阅读说明：本技术 基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器及其制备方法及应用 (Fluorescent array sensor based on gold clusters and gold nanoparticles and preparation method and application thereof ) 是由 黄略略 李彬 江帆 范大明 梁勇 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器,其包括表面带负电的金纳米簇、以及带正电的半胱氨酸修饰的金纳米颗粒和柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒。本发明还提供了所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器的制备方法。本发明还提供了所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器用于分析检测维生素B6、B9、B12的用途。本发明还提供了一种用于分析检测维生素B6、B9、B12的方法,其包括将含有维生素B6、B9、B12的样品加入所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器中,测定加入前后的荧光信号强度变化。本发明能够有效、简便、灵敏地检测并分析维生素B6、B9、B12。(The invention discloses a fluorescence array sensor based on gold clusters and gold nanoparticles, which comprises gold nanoclusters with negative electricity on the surface, gold nanoparticles modified by cysteine and gold nanoparticles modified by citric acid-melamine with positive electricity. The invention also provides a preparation method of the fluorescence array sensor based on the gold clusters and the gold nanoparticles. The invention also provides application of the fluorescent array sensor based on the gold clusters and the gold nanoparticles to analysis and detection of vitamins B6, B9 and B12. The invention also provides a method for analyzing and detecting the vitamins B6, B9 and B12, which comprises the steps of adding a sample containing the vitamins B6, B9 and B12 into the gold cluster and gold nanoparticle-based fluorescence array sensor, and measuring the change of the fluorescence signal intensity before and after the addition. The invention can effectively, simply and sensitively detect and analyze the vitamins B6, B9 and B12.)

基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器及其制备方法及 应用

技术领域

本发明属于有机化学领域，具体涉及一种基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器及其制备方法及应用。

背景技术

维生素B也称作维他命B、维生素B族或维生素B复合群，是B族维生素的总称，通常来自相同的食物来源，如酵母。维生素B曾被误认为是单一结构的有机化合物，后来的研究表明，维生素B是一组具有不同结构的化合物，如维生素B1、B2、B6等。维生素B都是一些水溶性维生素，可协同作用，调节人体的新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统的功能，促进细胞生长和***。其中，B6、B9、B12这三种维生素B对孕妇有重要作用。

维生素B6(Vitamin B6)是一种水溶性维生素，也称吡哆素，包括吡哆醇、吡哆胺以及吡哆醛，在体内以磷酸酯的形式存在。维生素B6为无色晶体，在酸液中稳定，而在碱液中易破坏；吡哆醇耐热，但吡哆胺和吡哆醛不耐高温。维生素B6在酵母菌、肝脏、鱼、蛋、肉、豆类以及谷粒中含量较多。维生素B6是人体体内某些辅酶的组成成分，并且参与多种代谢反应，特别是和氨基酸代谢有密切关系。维生素B6制剂常在临床上使用以防治女性妊娠呕吐和放射病呕吐。维生素B6是人体内糖和脂肪代谢必不可少的物质，女性的***代谢更加需要维生素B6，所以说B6对防治某些妇科病有很大作用。许多女性可能会因为服用避孕药而导致情绪低落、脾气暴躁、感到乏力等，只需每日补充60mg左右便可缓解症状。还有些女性患有经前期紧张综合征，常表现为月经前眼睑和手足浮肿，或失眠和健忘，只需每日吃50-100mg维生素B6便可完全缓解。

叶酸(Folic Acid，FA)是一种水溶性维生素(B9)，主要功能是参与核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成与代谢，也参与氨基酸代谢，同时促进骨髓中幼小细胞的成熟，以及参与红血球和白血球的制造，从而增强人体自身免疫能力。如果人体内缺乏叶酸或叶酸摄取量不足，就会发生多种疾病，比如体内白细胞逐渐减少、抑郁症、老年痴呆症、心血管疾病和唐氏综合症，甚至是导致机体癌变。除此之外，叶酸对于母体内的胎儿的正常发育很重要，在孕前和怀孕这段期间，适当补充叶酸可以降低胎儿脊柱裂、神经管发育缺陷、脑和颅骨畸形发生的概率。人体不能自身合成叶酸，所以必须从食物中获取，美国食品和药物管理局(FDA)就出台了强制性规定，要求部分粮食产品的叶酸含量必须在1400mg·kg-1以上。所以，叶酸含量的检测分析对于人类健康尤其是母体内胎儿神经系统的正常发育来说非常重要。

维生素B12也称作氰钴素或钴胺素，是一种由卟啉类化合物组成的含钴的B族维生素。科学家最初发现人体服用全肝后可有效控制恶性贫血症状，经过20年的研究，科学家终于在1948年从肝脏分离出一种具有治疗恶性贫血效果的红色物质，命名为维生素B12。维生素B12是所有B族维生素中发现最晚的一种，易溶于水和乙醇，在pH值约4.5～5.0的弱酸条件中最稳定，在强酸或碱性条件下分解，遇热在一定程度上被破坏，但短时间的高温消毒不大，遇紫外线或强光易被破坏。维生素B12主要作用有：以辅酶的形式存在于人体中，可以提高叶酸的利用率，促进脂肪、碳水化合物和蛋白质的代谢；促进红细胞的生长和成熟，使人体造血机能处于一个正常状态，从而预防恶性贫血以及维持神经系统的健康；具有促进核酸的合成和活化氨基酸的作用，促进蛋白质的合成，它对婴幼儿及青少年的生长和发育有重要作用；是神经系统功能健全必需的维生素，因为其参与形成神经组织中的一种脂蛋白；消除焦躁情绪，帮助集中注意力，增强记忆力及平衡感。

目前维生素B族分子的检测方法种类繁多，例如电化学法、酶联免疫法、色谱法等，但这些方法在实际检测时容易受到样品其他成分的干扰，除此之外，有些方法还存在稳定性差、灵敏度低、检测成本高、耗费时间长或步骤繁多的缺点。

荧光阵列传感器是光学传感器之一，具有输出信号丰富、灵敏度高、可成像等优点。在最近的十几年中，研究者发展了许多基于荧光传感原理的荧光阵列传感器，用于检测金属离子、生物大分子以及一些有机化合物。

金属纳米簇含几个到几百个不等的金属原子，一般来说粒径小于3纳米，有不同的电子能级和不连续的能带结构，具有催化活性、电、磁、光、热等类分子特性。金属纳米簇与传统的有机分子比起来，不仅具有相当理想的生物相容性，并且细胞毒性低、抗光漂白能力强，特别是是金纳米簇(AuNCs)，更是表现出这些优良特性，使其在医疗诊断、生物检测、环境分析监测上具有重要应用意义。

金纳米粒子(AuNPs)是早期研究的一种纳米材料，在生物学研究中通常被称为胶体金，其直径在1～100nm之间，稳定性较好，随粒径的变化呈现不同的颜色。金纳米粒子在电子显微镜下具有很高的电子密度和很好的对比度，还具有灵敏的光学性质、易于表面修饰和良好的生物相容性等优点，使其成为分析化学、环境监测、医学诊断等领域理想的功能材料，可以作为细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位的探针，还可以用于常规的免疫诊断和免疫组织化学定位，广泛应用于临床诊断及药物检测等方面。

发明内容

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种稳定性好、灵敏度高、简单便捷地分析检测维生素B族物质的光学传感器。

本发明的另一个目的是提供上述光学传感器的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种分析检测维生素B族物质的方法。

为了实现以上发明目的，本发明提供了一种基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器，其包括表面带负电的金纳米簇、以及带正电的半胱氨酸修饰的金纳米颗粒和柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒。

根据本发明的基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器，其中所述金纳米簇由牛血清蛋白作为模板合成制得。

另一方面，本发明还提供了所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备金纳米簇；

步骤2：制备半胱氨酸修饰的金纳米颗粒；

步骤3：制备柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒。

优选地，所述金纳米簇的制备步骤如下：

将5.0mL浓度为10mmol/L的HAuCl₄溶液加入到5.0mL浓度为50mg/mL的牛血清蛋白溶液中，在37℃下剧烈搅拌2分钟，将0.5mL浓度为1mol/L的NaOH溶液快速加入反应液当中，在37℃下剧烈搅拌12小时，得到所述金纳米簇溶液。

优选地，所述半胱氨酸修饰的金纳米颗粒的制备步骤如下：

将500μL浓度为215mmol/L的半胱氨酸溶液和2.23mL浓度为25.5mmol/L的HAuCl₄溶液混合均匀，加入37.5mL蒸馏水，室温下搅拌20分钟，然后加入10μL浓度为10mmol/L的NaBH₄溶液，室温下快速搅拌40分钟，溶液逐渐变为深红色，得到所述半胱氨酸修饰的金纳米颗粒。

优选地，所述柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒的制备步骤如下：

将100mL质量浓度为0.01％的HAuCl₄溶液冷凝回流，加热至沸腾状态，然后加入5mL质量浓度为1％的柠檬酸溶液，当溶液变为酒红色后，继续沸腾15分钟，得到柠檬酸修饰的金纳米颗粒，按所述柠檬酸修饰的金纳米颗粒和三聚氰胺20:1的质量浓度混合，孵育10分钟，得到所述柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒。

本发明还提供了所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器用于分析检测维生素B6、B9、B12的用途。

本发明还提供了一种用于分析检测维生素B6、B9、B12的方法，其包括以下步骤：将含有维生素B6、B9、B12的样品加入所述基于金簇和金纳米颗粒的荧光阵列传感器中，测定加入前后的荧光信号强度变化。

本发明的荧光阵列传感器原理如下：金簇带负电，而两种不同修饰的金纳米颗粒均带正电，由于静电作用，金簇被吸附至金纳米颗粒的表面，从而荧光被猝灭，当加入维生素B(如B6、B9、B12)分析物后，带负电的维生素B分子使得金纳米颗粒发生聚沉，金簇与金纳米颗粒两者间的相互作用被破坏，从而使金簇的荧光得到恢复，但是恢复的程度不同，即不同的维生素B分析物在此荧光阵列传感器上都会产生因结构特点不同而不同的荧光响应图谱，再利用线性判别分析(LDA)得到维生素B分析物的识别区分结果，绘出指纹图谱，在实际样品检测中将样品再指纹图谱上进行归类，实现对三种维生素B分子的识别检测。

附图说明

图1是金纳米簇的傅里叶红外光谱图。

图2是金纳米簇的紫外可见吸收光谱图。

图3是金纳米簇的荧光发射光谱图。

图4是金纳米簇的荧光激发光谱图。

图5是半胱氨酸修饰的金纳米颗粒cyst-AuNPs的傅里叶红外光谱图。

图6是柠檬酸钠-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒Mel-citr-AuNPs的傅里叶红外光谱图。

图7是半胱氨酸修饰的金纳米颗粒cyst-AuNPs的紫外可见吸收光谱图。

图8是柠檬酸钠-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒Mel-citr-AuNPs的紫外可见吸收光谱图。

图9是不同浓度的B6溶液对金簇荧光强度的影响。

图10是不同浓度的B9溶液对金簇荧光强度的影响。

图11是不同浓度的B12溶液对金簇荧光强度的影响。

图12是三种维生素B族分子在传感单元1上的荧光响应结果。

图13是三种维生素B族分子在传感单元2上的荧光响应结果。

图14是三种维生素B族分子水溶液(13.65μM)在荧光阵列传感器上的荧光响应结果。

图15是三种溶液样品(13.65μM)的LDA分析结果。

图16是三种溶液样品(13.65μM)的HCA分析结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。

实施例1：荧光金纳米簇的制备

金簇(AuNCs)通过BSA(牛血清白蛋白)在碱性条件下作为模板和还原剂还原HAuCl₄形成Au-S键而得到。将5.0mL(10mmol/L)的HAuCl₄溶液加入到5.0mL(50mg/mL)的BSA蛋白溶液当中，在37℃下剧烈搅拌2分钟，将0.5mL(1mol/L)的NaOH溶液快速加入反应液当中，在37℃下剧烈搅拌12小时。得到棕黄色金簇溶液，反应完成后溶液在紫外灯的照射下发出红色的荧光，根据金原子的个数，计算出AuNCs的浓度为4.76mmol/L。金簇带负电。

通过紫外可见吸收光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱对它的结构、组成及光学性能进行表征。结果如图1至图4所示。其中，图1是金纳米簇的傅里叶红外光谱图，图2是金纳米簇的紫外可见吸收光谱图，图3是金纳米簇的荧光发射光谱图，图4是金纳米簇的荧光激发光谱图。

合成的金簇在可见光下显示棕色，在紫外灯下发出较强的红光。从傅里叶红外光谱图可见，AuNCs的红外光谱与现有文献中单独的BSA的红外光谱基本相似，此外，2525cm^-1处S-H伸缩振动峰已经消失，说明AuNCs表面形成Au-S键；从紫外可见光谱图可见，BSA-AuNCs在280nm处有一个很强的吸收峰，这个吸收峰是典型BSA的紫外吸收峰，并且该吸收曲线上没有任何金属粒子的表面等离子共振吸收峰，说明了合成的金簇没有较大粒径的金属纳米粒子等副产物的生成；从荧光光谱图上可知，AuNCs在666nm处有较强的荧光发射峰。综上，AuNCs的结构表征与已有文献结果相符，说明AuNCs的合成符合要求。

实施例2：金纳米颗粒的制备

通过还原法制备金纳米颗粒，还原剂分别为NaBH₄和柠檬酸，制备的金纳米颗粒均带正电。

1、半胱氨酸修饰的金纳米颗粒(cyst-AuNPs)的制备

500μL半胱氨酸溶液(215mmol/L)和2.23mL HAuCl₄溶液(25.5mmol/L)混合均匀，加入37.5mL的蒸馏水，室温下搅拌20分钟，然后迅速加入10μL新鲜配置的NaBH₄溶液(10mmol/L)。室温下快速搅拌40分钟，溶液逐渐变为深红色，得到半胱氨酸修饰的金纳米颗粒(cyst-AuNPs)，计算出cyst-AuNPs的浓度为1.19×10^-10mol/L。

2、柠檬酸钠-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒(Mel-citr-AuNPs)的制备

在三口圆底烧瓶中加入100mL 0.01％HAuCl₄溶液，冷凝回流，慢慢加热至沸腾状态，然后加入5mL 1％的柠檬酸溶液。当溶液变为酒红色后，继续沸腾15分钟，得到柠檬酸修饰的金纳米颗粒(citr-AuNPs)，计算出citr-AuNPs的浓度为6.0nmol/L。按照citr-AuNPs和三聚氰胺20：1的浓度混合，孵育10分钟，合成柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒(Mel-citr-AuNPs)。

通过紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱对制备的cyst-AuNPs和Mel-citr-AuNPs的结构、组成及光学性能进行表征。结果如图5至图8所示。其中，图5是半胱氨酸修饰的金纳米颗粒cyst-AuNPs的傅里叶红外光谱图，图6是柠檬酸钠-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒Mel-citr-AuNPs的傅里叶红外光谱图，图7是半胱氨酸修饰的金纳米颗粒cyst-AuNPs的紫外可见吸收光谱图，图8是柠檬酸钠-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒Mel-citr-AuNPs的紫外可见吸收光谱图。

cyst-AuNPs的最大紫外吸收在520nm左右，Mel-citr-AuNPs的最大紫外吸收在560nm左右，与现有文献上结果相符，说明合成的金纳米颗粒符合实验要求。

实验例1：维生素B族分子对金纳米簇的荧光的影响

分别配制浓度为13.65μmol/L的维生素B6、B9、B12溶液，每个样品设置五个浓度梯度，分别取1mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0mL于五根试管中，加入100μL实施例1得到的金簇溶液，用10.0mmol/L的Tris缓冲液(pH＝8.0)定容至1.5mL，常温下孵育10min。选用505nm作为激发波长，使用荧光光谱仪准确记录体系溶液从550-800nm波长范围内的荧光发射光谱响应情况。

结果如图9至图11所示，其中，图9示出了不同浓度的B6溶液对金簇荧光强度的影响，图10示出了不同浓度的B9溶液对金簇荧光强度的影响，图11示出了不同浓度的B12溶液对金簇荧光强度的影响。

由图可知，三种维生素B分子不同浓度的溶液对荧光强度基本无影响。

实验例2：荧光阵列传感器对维生素B族分子的识别分析

分别取500mL的三种维生素B溶液分别加入到500μL上述实施例2制备的两种金纳米颗粒溶液中，混合均匀后用10.0mmol/L的Tris缓冲液(pH＝8.0)定容至2.0mL，在室温下充分混合10分钟。取500μL反应液，各加入100μL的AuNCs，混合均匀后用10.0mmol/L的Tris缓冲液(pH＝8.0)定容至2.0mL，在室温下充分混合15分钟。选用505nm作为激发波长，使用荧光光谱仪准确记录体系溶液从550-800nm波长范围内的荧光发射光谱变化情况。

结果如图12和图13所示，其中图12示出了三种维生素B族分子在传感单元1(半胱氨酸修饰的金纳米颗粒)上的荧光响应结果，图13示出了三种维生素B族分子在传感单元2(柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒)上的荧光响应结果。

由荧光响应结果可知，两种传感单元对金簇的荧光产生不同的猝灭程度，而三种维生素B分析物使两种金纳米颗粒聚沉的能力有所不同，从而使金簇的荧光在不同程度上得到恢复。其中传感元素1使荧光猝灭的程度稍大于传感元素2；而B12的在两个传感单元上的荧光恢复程度最强，B9次之，B6最弱。

将每个溶液样品在荧光阵列传感器上得到的所有荧光信号的峰值原始数据输入到电脑，计算其荧光恢复的比值和五组平行实验组的平均值和标准偏差，利用origin作出柱状图(图14)，可直观看出三种分析物在阵列传感器上的不同荧光恢复比值以及实验误差。如图14所示，是三种维生素B族分子水溶液(13.65μM)在荧光阵列传感器上的荧光响应结果。使用SPSS软件进行LDA分析，得到“指纹图谱”，然后利用LDA将这些发光响应数据转化为具体分值，在二维坐标系中直观分布，每一类溶液样品重复实验5次，实现不同样品之间的识别与区分。图15是三种溶液样品(13.65μM)的LDA分析结果(“指纹图谱”)。由“指纹图谱”可见，每一类溶液样品重复实验所得数据点都聚到同一范围内，并且互不干扰，说明该荧光阵列传感器有实际应用意义。

图16是三种溶液样品(13.65μM)的HCA分析结果。通过HCA分析(图3-16)，由图进一步得知，该荧光阵列传感器可正确地识别区分三种维生素B分子。

实验例3：实际样品的检测

选取金纳米簇(AuNCs)与半胱氨酸修饰的金纳米粒子(cyst-AuNPs)、柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒(Mel-citr-AuNPs)组成荧光阵列传感器，用于维生素B6、B9、B12的快速检测。

由牛血清蛋白作为模板合成的金纳米簇(AuNCs)表面带负电，半胱氨酸修饰的金纳米粒子(cyst-AuNPs)、柠檬酸-三聚氰胺修饰的金纳米颗粒(Mel-citr-AuNPs)均带正电，由于静电作用，金簇被吸附至金纳米颗粒，从而荧光猝灭，而三种维生素B分子均呈电负性，可诱导cyst-AuNPs和Mel-citr-AuNPs聚沉，导致cyst-AuNPs、Mel-citr-AuNPs与AuNCs之间的静电作用降低，使得体系荧光恢复，但恢复程度不同，不同的荧光信号响应使得该阵列传感器实现对三种分析物的识别。

购买市售维生素B6、B9、B12药片，分别研磨成粉末，然后用pH＝8.0的Tris缓冲液溶解，溶解液直接用于检测。每个样品设置五个平行实验组。

样品检测结果如表1所示，所有15例(3个样品各5次重复)测试都被准确地归类测试，并且说明单个传感元素时不能将三种维生素B分子百分百进行识别区分，只有当两个传感单元一起工作时，才能百分百识别区分三种维生素B分子。说明该阵列传感器在维生素B分子的检测应用上有实际研究意义。

表1：Jackknifed分类矩阵数据表

分析物	cyst-AuNPs	Mel-citr-AuNPs	二者
				B6	100％	60％	100％
B9	20％	100％	100％
				B12	20％	100％	100％