阅读说明：本技术 一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法 (Method for rapidly identifying bacteria and fungi by using Raman spectrum ) 是由 徐晓刚 王明贵 衣晓飞 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法,对待鉴别的样品进行前处理,对处理后的样品进行拉曼图谱采集,对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理,利用处理后的图谱进行细菌真菌鉴别。与现有技术相比,本发明方法操作简单,在进行拉曼测试前不需要进行复杂的样品前处理。本方法测试所需菌量少,不需要进行增菌培养,可大大缩短检测时间,快速给出鉴别结果。利用细胞的拉曼图谱可以反应细胞化学成分的特点,通过比较细菌和真菌的拉曼图谱的特异峰位来准确鉴别细菌和真菌,可排除肉眼观察细胞形态大小并主观判断造成的误差。(The invention relates to a method for rapidly identifying bacteria and fungi by utilizing Raman spectrum, which comprises the steps of pretreating a sample to be identified, collecting a Raman spectrum of the treated sample, removing background and normalizing the collected Raman spectrum, and identifying bacteria and fungi by utilizing the treated spectrum. Compared with the prior art, the method is simple to operate, and does not need to carry out complicated sample pretreatment before carrying out Raman test. The method needs less bacteria for testing, does not need bacteria enrichment culture, can greatly shorten the detection time and quickly give an identification result. The characteristic that the Raman spectrum of the cell can reflect the chemical components of the cell is utilized, the bacteria and the fungi are accurately identified by comparing the specific peak positions of the Raman spectra of the bacteria and the fungi, and errors caused by the observation of the shape and the size of the cell by naked eyes and the subjective judgment can be eliminated.)

一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法

技术领域

本发明属于微生物鉴定技术领域，尤其是涉及一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法。

背景技术

细菌和真菌的鉴别具有非常重要的临床意义，感染早期对细菌和真菌感染作出鉴别可以帮助临床医生制定针对性治疗方案，为临床选择有效抗菌药物提供参考，以减少广谱抗菌药物的不恰当使用，同时降低患者的经济负担。

常用的细菌和真菌鉴别方法主要有染色法、生化法和免疫学、分子生物学检测法。临床用于细菌和真菌判别的染色法主要是革兰染色法，染色后真菌为革兰氏阳性，呈现深紫色，大小约10～100μm；***和革兰氏阴性细菌分别呈现深紫色和红色，大小约1-10μm，通过镜下观察菌体形态大小可初步鉴别细菌和真菌，但这种方法不适用于体积比较小的真菌鉴别，且依靠人工判读，容易出现错误。生化法是临床细菌和真菌鉴定的“金标准”，该方法尽管较为准确，但耗时较长，难以满足临床需求。应用免疫学和分子生物学技术进行感染微生物检测为培养时间长、难培养或不能培养的微生物鉴定提供了一个重要手段，使感染的诊断早期、快速、准确。但这两种方法检测成本高、且对实验室要求高，很多医院不能满足检测条件。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，对待鉴别的样品进行前处理，对处理后的样品进行拉曼图谱采集，对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，利用处理后的图谱进行细菌真菌鉴别。

进一步地，所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法包括以下步骤：

(1)样品前处理

对待鉴别的样品，采用离心方法去除培养液和血液，然后加入无菌水洗涤，离心去除上清后将菌液重悬，重悬液滴加到低拉曼背景载玻片上，室温风干后进行拉曼检测；

(2)拉曼图谱采集

使用共聚焦显微拉曼光谱仪，采集菌体单细胞拉曼图谱；

(3)拉曼图谱预处理

对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，处理后的图谱才可用于后续数据分析；

(4)细菌真菌鉴别

选择两种方法中的一种或两种方法结合使用进行细菌和真菌的判别：一种是通过比较细菌和真菌的指纹区特异峰位判别细菌真菌；另一种是通过机器学习算法对已知分类的拉曼图谱数据进行训练，建立细菌真菌鉴定数据库，将新的数据代入库中进行测试鉴定。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述待鉴别的样品包括纯培养的菌液或者临床感染标本，临床感染标本包括感染尿液、报阳血液等。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用无菌水洗涤的次数建议3遍以上。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片包括单晶CaF₂载玻片、BaF₂载玻片或镀铝玻璃载玻片等。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No 1001。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，使用共聚焦拉曼显微镜测试前进行硅片校准，使硅的拉曼谱峰位移在520.73cm，在显微镜视野中找到菌体。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，拉曼图谱采集时设置采集条件为：使用532nm激光器，激光功率设置为4～15mW，积分时间5～20s，设置图谱采集范围包括细胞的指纹区图谱300～1800cm^-1。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，为增加鉴定准确率，建库时每株菌的拉曼图谱采集数量大于200个，测试数据大于10个。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，所述去除背景可选择线性或多项式两种算法，分别设置阶次和点数，归一化处理可选择除以图谱面积或者除以最大值，需要注意的是在去除背景和归一化处理过程中，保证对所有图谱进行相同处理。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，关于细菌和真菌的指纹区特异峰位选取，经测试分析真菌含有的特异物质有仅分布于线粒体中的Cytochrome C，其拉曼位移在750cm^-1、1128cm^-1、1583cm^-1，细菌的特异峰位有位于810cm^-1和1240cm^-1的两个最典型的RNA峰及位于1480cm^-1的酰胺II峰，利用这些特异峰位，可准确鉴别细菌和真菌。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，机器学习算法包括PCA-DFA(Principlecomponent analysis-Discriminant function analysis)、PCA-SVM(Principlecomponent analysis-Support vector machines)、CNN(Convolutional NeuralNetworks)。

在进行DFA和SVM分析前，先进行PCA分析，对多维数据进行降维，然后再利用DFA分析或SVM分析对降维后的复杂的变量进行线性重组，把复杂简单化，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化，这些变化是可转移的，所以在有新的数据代入时可以套用。CNN是深度学习(deep learning)的代表算法之一，具有表征学习能力，采用mxnet深度学习框架，构建DenseNet(稠密连接网络)神经网络，进行深度网络学习和训练。传统的卷积网络中每一层只使用前一层的输出特征作为它的输入，DenseNet中每一层使用前面所有层的特征作为输入，它自己的特征作为所有后续层的输入。DenseNet有以下几个优点：减轻了梯度弥散带来的问题、增强了特征的传播、鼓励特征重用、大大减少了参数量。

拉曼光谱是一种振动光谱技术，定义为：当入射光子与分子发生非弹性碰撞，激光能量发生变化，能量从分子转移到光子或反之，散射光子的能量比入射光子的能量少或多，这就是非弹性拉曼散射。入射光和拉曼散射光之间的频率差称为拉曼位移，它对于单个分子是唯一的，由机器探测器测量，并表示为1/cm。拉曼位移与化学键振动频率对应，即为分子振动的指纹信息。拉曼光谱能反映出样品的化学成分，所含官能团及化学反应所带来变化等，从而反映细胞的分子特征。因此，本申请通过对细胞分子图谱数据的分析，得到细胞的特异性信息。

细菌和真菌分别属于为原核生物和真核生物，真菌相比于细菌，胞内含有丰富的细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体等，组成细胞的生物大分子也存在差异。基于这些生物大分子的差异，真菌的拉曼图谱较细菌也会存在特异性拉曼谱峰。通过这些特异性的谱峰可以快速鉴别细菌和真菌。

另外本发明还可以将拉曼图谱与机器学习结合，通过机器学习对两种菌的拉曼图谱进行训练，建立细菌真菌拉曼图谱库，将测试数据代入也可快速准确判别细菌和真菌。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本方法操作简单，在进行拉曼测试前不需要进行复杂的样品前处理。

(2)本方法测试所需菌量少，不需要进行增菌培养，可大大缩短检测时间，快速给出鉴别结果。

(3)利用细胞的拉曼图谱可以反应细胞化学成分的特点，通过比较细菌和真菌的拉曼图谱的特异峰位来准确鉴别细菌和真菌，可排除肉眼观察细胞形态大小并主观判断造成的误差。

(4)通过机器学习建立真菌和细菌的拉曼图谱库，将新采集的图谱数据直接代入库中进行判别，机器学习判别和特异峰判别两种判别方法结合更能保障鉴别结果的准确性。

附图说明

图1细菌和真菌指纹区拉曼图谱及特异峰[真菌(Fungus)：(白念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌(C.krusei)、***滑念珠菌(C.parapsilosis)、.光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis)，细菌(Bacteria)：大肠埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、金黄葡萄球菌(S.aureus)、粪肠球菌(E.faecalis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)]；

图2细菌和真菌指纹区拉曼图谱PCA分析图；

图3细菌和真菌指纹区拉曼图谱DFA分析图。

具体实施方式

本发明提供一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

对待鉴别的样品，采用离心方法去除培养液和血液，然后加入无菌水洗涤，离心去除上清后将菌液重悬，重悬液滴加到低拉曼背景载玻片上，室温风干后进行拉曼检测；

(2)拉曼图谱采集

使用共聚焦显微拉曼光谱仪，采集菌体单细胞拉曼图谱；

(3)拉曼图谱预处理

对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，处理后的图谱才可用于后续数据分析；

(4)细菌真菌鉴别

选择两种方法中的一种或两种方法结合使用进行细菌和真菌的判别：一种是通过比较细菌和真菌的指纹区特异峰位判别细菌真菌；另一种是通过机器学习算法对已知分类的拉曼图谱数据进行训练，建立细菌真菌鉴定数据库，将新的数据代入库中进行测试鉴定。

在其中一个实施方式中，步骤(1)中，所述待鉴别的样品包括纯培养的菌液或者临床感染标本，临床感染标本包括感染尿液、报阳血液等。

在其中一个实施方式中，步骤(1)中，用无菌水洗涤的次数建议3遍以上。

在其中一个实施方式中，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片包括单晶CaF₂载玻片、BaF₂载玻片或镀铝玻璃载玻片等。

在其中一个实施方式中，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No 1001。

在其中一个实施方式中，步骤(2)中，使用共聚焦拉曼显微镜测试前进行硅片校准，使硅的拉曼谱峰位移在520.73cm，在显微镜视野中找到菌体。

在其中一个实施方式中，步骤(2)中，拉曼图谱采集时设置采集条件为：使用532nm激光器，激光功率设置为4～15mW，积分时间5～20s，设置图谱采集范围包括细胞的指纹区图谱300～1800cm^-1。

在其中一个实施方式中，步骤(2)中，为增加鉴定准确率，建库时每株菌的拉曼图谱采集数量大于200个，测试数据大于10个。

在其中一个实施方式中，步骤(3)中，所述去除背景可选择线性或多项式两种算法，分别设置阶次和点数，归一化处理可选择除以图谱面积或者除以最大值，需要注意的是在去除背景和归一化处理过程中，保证对所有图谱进行相同处理。

在其中一个实施方式中，步骤(4)中，关于细菌和真菌的指纹区特异峰位选取，经测试分析真菌含有的特异物质有仅分布于线粒体中的Cytochrome C，其拉曼位移在750cm^-1、1128cm^-1、1583cm^-1，细菌的特异峰位有位于810cm^-1和1240cm^-1的两个最典型的RNA峰及位于1480cm^-1的酰胺II峰，利用这些特异峰位，可准确鉴别细菌和真菌。

在其中一个实施方式中，步骤(4)中，机器学习算法包括PCA-DFA(Principlecomponent analysis-Discriminant function analysis)、PCA-SVM(Principlecomponent analysis-Support vector machines)、CNN(Convolutional NeuralNetworks)。

在进行DFA和SVM分析前，先进行PCA分析，对多维数据进行降维，然后再利用DFA分析或SVM分析对降维后的复杂的变量进行线性重组，把复杂简单化，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化，这些变化是可转移的，所以在有新的数据代入时可以套用。CNN是深度学习(deep learning)的代表算法之一，具有表征学习能力，采用mxnet深度学习框架，构建DenseNet(稠密连接网络)神经网络，进行深度网络学习和训练。传统的卷积网络中每一层只使用前一层的输出特征作为它的输入，DenseNet中每一层使用前面所有层的特征作为输入，它自己的特征作为所有后续层的输入。DenseNet有以下几个优点：减轻了梯度弥散带来的问题、增强了特征的传播、鼓励特征重用、大大减少了参数量。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

选取5种临床分离真菌(3株白念珠菌(Candida albicans)、3株克柔念珠菌(Candida krusei)、3株***滑念珠菌(Candida parapsilosis)、3株光滑念珠菌(Candidaglabrata)、3株热带念珠菌(Candida tropicalis)，共15株菌)和7种临床分离细菌(2株大肠埃希菌(Escherichia coli)、1株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、1株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、1株鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、2株金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、1株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、1株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，共9株)，所有菌株均来自复旦大学附属华山医院抗生素研究所。每株菌各取1ml纯培养菌液，7000rpm离心2min，弃上清，将沉淀用去离子水洗涤3遍，取2μL洗涤后的菌液在镀铝玻璃载玻片上点样，室温风干后进行拉曼检测。

使用Witec alpha 300共聚焦拉曼光谱仪进行细菌和真菌拉曼信号采集，选择532nm激光器作为入射光源，光栅选择1200g/mm，光谱范围279～2187cm^-1，根据菌株种类不同，设置适当的激光功率(4～15mW)和积分时间(5～20s)，先对24株菌进行第一批次数据的采集，每株菌采集200个拉曼单谱，对所有图谱进行统一的去背景(线性，阶次：10，最大点数：64)和归一化(/面积)处理，然后根据拉曼图谱寻找细菌和真菌的特异峰(如图1)，特异峰代表的物质见表1。

表1细菌和真菌特异峰及所代表的物质

同时将24株的拉曼图谱数据分成两组，真菌组和细菌组，使用PCA-DFA算法建立细菌真菌拉曼图谱库，PCA主成分分析图(图2)和DFA判别函数分析图(图3)表明细菌和真菌可以明显区分开。然后采集24株菌的第二批拉曼图谱数据，根据第一批数据找到峰特异峰判别菌株种类，同时将第二批数据代入前面建立的细菌真菌拉曼图谱库，鉴定每株菌的种类，24株菌鉴定准确率均为100％(见表2)。

表2 24株菌PCA-DFA分析鉴定结果

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。