一种脱细胞血管基质及其制备方法
阅读说明：本技术 一种脱细胞血管基质及其制备方法 (Acellular vascular matrix and preparation method thereof ) 是由 赵子建 王建英 于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及组织工程领域,具体涉及一种脱细胞血管基质及其制备方法,在脱细胞处理步骤中,使用含有[9,9’-二-9H-芴]-9,9’-二甲醛的工作液孵育待用血管组织器官,以脱除细胞,在减少脱细胞所需的时间中有巨大的应用潜力,并且可以在完全去除血管外膜、中膜及内膜中的所有细胞时,并保留完整的三维结构及细胞外基质组分,具有低免疫原性、低细胞毒性和良好的力学性能。(The invention relates to the field of tissue engineering, in particular to a decellularized vascular matrix and a preparation method thereof, wherein in the step of decellularization treatment, working solution containing [9,9 '-bi-9H-fluorene ] -9,9' -dicarboxaldehyde is used for incubating a to-be-used vascular tissue organ to remove cells, so that the decellularized vascular matrix has huge application potential in reducing the time required by decellularization, can retain complete three-dimensional structures and extracellular matrix components when all cells in vascular adventitia, media and intima are completely removed, and has low immunogenicity, low cytotoxicity and good mechanical properties.)
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种脱细胞血管基质及其制备方法。
背景技术
调查显示心血管疾病是全球病患死亡的首要原因。目前，心血管疾病的主要治疗手段主要有以下4种，即药物治疗、调整生活习惯、介入治疗和冠状动脉旁路移植术。其中，冠状动脉旁路移植术所用的桥血管主要有自体血管和人工血管。自体血管是血管旁路移植材料的金标准，常用的自体血管主要有内乳动脉，挠动脉和大隐静脉，但自体血管来源有限，且给患者带来二次创伤，此外，许多患者由于存在其他血管疾病，导致无正常的血管可供自体移植。人工血管主要有三种：异种脱细胞基质，天然高分子材料(胶原，明胶和壳聚糖等)，和合成高分子材料(尼龙、涤纶和聚四氟乙烯)。高分子材料制备的人工血管对高流量低阻力血管如胸腹主动脉等大血管具有良好的临床效果。然而由高分子材料制备的小直径血管弹性和顺应性差，缺乏抗血栓表面，导致构建的小直径血管(<6mm)持续受到内膜增生和血栓形成等问题的困扰。应用物理或化学方法将异种组织进行脱细胞处理，去除组织移植过程中引起排斥反应的细胞成分，保留细胞外基质(ECM)成分和完整的支架结构的异种脱细胞基质已广泛用于真皮、心脏瓣膜等生物组织，并已经取得了不错的临床效果，且由于其具有来源丰富、价格低廉的优势，因此，近年来脱细胞组织基质作为修复损伤组织的一种新型修复材料，在组织工程中越来越受到重视。
ECM成分包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖和生长因子。最大限度的保持ECM超微结构和组成成分将保证脱细胞基质的机械性能和生物性能。目前的脱细胞方法主要是化学方法和物理方法。化学方法使用试剂脱除细胞，如酸碱试剂、低渗高渗溶液、洗涤剂；生物试剂，如酶类、非酶类因子。物理方法如反复冻融、机械力学处理。如中国专利文献CN108904884A中公开的一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，主要使用反复冻融和去污剂配合使用脱除细胞。再如中国专利文献CN109529121A中的一种脱细胞血管基质及其制备方法使用低渗处理、胰蛋白酶、去污剂配合处理脱细胞。上述方法均可以达到不同程度的脱细胞效果，低毒性，一定程度上保持了良好的机械性能。然而，使用上述的化学方法或物理方法或两者配合仍然改变ECM，破坏ECM超微结构，导致细胞外基质组分如胶原蛋白，糖胺聚糖，生长因子等的降解，脱细胞基质机械性能和生物性能难以满足临床治疗效果。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞基质机械性能和生物性能难以满足临床治疗效果的缺陷，从而提供一种脱细胞血管基质及其制备方法，在完全去除血管外膜、中膜及内膜中的所有细胞时，并保留完整的三维结构及细胞外基质组分，具有低免疫原性、低细胞毒性和良好的力学性能。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种脱细胞血管基质制备方法，在脱细胞处理步骤中，使用含有[9,9'-二-9H-芴]-9,9'-二甲醛(简写为Raptinal)的工作液孵育待用血管组织器官，以脱除细胞。
优选的，在所述工作液中，[9,9'-二-9H-芴]-9,9'-二甲醛的浓度为10μmol/L-20μmol/L。
优选的，在所述工作液中还包括细胞培养基，如MEM培养基。
所述工作液的制备方法，包括将[9,9’-二-9H-芴]-9,9’-二甲醛溶于有机溶剂中，得到母液；向所得的母液中加入细胞培养基，将[9,9’-二-9H-芴]-9,9’-二甲醛稀释至设定浓度。优选的，所述有机溶剂可以为二甲基亚砜(DMSO)。
在脱细胞步骤中，孵育条件为室温下孵育24h-48h。
优选的，所述脱细胞血管基质制备方法，包括：将待用血管组织器官进行预处理；
脱细胞处理；
清洗处理；
高渗-低渗处理，清洗，重复高渗-低渗处理至少一次；
核酸处理；
清洗处理；
消毒处理。
优选的，在所述核酸处理步骤中，将待用血管组织器官置于脱氧核糖核酸酶I(DNase I)溶液中孵育6-12小时，孵育温度为37℃；所述脱氧核糖核酸酶I溶液为含160U/ml-320U/ml脱氧核糖核酸酶I，10mM-20mM氯化镁且pH为7.5的50mM Tris-Hcl溶液。
优选的，所述消毒处理步骤为将待用血管组织器官置于体积百分比为75％的酒精中浸泡30分钟，然后在PBS中振荡清洗12小时，温度为37℃，循环清洗3-5次。
优选的，所述清洗步骤中，将待用血管组织器官使用超声清洗1-3次，每次5-10分钟，超声条件为频率25KHZ-45KHZ,温度37℃-45℃。
优选的，所述高渗-低渗处理为用45-55mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(3)中的待用血管组织振荡(210-230rpm)清洗10-14h，再用5-15mM Tris-HCL(低渗溶液)将所述待用血管组织振荡(210-230rpm)清洗10-14h。
第二方面，本发明提供了一种如所述的制备方法制备得到的异种脱细胞基质。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种脱细胞血管基质制备方法，申请人研究发现Raptinal药物与其他促细胞凋亡的药物相比，可更为快速的诱导细胞凋亡，其作用机理为通过线粒体途径诱导细胞凋亡，申请人评估了众多诱导细胞凋亡药物如激酶抑制剂(星形孢菌素和雷帕霉素)，微管蛋白抑制剂(紫杉醇，长春新碱，秋水仙碱)，拓扑异构酶抑制剂(喜树碱，依托泊苷，多柔比星)，DNA烷化剂(丝裂霉素C，顺铂，MNNG)，内质网/蛋白酶体抑制剂(geldana-mycin，thapsigargin，tunicamycin)，ROS诱导剂(鱼藤酮，抗霉素A)，以及直接靶向细胞凋亡途径成分的药物，如Bcl-2抑制剂(棉酚)，XIAP抑制剂(SM-164)，凋亡体启动子(AA2)和直接的半胱天冬酶-3激活剂(PAC-1和1541/1541B)等，所有化合物均使用10uM的浓度处理U-937细胞1小时，结果发现Raptinal完全激活胱天蛋白酶原-3与胱天蛋白酶-3，1541(是一种促细胞凋亡药物)部分激活胱天蛋白酶原-3与胱天蛋白酶-3，而其他试剂未激活procaspase-3，表明Raptinal诱导细胞凋亡的速度异常迅速，在减少脱细胞所需的时间中有巨大的应用潜力，并且Raptinal在不破坏血管细胞外基质的情况下，可以靶向破坏血管组织中的细胞成分，在完全去除血管外膜、中膜及内膜中的所有细胞时，并保留完整的三维结构及细胞外基质组分，本发明制备的脱细胞血管基质具有低免疫原性、低细胞毒性和良好的力学性能的优势，是一种较为理想的血管移植物。
2.本发明提供的一种脱细胞血管基质制备方法，包括：将待用血管组织器官进行预处理；脱细胞处理；清洗处理；高渗-低渗处理，清洗，重复高渗-低渗处理至少一次；核酸处理；清洗处理；消毒处理；上述方法中，首先用Raptinal溶液诱导组织中的细胞成分凋亡破裂，再用高渗溶液和低渗溶液交替冲洗，去除细胞蛋白和DNA，最后用DNaseI溶液裂解核酸序列并清除细胞裂解后的核酸物质以达到较好的脱细胞效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例中HE染色结果；图中A图为天然血管，B图为异种脱细胞血管基质(图中的标尺是100μm)；
图2是本发明实验例中DAPI染色结果；图中A图为天然血管，B图为异种脱细胞血管基质；
图3是本发明实验例中DNA残留检测结果；
图4是本发明实验例中Masson三色染结果；图中A图为天然血管，B图为异种脱细胞血管基质(图中的标尺是100μm)；
图5是本发明实验例中EVG染色结果；图中A图为天然血管，B图为异种脱细胞血管基质(图中的标尺是100μm)；
图6是本发明实验例中阿尔新蓝染色结果；图中A图为天然血管，B图为异种脱细胞血管基质(图中的标尺是100μm)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的血管组织为成年健康猪颈动脉，用含抗生素(Penicillin-Streptomycin，Gibco，美国，按体积比所用浓度为2％-5％)的磷酸盐缓冲液(PBS)(PH＝7.4)冲洗管腔，将管腔内的血液清除干净，再轻柔剥除其外层的疏松结缔组织，即得待用的血管组织。
Raptinal购自sigma aldrich，美国；
DMSO，AR(分析纯)，阿拉丁；
Minimum Eagle’s Medium(MEM)培养基购自Gibco，美国；
完全培养基为含10％胎牛血清(FBS)(Gibco，美国)的MEM培养基；
本发明所述的室温温度范围为10-30℃；
DNase I溶液购自sigma aldrich，美国；
2％三氯化铁溶液配制方法(所购买的EVG染色试剂盒(谷歌生物，货号G1042)中包含10％三氯化铁，用蒸馏水稀释至2％)。
实施例1异种脱细胞血管基质的制备
本实施例提供了一种异种脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)将待用血管组织进行预处理，将血管组织加入超纯水中超声条件为频率35KHZ,温度41℃，清洗2次，每次5分钟；
(2)将Raptinal溶于DMSO中，配成含20mmol/L的Raptinal的母液，再用MinimumEagle’s Medium(MEM)培养基将含20mmol/L的Raptinal的母液稀释成含10μmol/L的Raptinal的工作液，室温(25℃)下将待用血管组织在含10μmol/L的Raptinal的工作液中孵育24小时；
(3)然后将步骤(2)中的待用血管组织加入超纯水中超声条件为频率35KHZ,温度41℃，清洗2次，每次5分钟；
(4)用50mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(3)中的待用血管组织振荡(220rpm)清洗12h，再用10mM Tris-HCL(低渗溶液)将所述待用血管组织振荡(220rpm)清洗12h；
(5)将步骤(4)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗2次，每次5分钟，超声条件为频率35KHZ,温度41℃；
(6)用50mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(5)中的待用血管组织振荡(220rpm)清洗12h，再用10mM Tris-HCL(低渗溶液)将血管组织振荡(220rpm)清洗12h；
(7)将步骤(6)中的待用血管组织在160U/ml DNase I溶液中孵育6小时，孵育温度为37℃，DNase I溶液为含有160U/ml DNase I，10mM氯化镁且PH为7.5的50mM Tris-Hcl溶液；
(8)将步骤(7)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗2次，每次5分钟，超声条件为频率35KHZ,温度41℃；
(9)将步骤(8)中的待用血管组织在体积百分比75％酒精中浸泡30分钟，然后将血管组织在PBS(PH＝7.4)中振荡(100rpm)清洗12小时，温度为37℃，循环3次，即得异种脱细胞血管基质；
(10)将步骤(9)中制备好的异种脱细胞血管基质放在-20℃冰箱保存备用。
实施例2异种脱细胞血管基质的制备
本实施例提供了一种异种脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)将待用血管组织进行预处理，将血管组织加入超纯水中超声条件为频率25KHZ,温度45℃，清洗2次，每次5分钟；
(2)将Raptinal溶于DMSO中，配成含20mmol/L的Raptinal的母液，再用MinimumEagle’s Medium(MEM)培养基将含20mmol/L的Raptinal的母液稀释成含10μmol/L的Raptinal的工作液，室温(25℃)下将待用血管组织在含10μmol/L的Raptinal的工作液中孵育26小时；
(3)然后将步骤(2)中的待用血管组织加入超纯水中超声条件为频率25KHZ,温度45℃，清洗1次，每次5分钟；
(4)用45mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(3)中的待用血管组织振荡(220rpm)清洗12h，再用5mM Tris-HCL(低渗溶液)将所述待用血管组织振荡(230rpm)清洗12h；
(5)将步骤(4)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗1次，10分钟，超声条件为频率25KHZ,温度45℃；
(6)用45mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(5)中的待用血管组织振荡(210rpm)清洗14h，再用5mM Tris-HCL(低渗溶液)将血管组织振荡(220rpm)清洗14h；
(7)将步骤(6)中的待用血管组织在320U/ml DNase I溶液中孵育12小时，孵育温度为37℃，DNase I溶液为含有320U/ml DNase I，20mM氯化镁且PH为7.5的50mM Tris-Hcl溶液。
(8)将步骤(7)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗1次，10分钟，超声条件为频率25KHZ,温度45℃；
(9)将步骤(8)中的待用血管组织在体积百分比75％酒精中浸泡20分钟，然后将血管组织在PBS(PH＝7.4)中振荡(110rpm)清洗10小时，温度为37℃，循环5次，即得异种脱细胞血管基质；
(10)将步骤(9)中制备好的异种脱细胞血管基质放在-20℃冰箱保存备用。
实施例3异种脱细胞血管基质的制备
本实施例提供了一种异种脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)将待用血管组织进行预处理，将血管组织加入超纯水中超声条件为频率45KHZ,温度37℃，清洗3次，每次5分钟；
(2)将Raptinal溶于DMSO中，配成含20mmol/L的Raptinal的母液，再用MinimumEagle’s Medium(MEM)培养基将含20mmol/L的Raptinal的母液稀释成含10μmol/L的Raptinal的工作液，室温(25℃)下将待用血管组织在含10μmol/L的Raptinal的工作液中孵育24小时；
(3)然后将步骤(2)中的待用血管组织加入超纯水中超声条件为频率45KHZ,温度37℃，清洗3次，每次7分钟；
(4)用55mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(3)中的待用血管组织振荡(230rpm)清洗10h，再用15mM Tris-HCL(低渗溶液)将所述待用血管组织振荡(220rpm)清洗10h；
(5)将步骤(4)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗1次，每次10分钟，频率45KHZ,温度37℃；
(6)用55mM Tris-HCL(高渗溶液)将步骤(5)中的待用血管组织振荡(210rpm)清洗10h，再用15mM Tris-HCL(低渗溶液)将血管组织振荡(220rpm)清洗10h；
(7)将步骤(6)中的待用血管组织在240U/ml DNase I溶液中孵育6小时，孵育温度为37℃，DNase I溶液为含有240U/ml DNase I，15mM氯化镁且PH为7.5的50mM Tris-Hcl溶液。
(8)将步骤(7)中的待用血管组织加入超纯水中超声清洗2次，每次5分钟，频率45KHZ,温度37℃；
(9)将步骤(8)中的待用血管组织在体积百分比75％酒精中浸泡40分钟，然后将血管组织在PBS(PH＝7.4)中振荡(90rpm)清洗14小时，温度为37℃，循环4次，即得异种脱细胞血管基质；
(10)将步骤(9)中制备好的异种脱细胞血管基质放在-20℃冰箱保存备用。
实验例异种脱细胞血管基质的生物学评价
1方法
1.1苏木素-伊红(HE)
(1)石蜡切片(所述切片均包含天然血管组织待用的成年健康猪颈动脉和实施例1制备的异种脱细胞血管基质)于二甲苯中脱蜡10min，脱蜡2次，依次入无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇中各3min，自来水冲洗5min；
(2)苏木素染液染5min，自来水冲洗5min；
(3)1％盐酸酒精分化数秒，然后水洗1min；
(4)入伊红染液染1min。
(5)无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇，体积百分比85％乙醇，体积百分比75％乙醇脱水各3min，二甲苯透明3分钟，透明2次。中性树胶封片，镜检(leica正置显微镜，DM500)。
1.2 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色
(1)石蜡切片(所述切片均包含天然血管组织待用的成年健康猪颈动脉和实施例1制备的异种脱细胞血管基质)于二甲苯中脱蜡10min，脱蜡2次，依次入无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇，体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇各3min，自来水冲洗5min。
(2)加DAPI工作液，室温避光孵育10min，然后PBS漂洗三次，每次5min。
(3)水溶性封片剂封片后荧光显微镜(型号LEICA，DM 2500LED型正置荧光显微镜))下观察。
1.3 DNA残留检测(DNA提取试剂盒为PrepResidual DNA SamplePreparation Kit，Thermo Fisher，美国)
(1)测试样品准备：取实施例1制备的异种脱细胞血管基质作为测试样品，天然血管(为未经处理的待用的血管组织)作为对照，每组检测样品各取3个平行样，剪碎装填于1.5ml的无菌离心管内，再取3个相同质量的平行样，3份用于实验，3份用于冷冻干燥称重；
(2)DNA提取：
1)蛋白酶K消化：将10μl蛋白酶K和60μl蛋白酶K缓冲液(10×)混合制成消化液，每个检测样品中加入70μl消化液，于56℃水浴槽内消化，至待测样品完全消化，无肉眼可见颗粒样物为止。
2)向上述消化后的各组加400μl裂解液，涡旋10s，静置10min，直至完全溶解。
3)加入磁珠液30μl(37℃水浴预热)，震荡10min。
4)加入400μl结合液(为所购买DNA提取试剂盒中包含的试剂，Thermo Fisher，美国)，室温下震荡孵育10min。
5)离心(12000rpm/min)5s，置于磁力架，静置5min。
6)弃上清液，加300μl洗涤液，涡旋10s，快速离心(12000rpm/min)15s，置于磁力架，静置1min。
7)重复3)-5)步骤，再漂洗DNA至少2次，最后一次快速离心(12000rpm/min)25s，收集磁珠。
8)在弃上清后，室温离心管敞口放置干燥，不得超过5min。
9)加100μl溶出液，涡旋震荡5min，70℃水浴5min(中途涡旋)。
10)快速离心(12000rpm/min)25s，置于磁力架2min，将原各组转移上清液至新的一组离心管。
11)加50μl溶出液(为所购买的DNA试剂盒中包含的试剂，Thermo Fisher，美国)，涡旋震荡5min，70℃水浴5min(中途涡旋)。
12)重复10)步骤，在新的一组离心管中共获得150μl的溶出液，再将其涡旋混匀后快速离心25s，获得最终纯化后的DNA。(-20℃保存)
(3)DNA含量的测定(DNA检测试剂盒为Quant-iTTM PicodsDNAReagentand Kits，Thermo Fisher，美国)
1)标准曲线绘制：λDNA(100ng/μl)用1×TE缓冲液稀释50倍后浓度为2000ng/ml,再用1×TE缓冲液将浓度为2000ng/ml的λDNA稀释为0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml,400ng/ml,800ng/ml,将稀释好的标准品溶液以每孔125μl的量加入到96孔板中，每份3复孔。
2)将步骤(2)中获得的样品DNA用分光光度计测其浓度，按相应倍数稀释，将浓度范围控制在标准曲线内。
将稀释好的样品DNA以每孔125μl的量加入到96孔板中，每份3复孔。
3)荧光染色：将Reagent荧光染色液(所购买DNA检测试剂盒中包含的试剂，ThermoFisher，美国)稀释200倍后使用，分别于上述96孔板中加入稀释的Reagent荧光染色液125μl(与样品等体积混合)，震荡混匀后室温避光孵育5min，用荧光酶标仪测定，测定条件：以480nm为激发波长，520nm为发射波长，530nm为截止波长，以所得的数据作图分析。以1×TE缓冲液为样品测得的荧光强度为本底值，测定和记录各测定的孔的相对荧光强度(RFI)。
4)结果计算：首先对标准品及测试样品组进行测定，获得相对荧光强度值，取平均值，减去本底(只有1×TE缓冲液，无DNA时测得的RFI值)。利用标准品RFI值为纵坐标(Y)，添加量(ng/ml)为横坐标(X)，绘制标准曲线，获得回归方程：x＝(y-a1)/b1，R1 2。将样品的RFI值代入标准曲线中，得到其浓度值，浓度值乘所提取DNA的总体积及稀释倍数，则得到测试样品总DNA含量，单位为ng,再用测试样品总DNA含量除以样品总干重，即测试样品的DNA残留量(ng/mg)
1.4 Masson三色染
(1)石蜡切片(所述切片均包含天然血管组织待用的成年健康猪颈动脉和实施例1制备的异种脱细胞血管基质)于二甲苯脱蜡10min，脱蜡2次，依次入无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇各3min，自来水冲洗5min。
(2)切片入bouin液(Masson三色染试剂盒中所包含的试剂，索莱宝，货号为G1345)，37℃温箱内2h媒染，流水冲洗至切片上的黄色消失。
(3)天青石蓝滴染2-3min稍水洗。
(4)Mayer苏木素滴染8min稍水洗。
(5)酸性乙醇分化液(Masson三色染试剂盒中所包含的试剂，1％盐酸酒精)分化数秒，流水冲洗10min(反蓝)。
(6)丽春红品红染色8min，稍水洗。
(7)磷钼酸处理10min。
(8)倾去上液，切片不用水洗，直接滴入苯胺蓝染液5min。
(9)弱酸溶液处理2min。
(10)体积百分比95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水两次，每次5-10s.
(11)透明、封片
1.5 VERHOEFF’S VAN GIESON(EVG)染色
(1)石蜡切片(所述切片均包含天然血管组织待用的成年健康猪颈动脉和实施例1制备的异种脱细胞血管基质)于二甲苯中脱蜡10min，脱蜡2次，依次入无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇各3min，自来水冲洗5min。
(2)用配好的EVG染液(谷歌生物，货号G1042)温室染30min，至颜色呈深黑色。
(3)自来水冲洗，2％三氯化铁溶液分化10-20s，显微镜观察弹性纤维呈黑色，背景呈灰色。
(4)自来水洗，蒸馏水稍洗；Van Gieson's液(谷歌生物，货号G1042)复染3-5min。
(5)无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇脱水各3min，二甲苯透明3分钟，透明2次。中性树胶封片，镜检。
1.6细胞毒性检测
(1)血管组织灭菌处理：将实施例1制备的异种脱细胞血管基质和天然血管分别用5％的过氧乙酸处理3小时，再用无菌PBS清洗12小时。
(2)浸提液制备:将灭菌后的血管组织以6cm2/ml的密度浸泡于完全培养基中，37℃，100rpm，培养24h，完全培养基作为对照。
(3)细胞培养：小鼠成纤维细胞(L929)培养于5％CO2 37℃培养箱中至近汇合状态(铺板80％)；制成3×104个/ml细胞悬浮液接种于96孔板中，每个孔加100μl即3×103个细胞，接种孔6×3；待细胞长至近汇合状态，弃去培养基；
(4)浸提液接种：长好细胞的96孔板中每个孔分别加入100μl对照浸提液，对照组为完全培养基，5％CO2 37℃培养箱中继续培养24h，48h,72h.
(5)细胞毒性检测：CCK-8试剂盒测细胞增殖毒性检测：分别于浸提液培养细胞24h，48h,72h后将浸提液弃去，每孔加入新的100μl培养液(MEM完全培养基)和10μl CCK-8溶液，培养箱内孵育2h后测OD450。
(6)浸提液OD值/对照组OD值为相对增殖率。
1.7阿尔新蓝染色
(1)血管组织石蜡切片(所述切片均包含天然血管组织待用的成年健康猪颈动脉和实施例1制备的异种脱细胞血管基质)于二甲苯中脱蜡10min，脱蜡2次，再依次入无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇和体积百分比75％乙醇各3min，自来水冲洗5min。
(2)阿尔新蓝染液(谷歌生物，货号为G1027)染色10min,稍水洗。
(3)无水乙醇、无水乙醇、体积百分比95％乙醇、体积百分比85％乙醇、体积百分比75％乙醇脱水各3min，二甲苯透明3min，透明2次。中性树胶封片，镜检。(leica正置显微镜，DM500)
2.结果
2.1脱细胞效果
(1)HE染色和DAPI染色结果
天然血管和实施例1制备的异种脱细胞血管基质的组织切片经苏木素-伊红染色液染色后，细胞核被苏木素染成鲜明的蓝紫色(黑白图中为深灰色点)，细胞质及细胞外基质呈红色(黑白图中为灰色)，结果如图1所示，图1中的A图为天然血管，图1中的B图为异种脱细胞血管基质，由图中可以看到，天然血管HE染色可看到大量蓝色(黑白图中为深灰色点)细胞核结构，而脱细胞血管基质HE染色仅看到被染成红色(黑白图中为灰色)的细胞外基质。
天然血管和实施例1制备的异种脱细胞血管基质的组织切片经DAPI染色后正常的细胞核呈亮蓝色荧光，细胞质无荧光，结果如图2所示，图中的A图为天然血管，图中的B图为异种脱细胞血管基质，由图中可看到，天然血管DAPI染色则看到大量蓝色荧光(图中为白色点)，而脱细胞血管基质DAPI染色无荧光(图中无白色点)。
以上表明本发明制备的异种脱细胞血管基质均细胞去除干净，仅保留细胞外基质结构。
(2)DNA残留检测结果
DNA残留检测结果如图3所示，可以看到天然血管的DNA含量为2717±161.935ng/mg，异种脱细胞血管基质的DNA含量为41.064±2.209ng/mg.因此，本发明所制备的异种脱细胞血管基质细胞去除干净，仅保留细胞外基质结构。
2.2细胞外基质组分保留
Masson三色染结果如图4所示，图中的A图为天然血管，图中的B图为异种脱细胞血管基质，胶原纤维为深蓝色(黑白图片中深灰色)，由B图中可以看到胶原纤维，说明胶原蛋白较好的保留在异种脱细胞血管基质中。
EVG染色结果如图5所示，图中的A图为天然血管，图中的B图为异种脱细胞血管基质，EVG染色结果显示弹性纤维为黑色，由B图中可以看到弹性纤维，说明弹性蛋白较好的保留在异种脱细胞血管基质中。
阿尔新蓝染色结果如图6所示，图中的A图为天然血管，图中的B图为异种脱细胞血管基质，阿尔新兰染色显示糖胺聚糖为浅灰色，由B图中可以看到浅灰色的糖胺聚糖，说明糖胺聚糖较好的保留在异种脱细胞血管基质中。
2.3细胞毒性检测
利用脱细胞血管基质浸提液来培养L929细胞，并计算细胞相对增殖率(RGR)，细胞相对增殖率(RGR)＝(各检测组OD均值/对照组OD均值)*100％，根据ISO和GB/T中细胞毒性实验的反应分级标准评定材料的毒性，RGR(100％)≥100定位0级，RGR(100％)≥75-99定为1级，RGR(100％)≥50-74定为2级，RGR(100％)≥25-49定为3级，RGR(100％)≥1-24定为4级，RGR(100％)≥0定为5级。其中毒性反应0-1(RGR≥75％)级为合格医用材料。检测结果如下表1。
表1细胞毒性检测结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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