阅读说明：本技术 荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途 (Fluorescence detection system, fluorescence biosensor and application thereof ) 是由 周洁 许改霞 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种荧光检测体系,包括：至少两种荧光探针,结合至少两种阿尔兹海默症的生物标志物分子,每种荧光探针标记的荧光分子的发光光谱互不相同；荧光淬灭剂,荧光淬灭剂吸附荧光探针,使荧光分子的荧光淬灭；荧光淬灭剂与结合生物标志物分子的荧光探针解吸附,使荧光分子的荧光恢复。以上述荧光检测体系对阿尔兹海默症的生物标志物分子进行检测,无需使用大型仪器或经过复杂的反应步骤,仅需将荧光检测体系加入目标检测物中,即能实现对阿尔兹海默症的生物标志物分子的快速检测,具有快速、简单、灵敏、高效的优势。本发明还公开了一种荧光生物传感器,包括上述的荧光检测体系,能够为阿尔兹海默症的诊断与筛查提供有效信息。(The invention discloses a fluorescence detection system, comprising: at least two fluorescent probes which are combined with at least two biomarker molecules of Alzheimer's disease, and the luminescence spectra of the fluorescent molecules marked by each fluorescent probe are different from each other; the fluorescence quenching agent absorbs the fluorescent probe to quench the fluorescence of the fluorescent molecule; the fluorescence quencher desorbs the fluorescent probe bound to the biomarker molecule, and the fluorescence of the fluorescent molecule is recovered. The fluorescence detection system is used for detecting the biomarker molecules of the Alzheimer's disease, a large instrument or complex reaction steps are not needed, and the fluorescence detection system is only added into a target detection object, so that the rapid detection of the biomarker molecules of the Alzheimer's disease can be realized, and the advantages of rapidness, simplicity, sensitivity and high efficiency are achieved. The invention also discloses a fluorescence biosensor which comprises the fluorescence detection system and can provide effective information for the diagnosis and screening of the Alzheimer disease.)

荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途

技术领域

本发明涉及生物分子检测领域，具体涉及一种荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途。

背景技术

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)是主要与年龄相关的不可逆转的神经退行性疾病。阿尔兹海默症影响病人的认知和短时记忆功能，随着疾病发展的进行，病人的日常生活能力会逐渐受到影响，最后丧失生活自理的能力。在流行病学方面，阿尔兹海默症随着年龄的增加发病几率会成倍增加。随着世界老龄化趋势的增加，阿尔兹海默症已经成为继肿瘤及心血管疾病之后最为严重的疾病和死亡原因。

由于阿尔兹海默症的潜伏期较长，可达10-20年左右，导致很多患者因为没被及时发现而错失了早期治疗的宝贵时机。该疾病如果可以在较早的阶段被发现并给予有效的治疗，将明显改善患者的健康状况和生活质量，并极大的提高患者的生存率。因此，早期诊断对阿尔兹海默症的治疗和预防具有十分重要的研究意义和应用价值。

现在已有的疾病进程诊断方法包括基于问卷的MMSE打分测试，以及针对 Aβ淀粉样蛋白的神经元成像(neuron imaging)检测，还有一些有创方法比如通过分析脑脊液(CSF)中的相关生物分子(Aβ分子，tau蛋白等)来帮助进行AD的诊断，已有研究认为，通过脑脊液中生物标识物进行AD的诊断准确率较好，但是存在个明显的缺点：费用过高，相比外周血相关的生物组织获取过程较难；获取脑脊液对病人造成的痛苦较大，还有可能留下后遗症。与检测脑脊液中的生物标识物相比，AD患者的外周血容易获取，且不会为患者带来较大的身体与经济负担。因此，检测AD患者的外周血中生物标识物的变化对于AD诊断具有重要的临床应用价值。

MicroRNA(miRNA)是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控，调节生物体生长、发育和凋亡等过程。在医学研究领域，miRNA参与调控多种疾病的发生和发展进程，同时，miRNA基于其调控机制，也有望成为疾病诊断的新生物学标记物。 AD特异血清miRNA的检测可为AD诊断提供强有力的依据。然而在人血清中， miRNA的含量较低，现有的高灵敏miRNA检测技术(Q-PCR、微阵列、高通量测序技术等)多依赖于大型的精密检测设备，检测成本较高，检测步骤繁琐，定量准确性有限，可推广性较差。

因此，如何实现对AD患者血清特异性miRNA的快速、简便、灵敏的定量检测，对于阿尔兹海默症的早期筛查与诊断具有重要意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的阿尔兹海默症的疾病诊断存在检测成本较高、检测步骤繁琐、定量准确性有限的缺陷。

为此，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种荧光检测体系，包括：

至少两种荧光探针，所述至少两条荧光探针结合至少两种阿尔兹海默症的生物标志物分子，每种所述荧光探针标记的荧光分子的发光光谱互不相同；

荧光淬灭剂，所述荧光淬灭剂吸附所述荧光探针，使所述荧光分子的荧光淬灭；所述荧光淬灭剂与结合生物标志物分子的荧光探针解吸附，使所述荧光分子的荧光恢复。

可选的，上述的荧光检测体系，所述荧光探针是具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一所示核苷酸序列的单链DNA探针，所述生物标志物分子是具有SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6任一所示核苷酸序列的miRNA。

进一步可选的，上述的荧光检测体系，所述至少两种荧光探针包括：

第一荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一荧光探针标记的荧光分子为FAM；

第二荧光探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第二荧光探针标记的荧光分子为ROX；

第三荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二荧光探针标记的荧光分子为Cy5；

优选地，所述第一荧光探针的浓度为50nM，所述第二荧光探针的浓度为 50nM，所述第三荧光探针的浓度为100nM。

可选的，上述的荧光检测体系，所述荧光淬灭剂选择石墨烯和氧化石墨烯中的任一种；

优选地，所述荧光淬灭剂为氧化石墨烯；

优选地，所述氧化石墨烯的浓度为200μg/mL。

可选的，上述的荧光检测体系，所述荧光探针与所述荧光淬灭剂的体积比为10∶1。

第二方面，本发明提供了一种荧光生物传感器，所述荧光生物传感器包括上述的荧光检测体系。

上述的荧光检测体系，或者荧光生物传感器在制备用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。

第三方面，本发明提供了一种用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒，所试剂盒包括上述的荧光检测体系，或者上述的荧光生物传感器。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的荧光检测体系，包括：所述至少两条荧光探针结合至少两种阿尔兹海默症的生物标志物分子，且每种所述荧光探针标记的荧光分子的发光光谱互不相同；荧光淬灭剂，所述荧光淬灭剂吸附所述荧光探针，使所述荧光分子的荧光淬灭；所述荧光淬灭剂与结合有生物标志物分子的荧光探针解吸附，使所述荧光分子的荧光恢复。

上述荧光检测体系中，标记有荧光分子的荧光探针作为荧光供体，荧光淬灭剂作为荧光受体，当荧光淬灭剂吸附荧光探针后，两者的距离足够接近，发生荧光共振能量转移(resonance energy transfer，FRET)，荧光供体的能量转移至荧光受体，使荧光探针的荧光分子发生荧光淬灭。而当荧光探针与阿尔兹海默症的生物标志物分子结合后，荧光探针与生物标志物分子结合的复合物与荧光淬灭剂解吸附，使荧光分子的荧光恢复。向荧光检测体系中加入目标检测物后，通过分析荧光检测体系中荧光强度的增强程度，能够实现对阿尔兹海默症相关的目标生物标志物分子的定量检测。上述基于荧光共振能量转移的荧光检测体系具有高灵敏度和选择性。以上述荧光检测体系对阿尔兹海默症的生物标志物分子进行检测，无需使用大型仪器或经过复杂的反应步骤，仅需将荧光检测体系加入目标检测物中，即能实现对阿尔兹海默症的生物标志物分子的快速检测，具有快速、简单、灵敏、高效的优势。

利用上述的荧光检测体系，仅需对AD患者的外周血进行采样，即能实现对阿尔兹海默症的有效检测，检测过程不具有侵入性，能够实现对阿尔兹海默症的无创诊断，有效缓解了患者的痛苦及精神和经济负担。另一方面，由于AD 的致病机理十分复杂，仅仅检测出一种生物标志物分子是不够的。上述荧光检测体系中，每种荧光探针标记的荧光分子的发光光谱互不相同，因此，每种荧光探针均标记有特定发光光谱的荧光分子，利用上述的荧光探针，能够在同一检测体系中实现对至少两种生物标志物分子的检测。通过对多种AD生物标志物分子疾病标志物的联合检测能够提高AD早期诊断的准确性，为阿尔兹海默症的早期诊断、筛查提供有效的临床信息，有利于疾病的早发现、早治疗，有效提高阿尔兹海默症患者的生存质量、提高患者生存率。

2.本发明提供的荧光检测体系，荧光淬灭剂选择石墨烯和氧化石墨烯 (Grapheneocide，GO)中的任一种。石墨烯及氧化石墨烯具有大尺寸的二维芳香平面结构，石墨烯及氧化石墨烯可以作为良好的平台吸附特定的生物分子，由于其大面积的共轭结构，可以作为能量受体淬灭多种有机染料及量子点的荧光，是一种广适性的荧光猝灭剂。与传统的淬灭剂相比，石墨烯材料具有更高的淬灭效率，使FRET传感器具有背景低、信噪比高、可多重检测等显著优点。

本发明提供的荧光检测体系，荧光淬灭剂具体选择氧化石墨烯，氧化石墨烯具有良好的水分散性、优异的生物相容性、较高的稳定性、毒性低、成本低、易于进行表面修饰、易于进行大规模生产、具有远程猝灭效应，吸收光谱范围较广，几乎可以吸收所有的蓝紫光，对大多数荧光染料和量子点的荧光都具有较好的猝灭效应。

3.本发明提供的荧光检测体系，荧光探针是具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一所示核苷酸序列的单链DNA探针，生物标志物分子是具有SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6任一所示核苷酸序列的miRNA。本发明以单链DNA (ssDNA)作为探针，氧化石墨烯片层与单链DNA的碱基之间存在较强的π-π作用力，单链DNA探针可以吸附到氧化石墨烯的表面，使探针上标记的荧光分子发生荧光淬灭。而当荧光检测体系加入目标检测物后，荧光探针的单链 DNA分子与其互补的miRNA发生杂交，得到双链DNA。氧化石墨烯对双链 DNA分子的吸附力弱，双链DNA从氧化石墨烯上解吸附，荧光分子的荧光得到恢复，从而完成对目标生物标志物分子的检测。本发明通过研究发现，具有 SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的miRNA分子在阿尔兹海默症的患病组与健康组之间存在较大的表达差异，为阿尔兹海默症的疾病诊断提供了一种特异性强、准确性高的生物标志物分子。具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3 核苷酸序列的单链DNA探针通过与上述miRNA分子互补结合，实现对miRNA 分子表达水平的高灵敏度检测，进而实现对阿尔兹海默症的无创早期筛查、诊断。

4.本发明提供的荧光检测体系，进一步提供了第一荧光探针、第二荧光探针、第三荧光探针、荧光淬灭剂的浓度，以及荧光探针与荧光淬灭剂的体积比。上述物质组分的荧光检测体系能够实现对三种阿尔兹海默症差异表达miRNA 分子的线性检测，其中第一荧光探针检测的线性范围为10nM-200nM，第二和第三荧光探针检测的线性范围为20nM-200nM，线性度良好。荧光检测体系能够同时对目标检测样本中不同浓度的多种生物标志物分子进行检测，且检测结果准确。

5.本发明提供的荧光生物传感器，包含上述的荧光检测体系，能够实现对对阿尔兹海默症的生物标志物分子的快速检测，具有快速、简单、灵敏、高效的优势，且检测结果准确，有利于阿尔兹海默症的早期筛查与诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针在与氧化石墨烯孵育前、与氧化石墨烯孵育后，以及与氧化石墨烯和miRNA同时孵育后的荧光发射光谱的变化情况；

图2是本发明实验例2中pDNA1-GO混合物与不同浓度的目标miRNA1(0 nM-1000nM)孵育后测得的荧光光谱检测结果图；

图3显示pDNA2-GO混合物与不同浓度的目标miRNA2(0nM-1000nM)孵育后测得的荧光光谱检测结果图；

图4显示pDNA3-GO混合物与不同浓度的目标miRNA3(0nM-1000nM)孵育后测得的荧光光谱检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下述实施例使用的所有试剂均属于分析级。其中氧化石墨烯溶液购于南京先丰纳米科技有限公司。焦碳酸二乙酯(DEPC)购于Amresco(USA)。磷酸缓冲盐粉末(PBS，0.01M，pH7.2，137mM NaCl，2.7mM KCl)购于Solarbio Science&Technology Co.，Ltd.(Beijing，China)。PBS首先使用去离子水稀释，然后使用0.1％DEPC过夜处理。接着PBS溶液高压15-20分钟以去除其中的 DEPC，用于之后的荧光实验。DNA和miRNA序列均在上海生工生物工程股份有限公司(上海)合成。

实施例1

本实施例提供一种荧光检测体系，包括如下成分：

1、第一荧光探针，第一荧光探针是5’端标记荧光分子6-FAM的单链DNA 探针pDNA1，pDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第一荧光探针能够识别并结合阿尔兹海默症的生物标志物分子miRNA1。

2、第二荧光探针，第二荧光探针是5’端标记荧光分子ROX的单链DNA 探针pDNA2，pDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二荧光探针能够识别并结合阿尔兹海默症的生物标志物分子miRNA2。

3、第三荧光探针，第三荧光探针是5’端标记荧光分子Cy5的单链DNA 探针pDNA3，pDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第三荧光探针能够识别并结合阿尔兹海默症的生物标志物分子miRNA3。

4、荧光淬灭剂氧化石墨烯。

荧光检测体系的配制过程如下：第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针使用DEPC水处理的PBS进行配置，取100μl含有50nM pDNA1，50nM pDNA2和100nM pDNA3的溶液I，向溶液I中加入10μl含有200μg/mL的氧化石墨烯的溶液II，室温下孵育5分钟，得到荧光检测体系。

荧光检测体系中的第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针经孵育后，吸附于氧化石墨烯的片层结构上。氧化石墨烯作为荧光淬灭剂，对荧光分子的发射光谱没有要求，能够淬灭多种荧光染料的荧光。因此，当单链DNA 探针吸附于氧化石墨烯上后，发生荧光共振能量转移，单链DNA探针上标记的荧光分子发生荧光淬灭。而上述的荧光检测体系加入到目标检测体系后，第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针的单链DNA分子能够结合 miRNA分子，两者互补杂交形成双链的DNA分子。氧化石墨烯对双链DNA 分子的吸附力较弱，双链DNA分子从氧化石墨烯上解吸附后，荧光分子的荧光恢复。通过检测在加入目标检测体系前后，荧光强度的增强程度，能够实现对生物标志物分子miRNA的定量检测。由于每种荧光探针上标记的荧光分子6-FAM，ROX和6-Cy5具有不同的荧光发射光谱，上述荧光检测体系能够同时对三种不同发射光谱的荧光进行采集，从而同时实现对三种miRNA分子的定量检测。本实施例提供的荧光检测体系通过特异性识别并检测阿尔兹海默症的生物标志物分子，能够实现对阿尔兹海默症的无创诊断，且诊断过程不需要使用大型仪器或经过复杂的检测步骤，具有快速、简单、灵敏、高效的优势。上述三种荧光探针结合目标miRNA分子的特异性强、灵敏度高，使荧光检测体系用于诊断阿尔兹海默症具有较好的准确性，为阿尔兹海默症的早期诊断、筛查提供有效的临床信息，有利于疾病的早发现、早治疗，有效提高阿尔兹海默症患者的生存质量、提高患者生存率。

实施例2

本实施例提供一种荧光生物传感器，包括实施例2中的荧光检测体系。荧光生物传感器能够实现对阿尔兹海默症的生物标志物分子的生物标志物分子的快速检测，具有快速、简单、灵敏、高效、准确的优势，能够用于阿尔兹海默症的疾病筛查与诊断。

实验例1

1、实验目的：检测实施例1中第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针与目标生物标志物分子结合的特异性和灵敏度。

2、实验过程和结果：

分别对三种荧光探针未与氧化石墨烯孵育前、与氧化石墨烯孵育后，以及同时与氧化石墨烯和miRNA孵育后的荧光发生光谱进行检测，记录下第一荧光探针在510nm-640nm波段(激发波长：490nm)，第一荧光探针在600 nm-740nm波段(激发波长：580nm)和第三荧光探针在670nm-790nm波段(激发波长：640nm)的荧光发射光谱，结果如图1所示。

图1A显示第一荧光探针pDNA1在三种情况下荧光发射光谱的变化情况：在没有GO存在的情况下，pDNA1表现出较强的荧光发射谱，发射峰位于λ＝520nm处。当GO加进溶液之后，荧光强度降低了很多，说明pDNA1 吸附在BPNSs表面，QD的荧光淬灭。然而，互补的目标miRNA1加入到溶液中，与pDNA1杂交之后，DNA双链从GO上解离下来，QD的荧光得到明显的恢复，恢复到加入GO前的水平。另外两种pDNA的荧光光谱表现出同样的性质。图1B显示第二荧光探针pDNA2在三种情况下荧光发射光谱的变化情况，图1C显示第三荧光探针pDNA3在三种情况下荧光发射光谱的变化情况，由图1B和图1C可知，第二荧光探针pDNA2和第三荧光探针pDNA3 表现出与第一荧光探针pDNA1相同的性质。

实验例2

1、实验目的：检测实施例1中荧光检测体系的线性检测范围

2、实验过程：

1)荧光检测使用多功能酶标仪Variokan Flash(Thermo Scientific，USA)测得，在全黑的96孔板中进行。首先，100μl含有50nM pDNA1，50nM pDNA2 和100nM pDNA3的溶液加入到孔板中。接着，10μl浓度为200μg/mL的GO 加入到溶液中。室温下孵育5分钟后，100μL不同浓度的miRNA1(1000nM， 500nM，200nM，100nM，50nM，20nM，10nM和0nM)或miRNA2(1000nM， 500nM，200nM，100nM，50nM，20nM，10nM和0nM)或miRNA3(1000nM， 500nM，200nM，100nM，50nM，20nM，10nM和0nM)加入到溶液中，孵育20分钟。对照组，加入100μLPBS。同时，使用四种加标样品对检测体系的实用性进行测定，分别是(30nM miRNA1，70nM miRNA2)、(30nM miRNA1，125nM miRNA3)、(70nM miRNA1，125nM miRNA3)和(30nM miRNA1，70nMmiRNA2， 125nM miRNA3)。在每一步结束，记录下每个孔在510nm-640nm波段(激发波长：490nm)，600nm-740nm波段(激发波长：580nm)和670nm-790nm波段(激发波长：640nm)的荧光发射谱。在检测过程中，520nm、610nm和670nm 处的荧光发射强度每五分钟记录一次。检测结果如图2-图4所示。

2)加标样本所在孔测得在λ＝520nm，610nm和660nm处的荧光强度分别代入标定方程中得到miRNA1、miRNA2和miRNA3的浓度。表1显示的是加标样本的检测结果。

3、实验结果：

图2显示pDNA1-GO混合物与不同浓度的目标miRNA1(0nM-1000nM) 孵育后测得的荧光光谱，图2A显示FAM的荧光发射强度随着目标miRNA 浓度的升高而升高，表明了目标miRNA1引起的荧光恢复。图2B显示荧光强度变化ΔF1(ΔF1＝F1-F01，F01为λ＝520nm波长处pDNA1-GO混合物的荧光强度，F1为一定浓度的目标miRNA1与pDNA1-GO混合物孵育20分钟后在λ＝520nm波长处测得的荧光强度。)与目标miRNA1浓度的标定曲线。由图2B可知，在10nM-200nM浓度范围内，ΔF与目标miRNA1浓度呈线性关系，线性方程为ΔF＝0.023*CmiRNA1+2.07(nM，r2＝0.9962)。

图3显示pDNA2-GO混合物与不同浓度的目标miRNA2(0nM-1000nM) 孵育后测得的荧光光谱，图3A显示ROX的荧光发射强度随着目标miRNA 浓度的升高而升高，表明了目标miRNA2引起的荧光恢复。图3B显示荧光强度变化ΔF2(ΔF2＝F2-F02，F02为λ＝610nm波长处pDNA2-GO混合物的荧光强度，F2为一定浓度的目标miRNA2与pDNA2-GO混合物孵育20分钟后在λ＝610nm波长处测得的荧光强度。)与目标miRNA2浓度的标定曲线。由图3B可知，在20nM-500nM浓度范围内，ΔF2与目标miRNA浓度呈线性关系，线性方程为ΔF＝0.019*CmiRNA1+0.67(nM，r2＝0.991)。

图4显示pDNA3-GO混合物与不同浓度的目标miRNA3(0nM-1000nM) 孵育后测得的荧光光谱，图4A显示6-Cy5的荧光发射强度随着目标miRNA 浓度的升高而升高，表明了目标miRNA3引起的荧光恢复。图4B显示荧光强度变化ΔF3(ΔF3＝F3-F03，F03为λ＝660nm波长处pDNA3-GO混合物的荧光强度，F3为一定浓度的目标miRNA3与pDNA3-GO混合物孵育20分钟后在λ＝660nm波长处测得的荧光强度。)与目标miRNA3浓度的标定曲线。由图4B可知，在20nM-200nM浓度范围内，ΔF3与目标miRNA3浓度呈线性关系，线性方程为ΔF＝0.016*CmiRNA1-0.41(nM，r2＝0.995)。

由图2-图4可知，荧光检测体系对miRNA1的线性检测范围为 10nM-200nM，对miRNA2的线性检测范围为20nM-500nM，对miRNA3的线性检测范围为20nM-200nM，线性度良好。

表1 miRNA加标样本检测结果

由表1可知，实施例2中荧光检测体系对miRNA1、miRNA2和miRNA3 的检测准确率在80％-120％之间，说明荧光检测体系对阿尔兹海默症的生物标志物分子检测具有较高的准确性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途

<130> ZHA201900567

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(pDNA1)

<400> 1

tcatagccct gtacaatgct gct 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(pDNA2)

<400> 2

agaaaggcag caggtcgtat ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(pDNA3)

<400> 3

cactggtaca agggttggga ga 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(miRNA1)

<400> 4

agcagcauug uacagggcua uga 23

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(miRNA2)

<400> 5

cuauacgacc ugcugccuuu cu 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(miRNA3)

<400> 6

ucucccaacc cuuguaccag ug 22