一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
阅读说明：本技术 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法 (Enterotoxin spectral analysis method based on fluorescence and Raman double-signal enhancement ) 是由 赵媛 施丽霞 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法,属于光谱分析技术领域。本发明包括：将铬、铒、镱元素掺杂在镓锗酸锌基质得到长余辉纳米粒子(ZGGO:Cr,Er,Yb NPs)。在长余辉纳米粒子和金锥纳米粒子表面分别修饰肠毒素的一抗和二抗,当存在肠毒素时,抗体捕获了抗原形成双抗体夹心结构。抗体的刚性结构为金锥和ZGGO:Cr,Er,Yb NPs之间提供了合适的距离,金锥引起的电磁场增强促进了荧光物质的辐射衰减速率,导致荧光增强。此外ZGGO:Cr,Er,Yb NPs金锥之间存在电荷转移,导致SERS信号增强。本发明以荧光信号和拉曼信号共同作为检测信号,提高了检测的准确性。(The invention provides a fluorescence and Raman dual-signal enhancement based enterotoxin spectral analysis method, and belongs to the technical field of spectral analysis. The invention comprises the following steps: the long afterglow nano particle (ZGGO: Cr, Er, Yb NPs) is obtained by doping chromium, erbium and ytterbium elements in the gallium zinc germanate matrix. The primary antibody and the secondary antibody of the enterotoxin are respectively modified on the surfaces of the long-afterglow nano particles and the gold cone nano particles, and when the enterotoxin exists, the antibody captures the antigen to form a double-antibody sandwich structure. The rigid structure of the antibody provides a proper distance between the gold cone and ZGGO, Cr, Er and Yb NPs, and the electromagnetic field enhancement caused by the gold cone promotes the radiation attenuation rate of the fluorescent substance, so that the fluorescence is enhanced. In addition, charge transfer exists between ZGGO, Cr, Er and Yb NPs gold cones, and the SERS signal is enhanced. The invention takes the fluorescence signal and the Raman signal as the detection signal, thereby improving the accuracy of detection.)
技术领域
本发明属于光谱分析技术领域，尤其是涉及一种检测肠毒素的荧光拉曼双重光谱分析技术。
背景技术
肠毒素广泛存在于自然界中，是一种重要的临床致病菌，会导致细菌性食物中毒、菌血症、皮肤组织感染等疾病。由于其高的热稳定性和致病力，肠毒素感染成为世界性公共卫生问题。目前用于肠毒素检测的方法有：质谱分析、PCR法、电化学免疫分析、酶联免疫分析法等，但是存在试剂设备昂贵、耗时、重现性差等缺点。因此迫切需要开发能够准确、灵敏、特异性检测SEC含量的传感器。
近年来，纳米材料因其独特的光学、电学、热学、催化性能，在化工、生物、环境科学领域飞速发展。由于具有介电限域效应、量子尺寸效应和表面效应，纳米材料明显优于其他传统材料。长余辉纳米材料是一种在激发光下储存能量，移除激发光后能以光的形式缓慢释放能量的光致发光纳米材料。由于不涉及原位激发，长余辉材料可以有效地消除检测环境中的自体荧光背景和光散射干扰。等离子金属纳米材料例如金、银纳米材料，由于局域表面等离子体共振(LSPR)效应在可见光区域表现出强烈的光吸收和光散射。此外，由于具有良好的生物相容性和低细胞毒性，以此类纳米材料构建的生物传感器反应灵敏、选择性好、检测限低。与单一组分的纳米材料相比，由多组分材料自组装而得的纳米复合材料表现出更多的优异特性。因此，开发基于长余辉材料与等离子金属材料的复合材料具有重要意义和应用前景。
发明内容
本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法。本发明提供的方法能够有效消除自体荧光干扰，提高了检测的准确性，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明的技术方案如下：
一种检测肠毒素的荧光拉曼双重光谱分析方法，所述的分析方法具体包括以下步骤：将长余辉纳米粒子进行表面肠毒素抗体修饰得到ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，与金锥纳米粒子进行表面肠毒素抗体修饰得到的Au [email protected]/SEC-2溶液混合，随后加入肠毒素SEC，混均，分别测定溶液荧光光谱以及拉曼光谱。
所述分析方法的具体步骤如下：
(1)长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备及表面SEC-1的修饰：
①长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的制备：
将Cr(NO3)2，Zn(NO3)2，Yb(NO3)2，Er(NO3)2与锗酸铵溶液加入到Ga(NO3)2溶液中，混匀后得到溶液1，随后向溶液1中加入CTAB，调节溶液的pH值至7-9，混均后进行水热反应，在110-130℃下加热14-16h；冷却至室温后，固液分离取沉淀物，洗涤并干燥即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs；
②长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的氨基化：将上述所得ZGGO:Cr,Er,Yb NPs分散于NaOH溶液中，混均后固液分离取沉淀，并将其分散在N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES试剂，在75-85℃水浴中加热，待反应结束后固液分离取固相，并将固相分散在水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③长余辉纳米粒子表面肠毒素抗体(SEC-1)修饰：将戊二醛和NaBH4溶液加入到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液中并搅拌，之后固液分离并洗涤沉淀物，将沉淀物用PBS缓冲溶液复溶，加入SEC-1溶液，振荡孵育，离心并用BSA溶液重悬产物，室温下保存4-5h，反应结束后收集沉淀物并用水清洗，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，反应结束后即得ZGGO:Cr,Er,Yb/SCE-1溶液。
(2)金锥纳米Au NBPs溶液的制备及表面SEC-2的修饰：
①金锥纳米Au NBPs溶液的制备：首先向HAuCl4，十六烷基三甲基氯化铵CTAC，柠檬酸溶液中加入NaBH4溶液，室温搅拌1-3min；将溶液在75-85℃油浴中加热搅拌85-95min得到金种溶液，向CTAB，HAuCl4，AgNO3，HCl，AA指抗坏血酸的混合溶液中加入上述金种溶液，并孵育1.8-2.2h得到金锥纳米Au NBPs溶液；
②Au [email protected]的制备：向金锥纳米Au NBPs溶液中加入4-ATP溶液，反应结束后固液分离取固相并用水洗涤，将固相溶解在水中得到Au [email protected]溶液；
③表面肠毒素抗体SEC-2的修饰：将用TBE缓冲液稀释的肠毒素抗体SEC-2加入[email protected]溶液进行反应，待反应结束后固液分离取沉淀物，用BSA溶液重悬沉淀物，室温下保存2-3h，封闭未结合抗体的结合位点；反应结束后离心收集沉淀物并用水洗涤，最后将沉淀物重新分散在PBS缓冲溶液中，即得Au [email protected]/SEC-2溶液；
(3)荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将Au [email protected]/SEC-2溶液与配制好的SEC标准溶液混合，室温下孵育5-6h；之后加入ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，室温下孵育5-6h；反应结束后用250-260nm紫外灯照射，测试每组溶液的发光光谱，得到以SEC浓度对数为横坐标，以检测探针ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1的发光恢复程度F-F0纵坐标的标准曲线；测试每组溶液的拉曼光谱，得到以SEC浓度对数为横坐标，以检测探针Au [email protected]/SEC-2的拉曼信号变化程度I-I0为纵坐标的标准曲线，其中所述F代表有肠毒素时的荧光强度；I代表有肠毒素时的拉曼强度；F0代表没有肠毒素时的荧光强度；I0代表没有肠毒素时的拉曼强度。
优选的，步骤(1)①中所述Cr(NO3)2、Zn(NO3)2、Yb(NO3)2、Er(NO3)2、锗酸铵与Ga(NO3)2的摩尔比为0.004-0.006:1.2-1.4:0.02-0.03:0.002-0.003:0.2-0.3:1.4-1.6；CTAB的使用量为15-17mg。
优选的，步骤(1)②所述ZGGO:Cr,Er,Yb NPs和固体NaOH的质量比为8-12:0.48-1.2，N,N-二甲基甲酰胺溶剂与APTES溶液体积比为3-5:0.02-0.08。
优选的，步骤(1)③中所述戊二醛的质量浓度为20％-25％，NaBH4溶液浓度为24-26mM，BSA溶液浓度为8-10mg/mL，SEC-1溶液的浓度为10-14μM，氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液、戊二醛、NaBH4溶液、SEC-1溶液与BSA溶液体积比为1-2:1-2:2-4:5-6:8-10。
优选的，步骤(2)①所述制备金种溶液时所用的HAuCl4、CTAC、柠檬酸溶液与NaBH4的摩尔比为2.2-2.5：495-505：45-55：6.1-6.5；制备Au NBPs时CTAB、HAuCl4、AgNO3、HCl与AA的摩尔之比为8-12:0.04-0.06:0.0008-0.0012:1-3:0.07-0.09。
优选的，步骤(2)②中Au NBPs与4-ATP的摩尔比为1:50-1：60。
优选的，步骤(2)③中所述SEC-2溶液浓度为10-14μM；所述SEC-2溶液与Au [email protected]溶液的摩尔比为1:100-1:110。
优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述PBS缓冲溶液浓度为8-12mM，pH为7.2-7.6；TBE缓冲液浓度为10-15μM。
本发明有益的技术效果在于：
SEC是指肠毒素抗原，SEC-1和SEC-2是肠毒素的一抗和二抗，其中SEC-2代表捕获抗体，SEC-1代表识别抗体，是抗体制备过程中配对识别的，以此形成双抗体夹心结构来进行组装及检测。
本发明采用红色发射的长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs作为发光材料，通过醛基与氨基之间形成共价键的方式在ZGGO:Cr,Er,Yb NPs表面修饰SEC-1，制备出可特异性识别肠毒素的检测探针。在金锥表面修饰拉曼信标和肠毒素的二抗SEC-2，记作Au [email protected]/SEC-2。当存在SEC时，由于抗原抗体的特异性识别使ZGGO:Cr,Er,Yb NPs与Au [email protected]形成组装体。抗体的刚性结构为金锥和ZGGO:Cr,Er,Yb NPs之间提供了合适的距离，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的荧光增强；ZGGO:Cr,Er,Yb NPs与Au [email protected]之间存在电荷转移，导致SERS信号增强，同时，金锥引起的电磁场增强促进了荧光物质的辐射衰减速率，导致荧光增强。该方法能够有效消除自体荧光干扰，提高了检测的准确性，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明提出的一种检测SEC的荧光拉曼双重光谱分析方法具有很高的灵敏度和特异性，本检测方法无需原位激发，可以消除检测环境中自体荧光的背景干扰，大大提高了检测的灵敏度；长余辉材料能增强Au [email protected]的SERS增强效应，且Au [email protected]能有效增强长余辉的荧光，SEC的检测结果可以同时通过荧光光谱及拉曼光谱反映，长余辉材料能增强Au [email protected]和Au [email protected]之间的协同作用进一步提高了检测的准确度。
附图说明
图1是实施例2中制备得到的长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的TEM图；
图2是实施例2中制备得到的金锥纳米粒子Au NBPs的TEM图；
图3是实施例2中检测SEC的荧光拉曼适配体传感器的原理示意图；
图4是实施例2中存在不同浓度的SEC时，荧光拉曼传感器的荧光光谱、拉曼光谱及标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面SEC-1的修饰：
①将0.004mmol Cr(NO3)2，1.2mmol Zn(NO3)2，0.02mmol Yb(NO3)2，0.002mmol Er(NO3)2和0.2mmol锗酸铵溶液加入到1.4mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入15mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至7；在室温下超声20min，搅拌0.8h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在110℃下加热14h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,YbNPs粉末；
②将上述所得8mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于3mL浓度为4mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌11h；离心收集下层沉淀，将其分散在3mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在75℃水浴中加热搅拌22h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③10μL ZGGO:Cr,Er,Yb溶液、10μL浓度为20％的戊二醛、20μL浓度为24mM的NaBH4溶液在室温下孵育50min，反应结束后离心洗涤去除未完全吸附的戊二醛。沉淀物用PBS缓冲溶液复溶，加入50μL浓度为10μM的SEC-1溶液，室温下振荡孵育5h，离心并用BSA溶液重悬产物，室温下保存4h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为0.8mg/mL的ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液；
2，Au NBPs的制备及表面SEC-2的修饰：
①首先向0.2mM HAuCl4，48mM CTAC，4mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的24mM NaBH4溶液，室温搅拌1min；将溶液在75℃油浴中加热搅拌85min得到金种溶液。然后向8mmolCTAB，0.04mmol HAuCl4，0.0008mmol AgNO3，1mmol HCl，0.07mmol AA的混合溶液中加入3mL上述金种溶液，并在28℃下振荡孵育1.8h得到Au NBPs溶液。
②向步骤①中所得的0.8mL，浓度为8nM的Au NBPs溶液中加入4μL，浓度为98μM的4-ATP溶液，在室温下孵育10h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到Au [email protected]溶液。
③表面肠毒素抗体(SEC-2)修饰：用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC-2至浓度为10μM，再加入步骤②中所得0.9mL，浓度为8nM的Au [email protected]溶液，室温下搅拌7h；反应结束后离心收集沉淀物，用BSA溶液重悬产物，室温下保存2h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为2nM的Au [email protected]/SEC-2溶液；
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将配制好的一系列浓度为1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与70μL Au [email protected]/SEC-2溶液在100μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育5h；之后加入8μL ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，室温下孵育5h；反应结束后用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。
实施例2
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面SEC-1的修饰：
①将0.005mmol Cr(NO3)2，1.3mmol Zn(NO3)2，0.025mmol Yb(NO3)2，0.0025mmolEr(NO3)2和0.25mmol锗酸铵溶液加入到1.5mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入16mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至8；在室温下超声25min，搅拌1h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在120℃下加热15h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水至少洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,YbNPs粉末；得到的ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的TEM如图1所示。
②将上述所得10mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于4mL浓度为5mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌12h；离心收集下层沉淀，将其分散在4mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入50μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在80℃水浴中加热搅拌24h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③5μL ZGGO:Cr,Er,Yb溶液、15μL浓度为23％的戊二醛、30μL浓度为25mM的NaBH4溶液在室温下孵育55min，反应结束后离心洗涤去除未完全吸附的戊二醛。沉淀物用PBS缓冲溶液复溶，加入55μL浓度为12μM的SEC-1溶液，室温下振荡孵育5.5h，离心并用BSA溶液重悬产物，室温下保存4.5h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为0.9mg/mL的ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液；
2，Au NBPs的制备及表面SEC-2的修饰：
①首先向0.25mM HAuCl4，50mM CTAC，5mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的25mMNaBH4溶液，室温搅拌2min；将溶液在80℃油浴中加热搅拌90min得到金种溶液。然后向10mmol CTAB，0.05mmol HAuCl4，0.0010mmol AgNO3，2mmol HCl，0.08mmol AA的混合溶液中加入3.5mL上述金种溶液，并在30℃下振荡孵育2h得到Au NBPs溶液。得到的Au NBPs的TEM如图2所示。
②向步骤①中所得的1.0mL，浓度为10nM的Au NBPs溶液中加入5μL，浓度为100μM的4-ATP溶液，在室温下孵育11h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到Au [email protected]溶液。
③用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC-2至浓度为12μM，再加入步骤②中所得1mL，浓度为10nM的Au [email protected]溶液，室温下搅拌7.5h；反应结束后离心收集沉淀物，用BSA溶液重悬产物，室温下保存2.5h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为2.5nM的[email protected]/SEC-2溶液；
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将配制好的浓度为1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与80μL Au [email protected]/SEC-2溶液在125μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育5.5h；之后加入10μL ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，室温下孵育5.5h；反应结束后用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。实验结果见图4。
实施例3
1，ZGGO:Cr,Er,Yb NPs的合成及表面SEC-1的修饰：
①将0.006mmol Cr(NO3)2，1.4mmol Zn(NO3)2，0.03mmol Yb(NO3)2，0.003mmol Er(NO3)2和0.3mmol锗酸铵溶液加入到1.6mmol Ga(NO3)2溶液中混合搅拌均匀后，得到溶液1，随后向溶液1中加入17mgCTAB，并用氨水调节溶液的pH值至9；在室温下超声30min，搅拌1.2h后转入聚四氟乙烯水热反应釜中，在130℃下加热16h；冷却至室温后，通过离心收集下层沉淀物，沉淀用超纯水洗涤三次，最后干燥研磨即得长余辉纳米粒子ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末；
②将上述所得12mg ZGGO:Cr,Er,Yb NPs粉末分散于5mL浓度为6mM的NaOH溶液中，室温下剧烈搅拌13h；离心收集下层沉淀，将其分散在5mL N,N-二甲基甲酰胺试剂中，然后逐滴加入80μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)试剂，在85℃水浴中加热搅拌26h，反应结束后离心收集产物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化ZGGO:Cr,Er,Yb NPs溶液；
③20μL ZGGO:Cr,Er,Yb溶液、20μL浓度为25％的戊二醛、40μL浓度为26mM的NaBH4溶液在室温下孵育60min，反应结束后离心洗涤去除未完全吸附的戊二醛。沉淀物用PBS缓冲溶液复溶，加入60μL浓度为14μM的SEC-1溶液，室温下振荡孵育6h，离心并用BSA溶液重悬产物，室温下保存5h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中。反应结束后即得浓度为1mg/mL的ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液；
2，Au NBPs的制备及表面SEC-2的修饰：
①首先向0.3mM HAuCl4，52mM CTAC，6mM柠檬酸溶液中加入新鲜制备的26mM NaBH4溶液，室温搅拌3min；将溶液在85℃油浴中加热搅拌95min得到金种溶液。然后向12mmolCTAB，0.06mmol HAuCl4，0.0012mmol AgNO3，3mmol HCl，0.09mmol AA的混合溶液中加入4mL上述金种溶液，并在32℃下振荡孵育2.2h得到Au NBPs溶液。
②向步骤①中所得的1.2mL，浓度为12nM的Au NBPs溶液中加入6μL，浓度为102μM的4-ATP溶液，在室温下孵育12h；反应结束后离心收集沉淀物，并用超纯水洗涤3次，最终分散于超纯水中，得到Au [email protected]溶液。
③用TBE缓冲液稀释肠毒素抗体SEC-2至浓度为14μM，再加入步骤②中所得1.2mL，浓度为12nM的Au [email protected]溶液，室温下搅拌8h；反应结束后离心收集沉淀物，用BSA溶液重悬产物，室温下保存3h，封闭未结合抗体的结合位点。反应结束后离心收集沉淀物，用超纯水至少清洗三次，最后将沉淀物重新均匀分散在PBS缓冲溶液中，即得浓度为3nM的[email protected]/SEC-2溶液；
3，荧光拉曼双重光谱分析方法的构建：
将配制好的浓度为1pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL的SEC标准溶液分别与90μL Au [email protected]/SEC-2溶液在150μLPBS缓冲液中混合，室温下孵育6h；之后加入12μL ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液，室温下孵育6h；反应结束后用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次；通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。
测试例
1，检测方法的特异性研究：
取80μL Au [email protected]/SEC-2溶液在125μL PBS缓冲液中搅拌混匀，将浓度为200pg/mL的不同干扰物质包括BSA、CEA、L-半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸以及浓度为1ng/mL的SEC分别加入到反应体系中，在室温下振荡5.5h；之后加入10μL ZGGO:Cr,Er,Yb/SEC-1溶液。之后使用254nm紫外灯照射，通过荧光光谱仪测试每组溶液的发光光谱，每组溶液测三次。仅存在1ng/mL SEC时溶液的发光强度明显增强，其余非特异性分子未见明显变化；由此说明，当检测环境中存在其他高浓度的干扰物时，发光强度不因其他物质存在而发生明显的增强或减弱。通过拉曼光谱仪测试每组溶液的拉曼光谱，每组溶液测三次。仅存在1ng/mL SEC时溶液的拉曼信号增强，其余非特异性分子未见明显变化；这表明开发的传感器对SEC具有良好的特异性。
2，检测方法的准确性研究：
1mL正常人血液在400rpm转速下离心5min后吸取上层血清，体积为0.5mL。用PBS溶液将血清稀释到1mL。样品1，样品2，样品3，样品4的人血清中添加的SEC标准样品的浓度分别为10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL和10ng/mL。将50μL制备好的加标血清试样加入到实施例2的检测体系中孵育。反应结束后测得血清中SEC的回收率在98.0％-101.2％的范围内。这一实验结果表明了本方法具有很高的准确性，可以实现在血液样品中SEC的准确定量检测。