阅读说明：本技术 可塑性诱导不同时间段低频磁刺激调控突触可塑性的方法 (Method for regulating and controlling synaptic plasticity by plastic induction and low-frequency magnetic stimulation in different time periods ) 是由 郑羽 马晓旭 马卫 东磊 张康辉 田春晓 于 2019-03-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以突触可塑性诱导为参考点,不同时间段的ELF-EMFs刺激对大鼠离体海马脑片Schaffer-CA1通路突触可塑性调控的方法。通过采用了在可塑性诱导之前、同步和之后的三种不同参数条件下的ELF-EMFs刺激模式,揭示了三种ELF-EMFs刺激模式各自对海马脑片Schaffer-CA1突触可塑性LTP/LTD的调控规律,发现了中磁刺激模式的调控效果最为明显。本发明提出了可塑性诱导不同时间段低频磁刺激调控突触可塑性的方法,有益于更深层次的认识磁刺激对大鼠海马区的生物学效应乃至对学习与记忆整个过程的调控规律,并且对临床上rTMS治疗的磁刺激模式和参数选择等均有重要借鉴意义。(The invention discloses a method for regulating and controlling synaptic plasticity of a Schaffer-CA1 passage of an isolated hippocampal brain slice of a rat by using synaptic plasticity induction as a reference point and ELF-EMFs stimulation in different time periods. By adopting ELF-EMFs stimulation modes under three different parameter conditions of before, synchronization and after plasticity induction, the regulation rule of the three ELF-EMFs stimulation modes on synaptic plasticity LTP/LTD of hippocampal brain slice Schaffer-CA1 is disclosed, and the regulation effect of the medium magnetic stimulation mode is found to be most obvious. The invention provides a method for regulating and controlling synaptic plasticity by plasticity induction and low-frequency magnetic stimulation in different time periods, which is beneficial to deeper understanding of the biological effect of magnetic stimulation on a rat hippocampal region and even the regulation and control rule of the whole process of learning and memorizing, and has important reference significance for magnetic stimulation mode, parameter selection and the like of clinical rTMS treatment.)

可塑性诱导不同时间段低频磁刺激调控突触可塑性的方法

技术领域

本发明以急性分离的SD大鼠海马区Schaffer-CA1通路为研究对象，揭示了三种不同参数的连续正弦ELF-EMFs刺激模式对突触可塑性LTP/LTD的调控规律，该方法有益于更深层次的认识磁刺激对突触可塑性的调控规律，并对临床上 rTMS治疗的磁刺激模式和参数选择等均有重要借鉴意义，归属于电子信息技术和生物医学工程等领域。

背景技术

在现代社会中，极低频电磁场(Extremely low frequency electromagneticfields，ELF-EMFs)设备被广泛使用，长期暴露会对人类的记忆和认知功能存在潜在的风险，同时ELF-EMFs刺激也是阿尔兹海默病等神经退行性疾病的一种有效治疗手段，但其作用机制尚不清楚。突触可塑性是指突触在形态和功能上的改变，表现为突触的反复活动引致突触递效率的增强或降低，如长时程突触增强及长时程突触抑制，其是学***时，突触后膜上仅部分取代Mg²⁺，导致较少的Ca²⁺进入到突触后的神经元中，较低的细胞内Ca²⁺浓度和蛋白激酶激活将抑制突触形成LTD。由于突触可塑性在许多脑高级功能中发挥着重要的作用，如学习与记忆，突触可塑性也成为近年来学习与记忆方面研究进展最快、成果最大的研究领域。

目前磁刺激对突触可塑性研究的主要手段包括在大鼠活体期间进行长期磁刺激暴露和在离体海马脑片孵育阶段进行磁刺激，再通过记录fEPSP来反映磁刺激对突触可塑性活动的变化情况。采用长期磁刺激暴露的方法，可以反映磁刺激的累积效应对突触可塑性的影响，但是这种方法阻碍了磁刺激对学习与记忆影响的研究，因为在离体海马脑片上的突触可塑性实验过程本身就是学习与记忆的过程，并且，由于现有技术条件下仅能在突触可塑性实验开始前对离体海马脑片进行磁刺激来实现研究目的，从而在一定程度上制约了磁刺激对海马脑片突触可塑性不同阶段调控过程研究的开展。

发明内容

本发明的目的是提供一种低频低强度连续正弦磁场刺激对大鼠离体海马脑片Schaffer-CA1通路突触可塑性调控的方法，以克服现有技术条件下仅能在突触可塑性之前进行磁刺激的研究方法，导致在一定程度上制约了磁刺激对突触可塑性实验研究的开展，从而推动了磁刺激对学习与记忆影响的基础研究，进而揭示其作用机理并为其在药理学、神经生理学和临床医学等学科上的应用提供必要的客观依据。

本发明的技术方案：

本发明使用实验室自制的ELF-EMFs发生装置，其可以产生正弦不间断的 ELF-EMFs，将其应用到神经电生理场电位记录的实验中，经过COMSOL仿真以及特斯拉计的实际测量确定该装置能产生实验需要的ELF-EMFs。之后应用 ELF-EMFs刺激协议在急性分离的大鼠海马脑片Schaffer-CA1通路上测量fEPSP 信号并分析对LTP的影响，在9种不同频率、不同强度的ELF-EMFs参数中最终确定一个对LTP产生最大影响的实验参数为后续实验的基础。在此基础上进一步阐明了ELF-EMFs在可塑性诱导之前(前磁刺激协议)、和可塑性诱导同步 (中磁刺激协议)以及在可塑性诱导之后(后磁刺激协议)对突触可塑性带来的影响，这有助于直接了解ELF-EMFs在学习与记忆相关过程中的作用。

本发明提出的可塑性诱导不同时间段低频磁刺激调控突触可塑性的方法，具体步骤是：

第1步、在磁场刺激参数上，在线磁场刺激装置固定于海马脑片正下方15 毫米处，通过调节信号源输出参数，在线磁场刺激装置可以产生不同频率和强度的连续正弦磁场，在离体脑片海马区的磁场强度范围为0.5-2mT，频率范围为 15-100Hz，刺激时间可以根据需要灵活进行调节；

第2步、在磁场的刺激模式上，以突触可塑性实验中的可塑性诱导过程为分界线分为：磁场刺激在突触可塑性诱导前，称为前磁刺激；与突触可塑性诱导过程同步，称为中磁刺激；在突触可塑性诱导之后，称为后磁刺激。

第3步、在磁场刺激协议上，前磁刺激协议：在突触可塑性诱导开始前40 分钟开启磁刺激装置，在可塑性诱导开始前20分钟关闭磁刺激装置，刺激时间为20分钟；中磁刺激协议：在可塑性诱导开始时同步开启磁刺激装置，在可塑性诱导结束时同步关闭刺激装置，磁刺激时间与诱导时间相同；后磁刺激协议：在可塑性诱导完成后20分钟开启磁刺激装置，在可塑性诱导完成后40分钟关闭磁刺激装置，刺激时间为20分钟。

第4步、应用前磁刺激协议，使用了9个磁刺激参数：磁场频率15Hz(磁场

强度0.5，1，2mT)，50Hz(磁场强度0.5，1，2mT)，100Hz(磁场强度0.5，1，2mT)，采用场电位电生理采集系统记录SD大鼠离体海马脑片Schaffer-CA1通路的场电位信号，通过fEPSP的幅值来分析上述前磁刺激协议对突触可塑性LTP的影响，确认15Hz/2mT的磁刺激参数对突触可塑性LTP的抑制效果最为明显。

第5步、应用前磁，中磁和后磁三种磁刺激协议，使用15Hz/2mT磁刺激参数，采用场电位电生理采集系统记录SD大鼠离体海马脑片Schaffer-CA1通路的场电位信号，通过fEPSP的幅值来分析上述前磁刺激协议对突触可塑性LTP/LTD 的影响，确认三种磁刺激协议都会对突触可塑性LTP/LTD产生抑制效果，其中中磁刺激协议的抑制效果最为明显。

第6步、在上述步骤完成的基础上，通过频率响应函数总结上述三种磁场刺激协议对突触可塑性的调控规律。

本发明的优点和有益效果：

ELF-EMFs刺激是目前对记忆与认知等神经退行性一种有效治疗手段，但其作用机制尚不清楚，本发明提出了可塑性诱导不同时间段低频磁刺激调控突触可塑性的方法，本发明的结果有益于更深层次的认识磁刺激对大鼠海马区的生物学效应乃至对学习与记忆整个过程的调控规律，并且对临床上rTMS治疗的磁刺激模式和参数选择等均有重要借鉴意义。

附图说明

图1ELF-EMFs前磁刺激模式对突触可塑性的实验结果图。(A)ELF-EMFs 在基线记录之前刺激20min，可塑性诱导频率为1Hz；(B)ELF-EMFs在基线记录之前刺激20min，可塑性诱导频率为5Hz；(C)ELF-EMFs在基线记录之前刺激20min，可塑性诱导频率为20Hz；(D)ELF-EMFs在基线记录之前刺激 20min，可塑性诱导频率为100Hz。

图2ELF-EMFs中磁刺激模式对突触可塑性的实验结果图。(A)ELF-EMFs 与可塑性诱导同步刺激15min，可塑性诱导频率为1Hz；(B)ELF-EMFs与可塑性诱导同步刺激3min，可塑性诱导频率为5Hz；(C)ELF-EMFs与可塑性诱导同步刺激0.75min，可塑性诱导频率为20Hz；(D)ELF-EMFs与可塑性诱导同步刺激1.0667min，可塑性诱导频率为100Hz。

图3ELF-EMFs后磁刺激模式对突触可塑性的实验结果图。(A)ELF-EMFs 在可塑性诱导之后的记录过程中刺激20min，可塑性诱导频率为1Hz；(B) ELF-EMFs在可塑性诱导之后的记录过程中刺激20min，可塑性诱导频率为5Hz； (C)ELF-EMFs在可塑性诱导之后的记录过程中刺激20min，可塑性诱导频率为20Hz；(D)ELF-EMFs在可塑性诱导之后的记录过程中刺激20min，可塑性

诱导频率为100Hz。

图4ELF-EMFs前磁刺激、中磁刺激和后磁刺激模式下的FRF函数。

以下结合附图和通过实施例对本发明的

具体实施方式

作进一步说明。

具体实施方式

实施例一

第1步、急性分离大鼠海马脑片

实验动物选择Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，16～18天，27～30克，麻醉剂的选择是腹腔内注射0.1ml的10％水合氯醛进行麻醉，取脑时间应控制在 1-3min，这有利于让脑片长时间保持良好的活性。取出的脑组织放入 95％O₂+5％CO₂混合气的0℃ACSF中备用，然后在滤纸上对大脑进行修块，采用半脑直接切片的方法，先用刀片切去下丘脑和嗅球，再分开左右脑，然后在脑片振动切片机自带的取样棒中先滴入502胶水，利用滤纸条将半个脑组织粘在取样棒上，冰夹冰冻，随后滴入预先煮沸后冷却到36℃的琼脂固定组织块，不然组织块过于软，不利于切片。将取样棒***切片槽中，立即在切片槽内注入四分之三体积的0℃的ACSF并持续通入95％O₂+5％CO₂混合气体。调节切片机的参数设置，过快或震动幅度过大均可能对脑片造成不良影响，这里参数为频率8、速度2，切片厚度设置400μm。选取脑片时开头和终末的脑片舍弃，每个脑组织一般可切出4-6张脑片，用剪掉尖端的一次性滴管取出并放入到孵育槽中恒温 33℃孵育，一般孵育时间为1个小时并持续通入95％O₂+5％CO₂的混合气体。

第2步、LTP和LTD记录方法

场兴奋性突触后电位(fEPSP)记录的位置为Schaffer-CA1通路，同心圆双极刺激电极由手动微操纵器控制，放置在海马CA3区Schaffer侧枝的辐射层上，记录电极经P-97拉制，充灌填充物为ACSF(电阻＜4MΩ)，由电动微操纵器控制，放置在海马CA1区的辐射层或靠近胞体层的位置上，距离刺激电极 30-80μm。在离体海马脑片的CA1区辐射层中记录到的群峰反应是一个复合波形，是突触前纤维群峰(Fiber Volley，FV)以及fEPSP的总和。

本发明在实验中的初始刺激电压为3V，开始记录后fEPSP的初始幅值会有一定的增大，其最大的初始幅值可以达到0.45～0.6mV以上。然后逐渐增加刺激强度，将fEPSP幅值调整为最大响应的30～40％，一般为0.15～0.2mV左右，并且稳定20分钟作为基线。通常在实验中通过隔离器调整所需的刺激电压强度为 3～15V。该刺激强度的大小与脑片的活性以及同心圆双极刺激电极的损耗有关。在场电位记录中，选择这样的一个fEPSP的初始幅值可以严格控制离体海马脑

片之间不同的实验条件，尽可能地减少系统误差；其次，在这样的一个初始 fEPSP幅值范围内，对海马脑片的损伤比较小，并且也比较容易得到稳定的实验基线，有利于后续可塑性诱导实验的开展；同时这样的一个较小的刺激电压强度可以确保在可塑性诱导之前的基线记录到的电信号没有引发大量的去极化，保证在可塑性诱导的时候触发NMDA受体的兴奋性突触后电位；

第3步、ELF-EMFs的产生

ELF-EMFs通过实验室自制的在线刺激线圈产生，因为记录槽上方有显微镜，所以不可能将磁线圈放置在脑片上方。因此，线圈被放置在记录槽和实验平台的下方。该线圈由信号发生器经一个自制的功率放大器连接，有自己的独立电源供电。该线圈由铜线缠绕(铜线直径0.35mm，865匝)制成，其高度为24.1mm，半径为52.3mm，内部高度为18.1mm。在实验中，脑片与线圈之间的距离为5mm。这个设计的目的是可以实时在线为脑片提供ELF-EMFs暴露，以往的研究往往都是在脑片孵育的时候或者在放入记录槽之前进行ELF-EMFs暴露，这受制于脑片一旦放入记录槽中就不能随意取出再进行记录的原因，这是因为刺激电极和记录电极都会固定在一个位置，不然在同一个脑片上记录的信号就有差异性了。

第4步、三种模式9种不同频率和强度的ELF-EMFs刺激模式下的突触可塑性记录

本发明会在这9个磁刺激参数中得到一个对LTP影响最大的参数并应用到后续的实验。随后将这个参数应用到不同的可塑性诱导频率中来确定ELF-EMFs 对突触可塑性的作用。本发明提出了三种ELF-EMFs刺激模式，根据ELF-EMFs 暴露的时间点不同将这三种模式称为前磁刺激模式、中磁刺激模式、后磁刺激模式。这三种加磁方式分别是在可塑性诱导之前、与可塑性诱导一起进行和在可塑性诱导之后。在学习与记忆的角度可以理解为短时记忆、记忆的加深和巩固和长时记忆的形成。这个实验最终会得到ELF-EMFs和突触可塑性之间的关系，并从突触效能角度得到新的频率响应函数(Frequency Response Function，FRF)。

实验结果分析

(1)ELF-EMFs前磁刺激模式对突触可塑性的影响

在记录基线前添加20min的ELF-EMFs刺激，这被称之为“前磁刺激”，突触可塑性的诱导频率分别为1、5、20和100Hz，分别持续15、3、0.75min和64s。图中(红色：对照组；黑色：前磁刺激组)显示了四种频率诱发LTP、LTD和随后的60分钟可塑性记录。实验结果表明，ELF-EMFs前磁刺激组相比于对照组而言可以显著性抑制LTP和LTD的生成(1Hz(LFS)：89.6±3.4％，p＝0.004，n＝4

slices/2rats；20Hz(HFS)：110.5±4.5％，p＝0.04，n＝5slices/2rats；100Hz(HFS)：136.9±4.7％，p＜0.001，n＝5slices/3rats)。此外，在5Hz的可塑性诱导频率下虽然具有抑制效应，但无统计学意义。

(2)ELF-EMFs中磁刺激模式对突触可塑性的影响

ELF-EMFs刺激的时间点是与可塑性诱导的过程同步的，所以也称该协议为“中磁刺激”。这意味着ELF-EMFs刺激的持续时间与可塑性诱导的时间相同(1Hz： 15minutes，5Hz：3minutes，20Hz：0.75minutes，and 100Hz：64seconds)。从图中可以看出(1Hz：93.4±3.6％，p＜0.001，n＝5slices/3rats；5Hz：102±5.5％，p＝0.04， n＝5，slices/3rats；20Hz：103.9±2.9％，p＝0.004，n＝5slices/3rats；100Hz：122.3± 3.9％，p＜0.001，n＝5，slices/rats)，中磁刺激模式与对照组相比也表现出对LTP 和LTD的抑制作用。相比于前磁刺激模式，中磁刺激模式无论是在对LTP的抑制效果还是LTD的抑制效果均表现出更加显著的抑制效果。

(3)ELF-EMFs后磁刺激模式对突触可塑性的影响

实验继续在可塑性诱导之后的LTP和LTD的整个记录过程的中间20分钟添加ELF-EMFs刺激，这被称之为“后磁刺激”协议。从图中可以看出，在可塑性诱导之后的记录中，在未加磁场的前20分钟对照组和实验组表现出一样的变化，在添加完磁场之后，无论是LTP还是LTD均表现出抑制的作用(1Hz：91.7±3.9％，p＜0.001，n＝5slices/3rats；5Hz：100.4±3.6％，p＝0.06，n＝4slices/2rats；20Hz： 105.5±3.5％，p＝0.002，n＝6slices/3rats；100Hz：137.1±3.8％，p＜0.001，n＝4 slices/2rats)。值得注意的是，因为这里有20分钟添加ELF-EMFs刺激，所以这里的数据显示为后20分钟的fEPSP幅值的均值和其标准差。

(4)ELF-EMFs前磁刺激、中磁刺激和后磁刺激模式下的FRF函数

三种ELF-EMFs刺激模式的结果表明ELF-EMFs会对突触可塑性有抑制的作用，相比较于前磁刺激和后磁刺激组，中磁刺激组对突触可塑性影响最为明显。实验过程采用三种不同的ELF-EMFs刺激添加协议和四种不同的可塑性诱导频率对海马脑片的Schaffer-CA1突触可塑性进行研究。本发明建立了一个新的频率响应函数如图所示，横轴代表可塑性诱导的频率，纵轴代表可塑性诱导之后的突触活动。在可塑性诱导之前添加磁场刺激，伴随着可塑性诱导添加磁场刺激以及在可塑性诱导之后添加磁场刺激，这三种模式对比控制组随着可塑性诱导频率的改变都会抑制突触活动。