国和亚洲(中国以外地区)。2016年，北美生产了64.7万吨乙醇胺，欧洲和中国分别生产了51.1万吨和39.6万吨。同年，北美消费量约占全球总消费量的28.85％，欧洲和中国分别消费了39.4万吨和54.9万吨的乙醇胺。全球消费量也从2012年的181.1万吨增加到2017年的191.9万吨，年增长率为1.17％。2017年全球乙醇胺市场价值为24.6亿美元。

目前，工业上乙醇胺可由氨水与环氧乙烷反应制得，该反应还产生二乙醇胺和三乙醇胺。在自然界，所有细菌和真核细胞均含有膜脂质磷脂酰乙醇胺，当磷酸二酯酶将磷脂酰乙醇胺分解时，就会产生天然的乙醇胺。但迄今为止，大规模生物合成天然乙醇胺仍然不能在工业中实现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物合成乙醇胺的方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的德布尔有孢酵母Torulasporadelbrueckii OMK-71。

本发明的技术方案如下：

一种生物合成乙醇胺的方法，包括如下步骤：

(1)将活化的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71转接至含有能够被酵母菌细胞代谢以促进生长和/或乙醇胺生产的碳源的发酵培养基中进行培养，获得发酵液；该德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71于2019年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20191124；

(2)将上述发酵液加入含丝氨酸的反应缓冲液中，进行反应，获得反应液；

(3)将步骤(2)所得的反应液经纯化后，获得乙醇胺。

在本发明的一个优选实施方案中，所述碳源包括蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甲醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉和纤维二糖。碳源可以在整个培养时间段中提供给酵母菌，或者酵母菌可以在另一种能量例如蛋白质存在下生长一段时间，然后仅在分批补料阶段中提供碳源。

进一步优选的，所述碳源为甘油。

在本发明的一个优选实施方案中，所述含丝氨酸的反应缓冲液的配方为：葡萄糖18-22g/L，丝氨酸1-150g/L，吐温80 90-110mg/L，用磷酸钾缓冲液调节pH至7.1-7.3，使磷酸钾的终浓度为90-110mM。

进一步优选的，所述含丝氨酸的反应缓冲液的配方为：葡萄糖20g/L，丝氨酸145g/L，吐温80 100mg/L，用1M的磷酸钾缓冲液调整pH至7.2，使磷酸钾的终浓度为100mM。

在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方为：80-90％磷酸75-85mL，CaSO₄ 2-4g，K₂SO₄ 50-60g，KOH 10-15g，MgSO₄·7H₂O 40-50g，甘油110-130g，酵母膏10-20g，蛋白胨10-20g，消泡油2-4mL，用纯化水定容至3L。

进一步优选的，所述发酵培养基的配方为：85％磷酸80.1mL，CaSO₄ 2.79g，K₂SO₄54.6g，KOH 12.39g，MgSO₄·7H₂O44.7g，甘油120g，酵母膏15g，蛋白胨15g，消泡油3mL，用纯化水定容至3L。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中的纯化依次经聚丙酰胺絮凝、活性炭脱色、超滤、阳离子交换树脂的吸附与洗脱和真空减压浓缩。

本发明的另一技术方案如下：

一种德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71，于2019年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20191124。

上述德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71在生物合成乙醇胺中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明中的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71可转化丝氨酸生物合成乙醇胺，乙醇胺的产量可以达到79g/L或更高。

2、本发明开发了一条酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71转化丝氨酸生物合成乙醇胺路线，工艺简单，与其他乙醇胺生产方法不同，可以大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中的乙醇胺的高效液相色谱图，证明所得的产物为乙醇胺。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

本发明是基于下述发现，所有细菌和真核细胞均含有膜脂质磷脂酰乙醇胺，当磷酸二酯酶将磷脂酰乙醇胺分解时，就会产生天然的乙醇胺。但是由于乙醇胺对细菌和真核细胞的生长有一定的抑制，一般细菌和真核细胞很难生产高浓度的乙醇胺，即使有生产也随即用于甘油磷脂代谢。

本发明从不同区域的海洋泥床中分离出酵母菌，使用超保真聚合酶链式反应(PCR)技术，扩增各酵母菌的18S核糖体RNA，26S核糖体RNA和内转录间隔区(ITS)并测序。测序得出的目的序列在核苷酸序列数据库上进行查询，使用目的序列作为参比序列在非冗余数据库进行BLAST、相互(reciprocal)BLAST或PSI-BLAST分析，并通过复合诱变育种，优选的通过紫外线和氯化锂对酵母菌进行复合诱变，选育出一株高产乙醇胺的酵母菌以及利用所述酵母菌大规模生物合成天然乙醇胺的方法。所述方法包括下述步骤：提供能够在碳源存在下生产乙醇胺的酵母菌；在碳源存在的情况下，将所述酵母菌进行培养；以及从所述酵母菌或从该酵母菌的培养上清液纯化乙醇胺。

实施例1菌种筛选

(1)细胞悬液的制备

收集在50mL平底锥形瓶中装有10mL的酵母膏胨葡萄糖(YPD)培养基，在28℃和250rpm转速下生长48h的德布尔有孢酵母菌液，通过离心收集到菌液内的菌体，用10mL纯化水冲洗菌体3次，然后用10mL纯化水重悬并置于50mL平底锥形瓶中，用移液枪加入5uL的吐温80，在28℃和250rpm转速下振荡30min，使细胞分散。通过检测OD₆₀₀获知酵母菌种的细胞密度，加入适量的纯化水调整细胞密度至约100万个/mL。

(2)紫外线诱变

吸取10mL、细胞密度约为100万个/mL的酵母菌悬液，分别置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方30cm处进行紫外照射，照射时间为20min。

(3)氯化锂诱变

取紫外诱变后的酵母菌悬液10mL，全部涂布于含0.02％氯化锂诱变剂的YPD琼脂培养基上，用牛皮纸包裹，放入28℃培养箱中培养72h。

(4)酵母菌的筛选

挑选长势良好、单菌落直径比较大的突变株平板划线于YPD琼脂培养基，于28℃恒温培养箱中培养48h。挑约500个酵母菌种突变株，将突变株接种于装有10mL的YPD培养基的50mL平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48h，得到菌液。通过离心收集到菌液内的菌体，重悬菌体于含1g/L丝氨酸的反应缓冲液中。在1h和24h取样，并通过柱前衍生，用高效液相色谱法(HPLC)测定乙醇胺的含量。复合诱变前的酵母菌种作为空白对照。

YPD培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L。

YPD琼脂培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。

含0.02％氯化锂诱变剂的YPD琼脂培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L，氯化锂0.2g/L。

含1g/L丝氨酸的反应缓冲液的配方为：葡萄糖20g/L，丝氨酸1g/L，吐温80(100mg/L)，用1M的磷酸钾缓冲液调整pH至7.2，使磷酸钾缓冲液的终浓度为100mM。

经紫外线和氯化锂复合诱变后，选育出一株可在细胞内积累一定量乙醇胺的德布尔有孢酵母菌，命名为PP1，乙醇胺的产量约为2.4mg/L，参见图1。该诱变德布尔有孢酵母株PP1用甘油保存于零下80℃，且传代5次，乙醇胺产量稳定。

实施例2：德布尔有孢酵母菌株PP1的复筛选

(1)细胞悬液的制备

收集在装有10mL的YPD培养基的50mL平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48h的德布尔有孢酵母菌PP1菌液，通过离心收集到菌液内的菌体，用10mL纯化水冲洗菌体3次，然后用10mL纯化水重悬并置于50mL平底锥形瓶中，用移液枪加入5uL的吐温80，在28℃和250rpm转速下振荡30min，使细胞分散。通过检测OD₆₀₀获知德布尔有孢酵母菌株PP1的细胞密度，加入适量的纯化水调整细胞密度至约100万个/mL。

(2)紫外线诱变

吸取10mL、细胞密度约为100万个/mL的德布尔有孢酵母菌株PP1悬液，置于灭好菌的直径为90mm的培养皿中，培养皿放置在磁力搅拌器的载物台上，打开皿盖，在紫外灯垂直下方30cm处进行紫外照射，照射时间为20min。

(3)氯化锂诱变

取紫外诱变后的德布尔有孢酵母菌株PP1悬液10mL，全部涂布于含0.02％氯化锂诱变剂的YPD琼脂培养基上，用牛皮纸包裹，放入28℃培养箱中培养72h。

(4)德布尔有孢酵母PP1的筛选

挑选500个长势良好、单菌落直径比较大的突变株平板划线于YPD琼脂培养基，于28℃恒温培养箱中培养48h。将突变株接种于装有10mL的YPD培养基的50mL平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48h，得到菌液。通过离心收集到菌液内的菌体，重悬菌体于含1g/L丝氨酸的反应缓冲液中。在1h和24h取样，并通过柱前衍生，用HPLC测定乙醇胺的含量。复筛前的德布尔有孢酵母菌株PP1被包含作为对照。

YPD培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L。

YPD琼脂培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。

含0.02％氯化锂诱变剂的YPD琼脂培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L，氯化锂0.2g/L。

含1g/L丝氨酸的反应缓冲液的配方为：葡萄糖20g/L，丝氨酸1g/L，吐温80(100mg/L)，用1M的磷酸钾缓冲液调整pH至7.2，使磷酸钾的终浓度为100mM。

经上述紫外线和氯化锂复合诱变后，复筛选出一株可在细胞内积累一定量的乙醇胺的德布尔有孢酵母菌，命名为PP2，其可产出约为30.1mg/L的乙醇胺。该诱变德布尔有孢酵母菌株PP2用甘油保存于零下80℃，且传代5次，乙醇胺产量稳定。

对德布尔有孢酵母菌株PP2再次进行紫外线和氯化锂复合诱变，经过多次复合诱变后，最终选育出一株高产乙醇胺的德布尔有孢酵母菌株，命名为Torulasporadelbrueckii OMK-71，其可在平底锥形瓶震荡发酵中生产约为20.2g/L的乙醇胺。该诱变获得的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71用甘油保存于零下80℃，且传代5次，乙醇胺产量稳定。

实施例3：天然乙醇胺的发酵生产

将实施例2获得的德布尔有孢酵母Torulaspora delbrueckii OMK-71接种于装有50mL的YPD培养基的250mL平底锥形瓶中，在28℃和250rpm转速下生长48h来活化菌株，得到一级种子液。以1％的接种量将所得一级种子液转接到装有150mL的YPD培养基的1L平底锥形瓶中，28℃和250rpm转速下生长18h，得到二级种子液。将所得二级种子液100mL接种到3L的发酵培养基中。发酵在5L的小试规模生物反应器中进行，其温度和pH值分别控制在28-30℃和5.0-6.0。在整个运行期间，空气流通速度保持在3L/min，压力维持在0.08Mpa，pH值通过添加氨水来控制，初始搅拌速度是500rpm。

发酵24h后，溶解氧浓度(DO)下降到50％，开始补加甘油，并增加搅拌速度到600rpm，直至检测生物量达到200mg/mL(湿重)，120h后，发酵液的菌体细胞密度达到饱和，OD₆₀₀值最高可达400。

用含145g/L丝氨酸的反应缓冲液稀释发酵液至30L的生物反应器中，其温度、pH值和搅拌速度分别控制在30℃、7.2和200rpm。在整个运行期间，空气流通速度保持在3L/min，压力维持在0.08Mpa。反应7h后，获得反应液，其中乙醇胺的浓度为79g/L。

YPD培养基的配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L。

发酵培养基的配方为：85％磷酸80.1mL，CaSO₄ 2.79g，K₂SO₄ 54.6g，KOH 12.39g，MgSO₄·7H₂O 44.7g，甘油120g，酵母膏15g，蛋白胨15g，消泡油3mL，用纯化水定容至3L。

含145g/L丝氨酸的反应缓冲液的配方为：葡萄糖20g/L，丝氨酸145g/L，吐温80(100mg/L)，用1M的磷酸钾缓冲液调整pH至7.2，使磷酸钾的终浓度为100mM，其余为纯化水。

实施例4：天然乙醇胺的提取

(1)絮凝：取实施例3所得的反应液50L，用盐酸将反应液的pH调至4.0，液体温度30℃，加入阳离子聚丙烯酰胺，使其浓度为10mg/L，搅拌90min，静置6h后离心，去除沉淀，得到清液。

(2)脱色：在上述清液中加入粉末状活性炭，添加量为5g/L，升温至65℃，搅拌脱色60min，过滤除去活性炭，得到脱色液。

(3)超滤：采用超滤膜对脱色液进行超滤，其截留分子量为2000Da，待截留的脱色液剩余5-8L时，再加入纯化水5-10L进行洗涤，洗涤操作3次，合并得到超滤液。

(4)吸附与洗脱：将预处理过的732阳离子交换树脂填入Φ150X 2000mm的柱子，将超滤液以400mL/min的流速上柱，至超滤液完全上柱后，再用pH4.0的70L水洗涤柱子。洗涤后，再用0.2mol/L的氨水以同样的流速进行洗脱，获得富含乙醇胺组分的洗脱液。

(5)浓缩：将洗脱液真空减压浓缩，浓缩温度不高于65℃，得到乙醇胺粗品，纯度为98％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。