阅读说明：本技术 快速诱导肝纤维化动物模型的方法 (Method for rapidly inducing hepatic fibrosis animal model ) 是由 冷静 梁丹 唐海波 吴展帅 李晓红 肖健 唐耀平 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速诱导肝纤维化动物模型的方法,该方法每天按体重4.0-5.7g/kg的乙醇量,给非人灵长类动物饮用含10-35％乙醇的酒,同时给予基础饲料自由喂养,喂养120-160天,即可得到肝纤维化动物模型。本发明能获得稳定的接近于人类自然发生的肝纤维化动物模型,非人灵长类动物依从性较好,试验中无须手术或处死动物检查,且造模时间短、成本低,为肝纤维化发病机理的研究、治疗药物的筛选、药效学评价等提供良好的模型载体。(The invention discloses a method for rapidly inducing a hepatic fibrosis animal model, which is characterized in that a non-human primate is drunk with wine containing 10-35% of ethanol according to the ethanol amount of 4.0-5.7g/kg of body weight every day, meanwhile, basic feed is freely fed, and the hepatic fibrosis animal model can be obtained after the non-human primate is fed for 160 days of 120-fold supplementation. The invention can obtain a stable hepatic fibrosis animal model which is close to the natural occurrence of human beings, the compliance of non-human primates is better, operations or animal sacrifice examination is not needed in the test, the modeling time is short, the cost is low, and a good model carrier is provided for the research of the pathogenesis of hepatic fibrosis, the screening of therapeutic drugs, the pharmacodynamics evaluation and the like.)

快速诱导肝纤维化动物模型的方法

技术领域

本发明涉及一种动物疾病模型的建立方法，特别是涉及一种快速诱导肝纤维化动物模型的方法。

背景技术

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是病毒性肝炎、酒精肝等很多慢性肝脏疾病的常见表现，是指由各种病因导致肝脏损伤而进行的组织修复，最终引起肝脏内细胞外间质的过度沉积的病理生理过程。如果肝脏损伤持续发展，轻度肝纤维化将会发展成为失代偿期肝硬化，而就目前的医学水平而言，针对肝硬化还没有很好的治疗手段，失代偿期肝硬化5年生存率仅为14％，同时肝纤维化的持续发展还可能会并发肝功能异常，甚至引发肝细胞癌，极大地威胁着人类的生命和健康。因此，构建能够模拟人体肝纤维化过程的理想动物模型成了探索早期诊断、寻找肝纤维化有效治疗药物、改善病情和预后的关键。

现已有的肝纤维化动物模型造模方法有化学造模法、乙醇造模法、免疫造模法、病毒性造模法等。其中化学造模法中的四氯化碳诱导的肝纤维化模型最常用，该方法系按0.5-2mL/kg体质量腹腔注射1:1的CCl₄橄榄油溶液，6-9周后可以导致肝纤维化。单纯CCl₄法操作简便、耗费少，肝纤维化程度从第4周的平均4.9％逐渐达到第8周平均9.2％的高峰，模型成功率达89.33％，但CCl₄肝毒性剧烈、动物死亡率高，不适合用于周期较长的实验研究。乙醇法的模型主要有2种：①Lieber-DeCarli模型:让啮齿类动物自由饮用含有乙醇的液体饲料。该模型可形成脂肪肝，但不出现肝纤维化相关表现，同时实验动物厌酒、诱导成功率低，给造模带来了很大的挑战。②Tsukamoto-French模型：对啮齿类动物采用持续胃内灌注含酒精的高脂流质饮食，对肝脏造成损伤诱导肝纤维化。如给实验大鼠胃内持续灌注含有60％的乙醇(1mL/kg体质量)、橄榄油(2mL/kg体质量)和吡唑(25mg/kg-1.d-1)9周。但肝纤维化程度较轻，且实验技术要求较高、操作繁琐，推广应用尚需进一步改进使肝纤维化程度加重并降低造模成本。

尽管现在已有多种肝纤维化动物模型，但因为肝纤维化的病因复杂多样、以及动物与人种属差异，迄今为止，能完全反应人类肝纤维化的动物模型尚未完全取得成功，在具体工作中充分考虑肝纤维化形成过程中的病因和机制、人与动物的物种差异、造模动物的自然恢复率等多种因素，选择最为合适的动物模型。非人灵长类动物与人类基因同源性高，免疫反应与人相似，在所有动物中生理生化指标与人类最为相似，以非人灵长类动物为对象构建理想的肝纤维化动物模型，尚需进一步深入研究。

发明内容

本发明针对上述肝纤维化动物模型存在的不足，提供一种采用酒单一因素快速诱导非人灵长类动物肝纤维化动物模型的方法，该方法以非人灵长类动物为对象，通过酒单一因素诱导,获得B超及病理检测结果均显著的能够完全模拟人肝纤维化动物模型发生发展的动物模型，为肝纤维化发病机理的研究、预防或治疗药物的筛选、药效学评价等提供良好的模型载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种快速诱导肝纤维化动物模型的方法，该方法每天按体重≥4.0g/kg的乙醇量给非人灵长类动物饮用酒，即可得到肝纤维化动物模型。

本发明所述的酒，为人们利用粮食、水果等含淀粉或糖的物质发酵制成的含乙醇的饮料，按照生产工艺主要分为发酵酒、蒸馏酒、配制酒等；所述酒应符合国家或相关部门规定的质量标准。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述非人灵长类动物饮用酒的时间优选为120-160天。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述酒优选为含10-35％乙醇的酒。本发明所述含10-35％乙醇的酒，为酒中乙醇体积与酒体积之百分比，为体积百分比浓度。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述非人灵长类动物饮用酒的方式优选为：按照酒中乙醇的浓度和/或每天乙醇量梯度递增。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述非人灵长类动物饮用酒的方式优选为：酒中乙醇的浓度梯度递增至35％、每天乙醇量梯度递增至5.7g/kg后维持时间≥80天，总喂养时间120-135天，即可得到肝纤维化动物模型。

以上所述肝纤维化动物模型的方法，在喂养100天后，通过肝脏影像学，对非人灵长类动物进行跟踪观察，当观察到明显的肝纤维化迹象即可判断得到肝纤维化模型。在本发明的试验条件阶段摸索阶段，喂养90天后，开始对非人灵长类动物进行B超影像学检查，之后每10-15天检查一次，当观察到：肝脏较原来有所缩小或不变，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝实质远端回声增高，呈大小不一密集的点状，且不规则的散布有高回声光点或斑片条索，可判断得到肝纤维化模型，即可进行肝脏组织病理学检测进一步验证。

所述基础饲料为非人灵长类动物日常饲养的普通饲料，能保证灵长类动物的生长、活动所需的能量，如市场上可以购买的非人灵长类饲料。优选含以下重量百分比的营养成分：粗蛋白≥15％、粗脂肪≥4.5％、粗纤维≤4％、粗灰分≤7％。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述非人灵长类动物饮用酒的方式优选为：按照酒中乙醇的浓度、每天乙醇量梯度递增。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，其特征在于，所述非人灵长类动物饮用酒的方式为：酒中乙醇的浓度梯度递增至35％、每天乙醇量梯度递增至5.7g/kg后维持时间≥80天，总喂养时间120-135天，即可得到稳定的肝纤维化动物模型。

以上所述所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，其特征在于，所述非人灵长类动物饮用酒的方式为：所述酒中乙醇的浓度按照每1-5天递增1-5％，所述每天乙醇量按照每1-5天递增0.03-0.31g/kg。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型的方法，所述非人灵长类动物优选成年的非人灵长类动物，进一步优选年龄≥6岁的非人灵长类动物。

非人灵长类动物与人类基因同源性高，免疫反应与人相似，在所有动物中肝脏及生理生化指标与人类最为相似，因此，本发明选用非人灵长类动物作为肝纤维化动物模型。本发明所述非人灵长类动物，可为猿、猴、猩猩等，进一步优选为性价比高的食蟹猴、恒河猴或猕猴等。

本发明优选蒸馏酒，即在原料酒精发酵后采用蒸馏技术而获得的酒，也就是用发酵酒通过蒸馏将酒度提高后的酒，起酒度较高，如：白兰地、威士忌、金酒、伏特加、朗姆酒和白酒等。本发明所述蒸馏酒进一步优选为白酒或白兰地。白酒由淀粉或糖质原料制成酒醅或发酵醪经蒸馏而得，所述糖质原料主要为粮谷。白酒根据国家相关标准，分为酱香型、浓香型、清香型、米香型等，根据度数或酒中乙醇的体积百分比分为：56％Vol、53％Vol、48％Vol、35％Vol等。白兰地是以水果为原料，经过发酵﹑蒸馏﹑贮藏后酿造而成。

以上所述快速诱导肝纤维化动物模型，采用以上所述方法建立。所述模型优选应用于：肝纤维化发病机理的研究、预防或治疗肝纤维化药物的筛选、药效学评价。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

(1)本发明将非人灵长类动物，通过酒这一单一因素的饮食自然诱导，同时给予基础饲料自由喂养，即能获得接近于人类自然发生的肝纤维化动物模型，模型稳定，为肝纤维化发病机理的研究、治疗药物的筛选、药效学评价等提供良好的模型载体。

(2)本发明采用酒和水配制成含10-35％体积百分比乙醇的酒，并每天按体重4-5.7g/kg乙醇量给每只非人灵长类动物饮用，该浓度和剂量的酒诱导、刺激并加速了肝纤维化模型的形成，动物喂养120-160天，即可得到稳定的肝纤维化动物模型，建模的成功率为100％。经过试验优选，酒中乙醇的浓度梯度递增至35％、每天乙醇量梯度递增至5.7g/kg后维持时间≥80天，总喂养时间120-135天，即可得到稳定的肝纤维化动物模型。成模时间为现有技术的10-40％，大大加快了成模速度，减少造模成本。

(3)本发明采用的酒为人们利用粮食、水果等含淀粉或糖的物质发酵制成，如：黄酒、白酒、白兰地等，酒中中除了水和乙醇外，还含有其他物质，如黄酒中还包括氨基酸、醋、有机酸等物质，白酒中还包括高级醇、多元醇、醛类、羧酸、酯类、酸类等物质，试验结果表明：这些物质使酒相对于乙醇和水的混合物更具有香醇风味，非人灵长类动物较容易接受并成瘾，从而对其有较好的依从性，刺激、加速了肝纤维化的形成，方便、易操作。本发明采用具有与人酗酒或嗜酒相似的生活方式持续喂养，能构建非人灵长类动物模拟人类摄食酒的真实天然的生物环境，所得到的肝纤维化动物模型更接近人类。

(4)试验中采用肝脏生物化学指标、B超影像学和组织病理学对非人灵长类动物肝脏进行检查，检查非人灵长类动物是否患有肝纤维化。本发明通过B超影像学即可确定得到稳定的肝纤维化模型，经组织病理学试验进一步验证，表明结果一致。因此，本发明所用的检查方法灵敏度高、特异性强、操作简单，可以活体检查，对动物伤害小，得到稳定的肝纤维化动物模型后，动物仍然可以进行药效学试验。

(5)本发明选用的非人灵长类动物，与人类基因同源性高，免疫反应与人相似，在所有动物肝脏及生理生化指标与人类最为相似，所建立的肝纤维化动物模型，其疾病的发生、病理过程与人类相似度很高，能够模拟人肝纤维化的发生发展。

附图说明

图1为空白组食蟹猴试验前肝脏B超图

图2为空白组恒河猴喂养90天肝脏B超图

图3为空白组猕猴喂养90天肝脏B超图

图4为空白组食蟹猴喂养90天肝脏组织解剖图

图5为空白组食蟹猴喂养90天肝脏组织结构HE染色图

图6为空白组食蟹猴喂养90天肝脏组织结构马松染色(100×)(200×)图

图7为实施例6喂养135天的食蟹猴肝脏B超图

图8为实施例6喂养135天的食蟹猴肝脏组织解剖图

图9为实施例6喂养135天食蟹猴肝脏组织结构HE染色图

图10为实施例6喂养135天食蟹猴肝脏组织结构马松染色(100×)(200×)图

图11为实施例2喂养120天的猕猴肝脏B超图

图12为实施例2喂养120天的猕猴肝脏组织结构HE染色图

图13为实施例2喂养120天的猕猴肝脏组织结构马松染色(200×)图

图14为实施例3喂养160天的恒河猴肝脏B超图

图15为实施例3喂养160天的恒河猴肝脏组织结构马松染色(200×)图

图16为实施例10喂养135天的猕猴肝脏B超图

图17为实施例10喂养135天的猕猴肝脏组织结构马松染色(200×)图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明，但不限制本发明的保护范围和应用范围。

一、主要仪器、试验材料

1.主要仪器：

(1)生化分析仪：日立7180全自动生化分析仪，购买于日本日立公司。

(2)血细胞分析仪：Sysmex XN-1000，购于希森美康医用电子(上海)有限公司。

(3)B超检查仪：Mindray便携式B超仪。

2.试验材料：

(1)均为市售质量合格酒。分别为16％Vol塔牌陈年贡酒干型(黄酒)、40％Vol皇家路易X.O(白兰地)、56％Vol红星二锅头清香型(白酒)、48％Vol杏花村汾酒(白酒)。

酒浓度的配制：酒的浓度为体积百分比浓度，即酒中乙醇体积与酒体积之百分比。用上述酒与蒸馏水按如下公式配制：

X2％×(V1+V2)＝V1×X1％，V1+V2＝1000ml

X1为酒的度数，X2为需配置酒的度数，V1为酒的用量(毫升)，V2为加水量(毫升)，

制得后采用温度计、酒精计观察测定酒的温度、浓度，在酒精计换算表中温度栏找出与溶液相同的温度，在浓度栏找出与溶液相同的浓度，两栏的交点数即为观察酒精的溶量百分数，即得。

(2)基础饲料。所述基础饲料为市售非人灵长类动物日常饲养的普通饲料。含以下重量百分比的营养成分：粗蛋白18.3％、粗脂肪5.6％、粗纤维3.5％、粗灰分3.8％、钙1.2％、磷1.0％。所述基础饲料的制备方法，包括以下步骤：1.取大米、大豆、豆粕，分别粉碎、过60目筛，得粉碎好的大米粉、大豆粉、豆粕粉；2.取维生素E0.1kg、豆油8kg，混匀，按等量递增法加入面粉，混匀，过60目筛，得分散均匀的面粉混合物A；3.取氯化胆碱1.5kg、维生素C0.2kg、泛酸钙0.15kg，混匀，加入石粉3.6kg，混匀，再加入食盐3.7kg、磷酸氢钙12kg，混匀，得混合物B；4.取大豆粉45kg、大豆浓缩蛋白40kg、鱼粉20kg、鸡肉粉50kg及混合物A、B，混匀，得混合物C；5.取大米粉570kg、豆粕粉150kg和混合物C，置混料箱内搅拌混合均匀，放入100℃的烘箱中干燥至水分≤10％，取出，即得。

二、试验动物

本试验使用的食蟹猴、恒河猴、猕猴由广西雄森灵长类养殖繁育中心提供。经常规的检疫和体检、无肢体残损，动物正常行为习性完整，检查报告包括临床检查和实验室检查内容，均参照国家标准执行。本研究在广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司AAALAC(Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal)国际资质认证实验室完成。

食蟹猴经过血液检查，无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、或无自身免疫性肝病的食蟹猴，均为成年猴，年龄≥6岁，雄性体重≥5.5kg，雌性体重≥3.0kg，并随机分为空白组、实验组，空白组6只(雌雄各3只)，每个实施例的实验组10只(雌雄各5只)。

恒河猴经过血液检查，无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、或无自身免疫性肝病的恒河猴，均为成年猴，年龄≥6岁，雄性体重≥5.5kg，雌性体重≥3.0kg，并随机分为空白组、实验组，空白组6只(雌雄各3只)，实验组的每个实施例10只(雌雄各5只)。

猕猴经过血液检查，无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、或无自身免疫性肝病的猕猴，均为成年猴，年龄≥6岁，雄性体重≥6.0kg，雌性体重≥4.0kg，并随机分为空白组、实验组，空白组4只(雌雄各2只)，实验组的每个实施例6只(雌雄各3只)。

其中空白组食蟹猴试验前肝脏B超图见图1：肝脏大小形态正常，被膜光滑，实质回声均匀，肝内血管纹理显示清晰，门静脉主干内径约0.8cm。胆囊大小正常，壁不厚，光滑，内透声好，胆总管内径约0.7cm。结论：肝脏正常。

三、预试验

取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康食蟹猴26只(雌雄各13只)。将56％Vol清香型红星二锅头白酒，按照体积百分比，加入纯净水分别配制成含乙醇浓度为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％的酒；将无水乙醇(市售无水乙醇，分析纯，水合法生产)与纯净水配制成含乙醇浓度为10％、20％、30％、40％的混合物。上述配制好的13个样品，每个样品分别喂养2只食蟹猴，于吃基础饲料后1-2小时内，每天按体重4.5g/kg的乙醇量给食蟹猴自由饮用样品，观察依从性及对身体的影响。

酒预试验结果：(1)给予含乙醇浓度为5％、15％的酒，食蟹猴均能自由饮用，依从性较好并自由饮用完指定量。(2)给予含乙醇浓度为20％、25％的酒，开始食蟹猴均不适应，2-3天后，能逐渐适应并自由饮用完指定量。(3)给予30％、35％乙醇浓度的酒，食蟹猴一开始均抗拒，经撤掉饮用水后，3-5天也能逐渐适应并自由饮用完指定量。(4)40-45％乙醇浓度的酒，食蟹猴均抗拒饮用，撤掉饮用水后，5天也未能适应并自由饮用量较少，需辅助人工灌喂才能喝完指定量，且10天左右，45％乙醇浓度的酒，发现食蟹猴有1只口腔及消化道受损，精神萎靡不振。结果表明：给予含35％以下乙醇浓度的酒，食蟹猴依从性较好，并有一定的成瘾性，表现为对酒的渴望，或停止给酒后情绪焦躁等。

乙醇与水混合物预试验结果：(1)给予10％、20％无水乙醇与水的混合物，食蟹猴能自由饮用，但仅能饮用完指定量的40-50％，需辅助人工灌喂才能喝完指定量。(2)给予30％、40％无水乙醇与水的混合物，食蟹猴抗拒饮用，撤掉饮用水后，5天也未能适应并自由饮用量较少，需辅助人工灌喂才能喝完指定量，且1周左右，发现食蟹猴有口腔及消化道受损，精神萎靡不振。结果表明：给予20％以下的无水乙醇与水混合物，食蟹猴能自由饮用，但未能饮用完指定量，人工辅助灌喂完指定量20天，未见有明显的成瘾现象。

四、建模方法及结果

1.空白组的喂养方法及结果。

食蟹猴空白组的喂养方法：取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康食蟹猴6只，雌雄各3只，给予基础饲料自由喂养，并给予正常饮用纯净水。

恒河猴空白组的喂养方法：取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康恒河猴6只，雌雄各3只，给予基础饲料自由喂养，给予正常饮用纯净水。

猕猴空白组的喂养方法：取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康恒河猴4只，雌雄各2只，给予基础饲料自由喂养，并给予正常饮用纯净水。

空白组试验结果：上述食蟹猴空白组、恒河猴、猕猴空白组、共16只，每个月跟踪观察1次：血液检测肝功能、肾功能、血脂、血常规，B超影像学检测肝、肾、脾腹部B超。空白组恒河猴喂养90天肝脏B超图见图2、空白组猕猴喂养90天肝脏B超图见图3，空白组食蟹猴喂养90天肝脏组织解剖、组织结构HE染色、马松染色图见图4-6。切片上每个肝小叶中间为中央静脉，肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状排列，形成单个细胞厚度的细胞板，即为肝板，肝板之间相连的是肝血窦。切片上看，有细胞聚集的为肝索，空白处为肝血窦，肝细胞胞质呈嗜酸性，HE染色为红色。肝小叶之间，还有小叶间静脉、小叶间动脉、小叶间胆管，主要集中于门管区或汇管区。小叶间动脉小而圆，管壁厚；小叶间静脉大而不规则，管壁薄；小叶间胆管小而圆，管壁由单层立方上皮构成。肝组织小叶结构清晰，肝细胞及肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，无纤维组织增生，仅在汇管区及中央静脉周围可见少量蓝色的Ⅰ型胶原。结论：肝脏正常。

结果表明：90天后，食蟹猴、恒河猴、猕猴与试验前情况基本一样：外周血液检测肝功、肾功、血脂、血糖未见明显改变，腹部B超检测也没有出现肝脏近场回声弥漫性增强现象，肝肾回声无区别，即均没有出现脂肪性病变及肝纤维化。

2.实验组各实施例的建模方法与结果分析。

(1)实施例1-4的建模方法。

随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康食蟹猴16只(雌雄各半)，随机分为2个组：实施例1组、实施例4组，每个实施例8只(雌雄各半)。随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康猕猴4只(雌雄各半)，为实施例2组。随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康恒河猴8只(雌雄各半)，为实施例3组。

按照表1的条件，根据每只动物的体重，每天给予一定浓度、一定剂量、不同种类及度数的酒饮用，同时给予基础饲料无限量自由喂养。喂养90天后，开始对非人灵长类动物进行B超影像学检查，之后每10-15天检查一次，当观察到：肝脏较原来有所缩小或不变，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝实质远端回声增高，呈大小不一密集的点状，且不规则的散布有高回声光点或斑片条索，可判断得到肝纤维化模型，即可进行肝脏组织病理学检测进一步验证。

表1 实施例1-4建模条件及结果

(2)实施例5-10的建模方法。

随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康食蟹猴32只(雌雄各半)，随机分为4个组：实施例5、实施例6、实施例8、实施例9，每个实施例8只(雌雄各半)。随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康恒河猴8只(雌雄各半)，为实施例7组。随机取上述无嗜肝病毒症感染、无药物或中毒性肝损伤、无自身免疫性肝病的健康猕猴4只(雌雄各半)，为实施例10组。

按照表2-7的条件：根据每只动物的体重，每天根据实施例情况给予一定浓度、一定剂量的用56％Vol红星二锅头清香型白酒配制成的酒饮用，酒中乙醇的浓度从10％梯度递增至35％、每天给予酒的量根据所含乙醇量按体重从4g/kg梯度递增至5.7g/kg。同时给予基础饲料无限量自由喂养。喂养90天后，开始对非人灵长类动物进行B超影像学检查，每10-15天检查一次，观察到：肝脏较原来有所缩小或不变，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝实质远端回声增高，呈大小不一密集的点状，且不规则的散布有高回声光点或斑片条索，可判断得到肝纤维化模型，即可进行肝脏组织病理学检测进一步验证。

表2 实施例5建模条件及结果

表3 实施例6建模条件及结果

表4 实施例7建模条件及结果

表5 实施例8建模条件及结果

表6 实施例9建模条件及结果

表7 实施例10建模条件及结果

(3)实验组各实施例的建模结果分析。

本发明经过160天的喂养和观察检测：①实验组10个实施例共72只非人灵长类动物(包括食蟹猴、恒河猴、猕猴)，经腹部B超影像学检测均观察到：肝脏较原来有所缩小或不变，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝实质远端回声增高，呈大小不一密集的点状，且不规则的散布有高回声光点或斑片条索，可判断得到肝纤维化模型，并经肝脏组织病理学检测，进一步验证得到肝纤维化模型。肝脏组织病理检测肝纤维化病变显著。建模成功的时间为120-160天，成功率为100％，得到的肝纤维化动物模型很稳定，停止给酒后8个月后检查，实施例1-10动物模型的肝纤维化未能恢复正常。②试验中非人灵长类动物饮用含乙醇20％以下的低浓度酒依从性较好，一开始给予含乙醇25％-35％的较高浓度的酒，需要通过撤掉正常饮用水或辅助灌喂诱导适应，2-5天后依从性较好，均能自主饮用完成规定的饮用量，20天后部分食蟹猴、恒河猴、猕猴出现成瘾现象。③试验中发现：以酒的浓度、饮用乙醇剂量梯度递增的方式，动物的依从性更好。且酒中乙醇的浓度梯度递增至35％、每天乙醇量梯度递增至5.7g/kg后维持时间≥80天，总喂养时间120-135天，即可得到稳定的肝纤维化动物模型，加快了成模时间，为更优选的技术方案。④本发明试验中无须手术或处死动物检查，且造模成本很低。以本发明方法建立的肝纤维化动物模型，可应用于肝纤维化发病机理的研究、预防或治疗肝纤维化药物的筛选、药效学评价，特别是人类因饮酒引起的肝纤维化发病机理的研究、预防或治疗肝纤维化药物的筛选、药效学评价。下面结合附图对本发明的试验情况作简单说明：

(1)本发明实验组实施例6的肝纤维化动物模型情况，见图7-10。

见图7，为实施例6喂养135天成模稳定的食蟹猴肝脏B超图。B超观察到：肝脏较原来缩小，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝远端实质回声弥漫性增高，回声光点密集且大小不一，呈点状，偶见斑片状，提示有肝纤维化病变。

见图8，为实施例6喂养135天成模稳定的食蟹猴肝脏组织解剖图。肉眼观察到：肝脏呈中至重度脂肪变性，体积增大，肝包膜略紧张，质地较硬，局部表面呈灰黄色，散布大小结节。而正常食蟹猴的肝脏呈红褐色或暗红色，质地柔软。

见图9，为实施例6喂养135天食蟹猴肝脏组织结构HE染色图。实验前可见肝小叶轮廓清晰，肝细胞以小叶中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索排列尚整齐，肝细胞呈多边形，细胞分界清，核圆，位于细胞中央，胞浆丰富，呈嗜碱性，偶见中央静脉周围的肝细胞胞质疏松，高倍镜下,腺泡2区或3区偶见小泡性脂滴空泡。135天肝组织切片均见中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，小叶界限不清，肝脏组织可以观察到空泡样变、局部细胞坏死等，表明肝纤维样病变明显。

见图10，为实施例6喂养135天食蟹猴肝脏组织结构马松染色(100×)(200×)图。实验前肝组织小叶结构清晰，肝细胞及肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，无纤维组织增生，仅在汇管区及中央静脉周围可见少量蓝色的Ⅰ型胶原。135天成模后：肝组织小叶结构完整，肝组织胶原纤维表达量显著增多，形成区域斑块样分布，又以血管周围和汇管区为主，并且互相粘连成片。

结果表明：得到稳定的肝纤维化动物模型。

(2)本发明实验组实施例2(见图11-12)、实施例10(见图16-17)猕猴肝纤维化动物模型情况。

实施例2喂养120天后B超观察，见图11。肝脏较原来缩小，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝远端实质回声弥漫性增高，回声光点密集且大小不一，呈点状，提示有肝纤维化病变。

见图12，为实施例2喂养120天的猕猴肝脏组织结构HE染色图。实验前可见肝小叶轮廓清晰，肝细胞以小叶中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索排列尚整齐，肝细胞呈多边形，细胞分界清，核圆，位于细胞中央，胞浆丰富，呈嗜碱性，偶见中央静脉周围的肝细胞胞质疏松，高倍镜下,腺泡2区或3区偶见小泡性脂滴空泡。120天成模后：肝组织切片均见中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，小叶界限不清，肝脏组织可以观察到空泡样变、局部细胞坏死等，表明肝纤维样病变明显。

见图13，为实施例2喂养120天的猕猴肝脏组织结构马松染色(200×)图。实验前肝组织小叶结构清晰，肝细胞及肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，无纤维组织增生，仅在汇管区及中央静脉周围可见少量蓝色的Ⅰ型胶原。120天成模后：光镜下(200×)，masson染色肝纤维化肝细胞广泛坏死变性，且肝小叶内原有网状支架胶原化病变图。肝组织小叶结构清晰，肝细胞变性明显，多数肝细胞内可见大小不等,数量不一的脂肪空泡，纤维组织增生明显，纤维间隔细而疏松，融合现象少见，肝纤维化肝细胞广泛坏死变性，且肝小叶内原有网状支架胶原化病变。

见图16，为实施例10喂养135天的猕猴肝脏B超图。实施例10喂养135天后B超观察：

肝脏较原来缩小，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝远端实质回声弥漫性增高，回声光点密集且大小不一，呈点状，偶见斑片，提示有肝纤维化病变。

见图17，为实施例10喂养135天的猕猴肝脏组织结构马松染色(200×)图。实验前肝组织小叶结构清晰，肝细胞及肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，无纤维组织增生，仅在汇管区及中央静脉周围可见少量蓝色的Ⅰ型胶原。135天成模后：光镜下(200×)，masson染色肝细胞出现广泛坏死，增生的胶原纤维向肝小叶内伸展图。肝组织小叶结构清晰，肝细胞变性明显，多数肝细胞内可见大小不等,数量不一的脂肪空泡,纤维组织增生明显，纤维间隔细而疏松，融合现象少见，肝细胞出现广泛坏死，增生的胶原纤维向肝小叶内伸展。

结果表明：实施例2、实施例10得到肝纤维化动物模型。

(3)本发明实验组实施例3喂养160天的恒河猴肝纤维化动物模型情况，见图14-15。

见图14，为实施例3喂养160天的恒河猴肝脏B超图。实施例3喂养160天后B超观察：肝脏大小不变，肝包膜增厚，肝表面凹凸不平，呈锯齿状，肝边缘变钝成不规则，肝远端实质回声弥漫性增高，回声光点密集且大小不一，见有斑片，逐渐呈条索状，提示有肝纤维化病变。

见图15，为实施例3喂养160天的恒河猴肝脏组织结构马松染色(200×)图。实验前肝组织小叶结构清晰，肝细胞及肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，无纤维组织增生，仅在汇管区及中央静脉周围可见少量蓝色的Ⅰ型胶原。160天成模后，光镜下(200×)，masson染色中央静脉和汇管区互相连接出现坏死带并向肝小叶内伸展图。肝组织小叶结构清晰，肝细胞变性明显，多数肝细胞内可见大小不等,数量不一的脂肪空泡,纤维组织增生明显，纤维间隔细而疏松，融合现象少见，中央静脉和汇管区互相连接出现坏死带并向肝小叶内伸展。

结果表明：实施例3得到肝纤维化动物模型。