阅读说明：本技术 一种微流控芯片和纳米颗粒分离装置 (Micro-fluidic chip and nano-particle separation device ) 是由 张洪波 宋基永 邢天龙 殷瑞雪 杨盛兵 汤亭亭 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：提供一种微流控芯片,具有一主流道。所述微流控芯片还包括：至少一进液流道,所述进液流道具有一进液口,并且所述进液流道与所述主流道连接；至少两出液流道,每一出液流道具有一出液口,并且每一出液流道与所述主流道连接；以及,一对电极,被配置为靠近所述主流道以在所述主流道处形成一不均匀电场。本申请所述的微流控芯片及纳米颗粒分离装置可利用介电泳力及流场力的共同作用,实现不同粒径微粒的分离。(A micro-fluidic chip is provided, which has a main channel. The microfluidic chip further comprises: the liquid inlet flow channel is provided with a liquid inlet and is connected with the main flow channel; at least two liquid outlet channels, each liquid outlet channel is provided with a liquid outlet, and each liquid outlet channel is connected with the main channel; and a pair of electrodes configured to be adjacent to the primary flow channel to form a non-uniform electric field at the primary flow channel. The micro-fluidic chip and the nano-particle separation device can realize the separation of particles with different particle sizes by utilizing the combined action of dielectrophoresis force and flow field force.)

一种微流控芯片和纳米颗粒分离装置

技术领域

本发明涉及颗粒分离领域，特别涉及一种微流控芯片，以及应用该微流控芯片的纳米 颗粒分离装置。

背景技术

着科技的发展，人们对世界的研究尺度愈发深入，随之而来的是纳米技术，纳米科学， 这些东西的出现有进一步促进科技的发展。但是就目前而言许多纳米材料存在着颗粒大小 不均一，很难得到高品质的单分散颗粒的问题。而再生物纳米领域需要获得某种特定的纳 米级细胞分泌物用于实验研究以及医疗检测。其中具有代表性的就是外泌体——粒径在 30-150nm的囊泡，纯化后的外泌体可以用于癌症的检测和预后。本发明便是从外泌体的纯 化分离出发，同样适用于获得其他高单分散纳米颗粒。

目前用于外泌体分离纯化的方法有基于传统的分离技术的超速离心法、密度梯度离心 法和免疫亲和捕获等方法，分别基于外泌体的粒径大小、悬浮密度和膜上存在的标记蛋白 来进行分离。

差速超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可 分离到大小相近的囊泡颗粒。Johnstone等最初发展了差速离心法用于网织红细胞组织培养 液中外泌体的分离；Thery等对该方法进行了优化，以300g、2000g和10000g离心，分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；利用超高速离心(>100000g)得到外泌体的粗提取物，重复操作2次，以去除污染蛋白质，从而得到外泌体。该方法被广泛应用于各类生物样品，如血 清、血浆、细胞培养液、尿液、唾液和脑脊液等的分析，是目前应用最为广泛的外泌体分 离方法，也是目前的“金标准”。

密度梯度离心可以看作是差分超速离心法优化方法，主要区别在于是将样本和梯度材 料一起进行超速离心。样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，根据梯度分布方式的不 同分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度 时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在实验前样本也要经过 一定的离心操作以去除细胞、死细胞和细胞碎片，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5M和 0.25M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外 泌体会沉降到与之相匹配的密度区(1.10～1.18g/ml)

免疫标记法主要通过在微流道内表面包被一层特定抗体，这些抗体能与外泌体外表面 特异性蛋白结合，将抗体固定于磁珠、色谱固定相等基质上，以实现对外泌体的特异性富 集，从而实现分离。其中免疫磁珠法得到较为广泛的研究及应用，并有相对成熟的产品。 抗体包被的磁性小珠有效地用于从抗原呈递细胞分离外泌体，如利用结合了针对外泌体表 面抗原(CD9、CD63、CD81和EpCAM)抗体的磁性粒子，特异性捕获外泌体表面标志蛋白，从而达到分离外泌体的目的；使用抗肿瘤相关的HER2和EpCAM抗体可以从肿瘤细胞培 养液中分离出来源于肿瘤细胞的外泌体；包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后， 即可将外泌体吸附并分离出来。还有商品试剂盒采用磁珠和磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白的方法，很方便地从血清等样品中获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)，并利用中性pH的金属螯合试剂，将捕获的EVs从磁珠上洗脱 下来，可以获得完整的外泌体和其他EVs。

除此之外还有利用颗粒尺寸效应分离方法，包括采用纳米结构(纳米柱、纳米膜、纳 米阵列等方法)、电场力及流场力共同作用方法。

确定性侧向位移(Deterministic lateral displacement，DLD)柱形微流控芯片是纳米结构 等一种，目前已经用于有效的检测分析和分离富集微米级颗粒的技术，包括血液中的寄生 虫、细菌、血细胞和循环肿瘤细胞等。DLD原理是设计特定尺寸的DLD微柱阵列，在阵列 中大于分选临界半径的微粒与微柱阵列碰撞后发生侧向位移，可向一侧汇聚，而小于分选 临界半径的微粒碰撞后不发生侧向位移，仍按照原流向流过阵列。Wunsch等人使用可制造 的硅工艺制造了一种间隙均匀，尺寸范围25-235nm的纳米级DLD阵列来分离外泌体。在 低Pe数(扩散和确定性位移相互影响)的情况下，纳米级DLD阵列具有清晰的分辨率，阵列的圆柱间隙低至25nm能够灵敏地分离20-110nm的粒子，该方法的分离精度可以达到10nm，该研究证明了外泌体基于大小的位移，为生物胶体在芯片上的分选和定量提供了新的方法。此外，该技术允许以单粒子分辨率连续流进行快速胶体分选，无需粒子标记，使 用的样本量小且无损。但DLD技术仍然存在一些局限性，这主要是由于低通量，支柱堵塞 和过于庞大的DLD装置等问题。

因此，亟需一种新的纳米颗粒分离技术，以解决上述现有纳米颗粒分离技术中存在的 不同技术问题。

发明内容

本申请的目的在于提供一种微流控芯片及应用该微流控芯片的纳米颗粒分离装置。本 申请所述的微流控芯片及纳米颗粒分离装置可用于外泌体分离纯化，同时也可以广泛推广 到其他纳米颗粒分离邻域。在本申请的所述微流控芯片及纳米颗粒分离装置中，利用介电 泳力及流场力的共同作用，进行纳米颗粒分离。通过特殊电极产生不均匀电场，以对不同 粒径大小的颗粒施以不同介电泳力，配合流场力的作用，以实现不同粒径微粒的分离。

为了解决上述问题，根据本申请的一方面，提供一种微流控芯片，具有一主流道；所 述微流控芯片还包括：至少一进液流道，所述进液流道具有一进液口，并且所述进液流道 与所述主流道连接；至少两出液流道，每一出液流道具有一出液口，并且每一出液流道与 所述主流道连接；以及，一对电极，被配置为靠近所述主流道以在所述主流道处形成一不 均匀电场。

在一些实施例中，所述微流控芯片包含至少三个进液流道，每一进液流道分别于所述 主流道连接。优选地，所述至少三个进液流道与所述主流道处于同一平面，并在该平面上 延伸。优选地，所述至少三个进液流道中的一个进液流道用于向所述微流控芯片导入待分 离液，其余进液流道用于向所述微流控芯片导入缓冲液。

在一些实施例中，所述微流控芯片包含三个进液流道，每一进液流道分别于所述主流 道连接。优选地，所述三个进液流道所述主流道处于同一平面，并在该平面上延伸。更为 优选地，所述三个进液流道中的一个进液流道为待分离液流道，用于向所述微流控芯片导 入待分离液；其余两个进液流道为缓冲液流道，用于分别向所述微流控芯片导入缓冲液。 并且，更为优选地，所述待分离液流道先与一个缓冲液流道会合，然后再与另一个缓冲液 流道会合并与所述主流道连接。

在一些实施例中，所述进液流道具有依次相连的第一回型流道部、直流道部、第二回 型流道部和连接部，其中，所述直流道部连接所述第一回型流道与所述第二回型流道部， 所述连接部连接所述第二回型流道部与所述主流道，使得所述第一回型流道部被配置为靠 近所述进液流道的进液口，所述第二回型流道部被配置为靠近所述主流道。

在一些实施例中，所述第一回型流道部的流道宽度为160μm，所述直流道部的流道宽 度为160μm，所述第二回型流道部的流道宽度为20μm，并且，所述连接部的流道宽度为20μm。

在一些实施例中，所述一对电极包括一第一电极和一第二电极，所述第一电极被配置 为在靠近所述主流道处具有一尖端，所述第二电极被配置为在靠近所述主流道处具有一与 所述主流道平行的构型。

在一些实施例中，所述第一电极的所述尖端与所述主流道的距离为10μm。

在一些实施例中，所述微流控芯片还包括第一电极流道和第二电极流道，所述第一电 极流道和第二电极流道内分别填充金属以形成所述第一电极和所述第二电极。

在一些实施例中，所述金属为铋锡合金。

在一些实施例中，所述第一电极流道和所述第二电极流道与所述主流道处于同一平面， 并在该平面上延伸。

在一些实施例中，所述第一电极流道与所述第二电极流道分别具有一金属注入口和一 气体排出口，所述金属注入口和所述气体排出口分别通过密封连接的管路与外界连通。

在一些实施例中，所述微流控芯片由一第一基板与一第二基板相互贴合而成，其中， 所述第一基板在面朝所述第二基板的表面上设置凹槽，以与所述第二基板贴合后形成所述 进液流道、所述主流道、所述出液流道、所述第一电极流道、所述第二电极流道。

在一些实施例中，所述进液流道的进液口与每一所述出液流道的出液口分别通过密封 连接的管路与外界连通。

根据本申请的另一方面，提供一种纳米颗粒分离装置，上述任意一种微流控芯片，以 及一直流电源和复数个收集器，其中，所述直流电源与所述一对电极电性连接；所述微流 控芯片的每一出液流道的出液口与一收集器密封连接。

在一些实施例中，所述纳米颗粒分离装置还包括复数个缓冲液源，每一所述缓冲液源 与所述微流控芯片的一进液流道密封连接，以向所述微流控芯片导入缓冲液。

在本申请中，利用所述进液流道的设置，尤其是在所述微流控芯片中设置三个进液流 道并控制待分离液流道设置于缓冲液流道之间，使得在所述主流道中，在流场力的作用下， 使得所述待分离液中的待分离颗粒集中在所述主流道的中间偏上的位置。

此外，在本申请中，由于所述第一电极与所述第二电极的形状是不对称的，因而可以 在所述主流道处产生不对称电场，使得所述主流道内的待分离液发生介电电泳现象。利用 该介电电泳现象，使得介电泳力被施加到所述主流道中的待分离液内的带电纳米颗粒上。 由于所施加的介电泳力与带电粒子的大小成正比，因而较大尺寸的纳米颗粒会从所述主流 道的内壁一侧向另一侧排斥更多的力。因此，所述主流道中的待分离液内较小尺寸的纳米 颗粒(例如外泌体)继续在壁附近流动并进入一出液流道而被收集，而较大尺寸的纳米颗 粒(例如蛋白质和碎屑)则在介电泳力的作用下发生偏移并进入另一出液流道而被收集。

由此，本申请所述的微流控芯片及纳米颗粒分离装置利用介电泳力及流场力的共同作 用，通过不均匀电场配合流场力的作用，以实现不同粒径微粒的分离，可用于外泌体分离 纯化，同时也可以广泛推广到其他纳米颗粒分离邻域。

附图说明

图1是根据本申请一实施例的微流控芯片的结构示意图；

图2A是根据本申请一实施例的微流控芯片的第一基板的结构示意图；

图2B是图2A的局部放大图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的晶圆的研磨方法做详细说明。

在本实施例中，如图1所示，首先提供一种微流控芯片1，由一第一基板10与一第二基板20相互贴合而成。所述第一基板10在面朝所述第二基板20的表面10A上设置凹槽， 以与所述第二基板20贴合后形成所述微流控芯片1的各流道。即，在图1中，所述第一基 板10的下表面10A上设置凹槽并于所述第二基板20贴合以形成所述微流控芯片1的各流 道。在本实施例中，所述第一基板10的材料为PDMS，所述第二基板20的材料为玻璃。

以下，结合图2A和图2B详细描述本实施例的所述微流控芯片1的各流道设置。

由图1可知，本实施例中所述微流控芯片1的各流道是由形成于所述第一基板10的表 面10A上的各凹槽形成的。由此，图2A中显示所述第一基板10的表面10A上的结构。

如图2A所示，在本实施例中，所述微流控芯片1具有一主流道110，以及于所述主流道110分别连接的三个进液流道，图2A和图2B中以120A、120B和120C分别代表三个 进液流道。如图2A所示，所述三个进液流道120A、120B和120C与所述主流道110处于 同一平面，即所述三个进液流道120A、120B和120C与所述主流道110均处于所述第一基 板10的表面10A，且所述三个进液流道120A、120B和120C与所述主流道110均在所述 表面10A上延伸。并且，所述三个进液流道120A、120B和120C各自具有进液口，如图 2A所示进液口121A、121B和121C。

如图2A所示，所述微流控芯片1还具有两个出液流道，图2A和图2B中以130A和130B分别代表两出液流道。如图2A所示，所述两个出液流道130A和130B与所述主流道 110处于同一平面，即所述两个出液流道130A和130B与所述主流道110均处于所述第一 基板10的表面10A，且所述两个出液流道130A和130B与所述主流道110均在所述表面 10A上延伸。并且，所述两个出液流道130A和130B各自具有出液口，如图2A中所示出 液口131A和131B。

如图2A所示，所述微流控芯片1还具有第一电极流道141和第二电极流道142，所述第一电极流道141具有金属注入口1411和气体排出口1412，所述第二电极流道142具有金属注入口1421和气体排出口1422。由此，可以通过所述金属注入口1411和1421，向所述 第一电极流道141及所述第二电极流道142内分别注入熔融状态的金属，而所述第一电极 流道141和所述第二电极流道142内的空气则随着熔融状态的金属的注入而经由所述气体 排出口1412和1421排出。待注入的熔融状态的金属固化后，即可使得所述第一电极流道 141和所述第二电极流道142内形成用于产生不均匀电场的第一电极EL1和第二电极EL2。

以下结合图2A和图2B详细描述所述进液流道120A、120B和120C的详细构型。所 述进液流道120A、120B和120C具有相同的结构，下文以进液流道120A作为范例进行描 述。

如图2A和图2B所示，所述进液流道120A具有依次相连的第一回型流道部122、直流道部123、第二回型流道部124和连接部125；其中，所述直流道部123连接所述第一回型 流道122与所述第二回型流道部124，所述连接部125则连接所述第二回型流道部124与所 述主流道110，使得所述第一回型流道部122被配置为靠近所述进液流道120A的进液口 121A，所述第二回型流道部124被配置为靠近所述主流道110。所述第一回型流道部122 与所述第二回型流道部124的设置是为了确保所述进液流道120A内流体流动的稳定性。并 且，所述第一回型流道部122与所述直流道部123的流道宽度均为160μm，而所述第二回 型流道部124与所述连接部125的流道宽度均为20μm。所述进液流道120B、进液流道120C 均具有与上述进液流道120A相同的构型。

在本实施例中，当所述微流控芯片1被用于分离一待分离液内的纳米颗粒时，所述三 个进液流道120A、120B和120C中的一个进液流道为待分离液流道，用于向所述微流控芯片1导入待分离液；而其余两个进液流道则为缓冲液流道，用于分别向所述微流控芯片1 导入缓冲液。并且，为了使得进入所述主流道110内的所述待分离液中的待分离颗粒集中 在所述主流道110的中间偏上的位置，用于导入待分离液的待分离液流道被配置为先与一 个缓冲液流道会合，然后再与另一个缓冲液流道会合并与所述主流道110连接。

即，为了实现进入所述主流道110内的所述待分离液中的待分离颗粒集中在所述主流 道110的中间偏上的位置，如图2A和图2B所示，所述进液流道120B作为用于所述微流控芯片1导入待分离液的待分离液流道，所述进液流道120A和进液流道120C则作为用于 分别向所述微流控芯片1导入缓冲液的缓冲液流道；并且，作为待分离液流道的所述进液 流道120B先与作为缓冲液流道的所述进液流道120A会合，然后再与作为另一个缓冲液流 道的所述进液流道120C会合并与所述主流道110连接。由此，在流场力的作用下，作为待 分离液流道的所述进液流道120B内的分离液在进入所述主流道110内后，待分离液中的待 分离纳米颗粒集中在所述主流道110的中间偏上的位置。

以下，结合图2B详细描述所述第一电极EL1和第二电极EL2的详细构型。

如图2B所示，所述第一电极EL1被配置为在靠近所述主流道110处具有一尖端1413， 所述第二电极EL2被配置为在靠近所述主流道110处具有一与所述主流道110平行的构型 1423。并且，所述第一电极EL1的所述尖端1413与所述主流道110的距离为10μm。此外，所述第二电极EL2的与所述主流道110平行的构型1423与所述主流道110的距离为10μm。

由此，在所述主流道110出形成电场的所述第一电极EL1与所述第二电极EL2的形状 是不对称的，因而可以在所述主流道110处产生不对称电场，第一电极流道141和第二电极流道142使得所述主流道110内的待分离液发生介电电泳现象。利用该介电电泳现象， 使得介电泳力被施加到所述主流道110中的待分离液内的纳米颗粒上。由于所施加的介电 泳力与纳米颗粒的大小成正比，因而较大尺寸的纳米颗粒会从所述主流道110的内壁一侧 向另一侧排斥更多的力。因此，所述主流道110中的待分离液内较小尺寸的纳米颗粒(例 如外泌体)继续在壁附近流动并进入一出液流道130A而被收集，而待分离液内较大尺寸的 纳米颗粒(例如蛋白质和碎屑)则在介电泳力的作用下发生偏移并进入另一出液流道130B 而被收集。

在本申请中，设置形状不对称的所述第一电极EL1与所述第二电极EL2以确保在所述 主流道110处产生不对称电场，以及，所述第一电极EL1与所述第二电极EL2两者分别与所述主流道110之间的间距是能够在所述主流道110中的待分离液发生介电电泳现象的关键。既需要确保所述第一电极EL1与所述第二电极EL2的形状是不对成的以产生不对成电场，又需要确保所述第一电极EL1(与所述第二电极EL2)是足够靠近所述主流道110，以 确保所述主流道110处禅城的不对称电场足够强，使得施加于待分离液内的纳米颗粒的介 电泳力足以克服布朗力作用，进而实现不同粒径纳米微粒的有效分离。同时，还需要确保 所述第一电极EL1与所述第二电极EL2不能太过靠近所述主流道110，以避免所述主流道 110中的待分离液内发生电化学反应。

由于上述对于所述第一电极EL1与所述第二电极EL2的极为苛刻的设置条件，在本申 请中，通过形成如图2A中所示的第一电极流道141和第二电极流道142，并在所述第一电极流道141和所述第二电极流道142内注入低熔点的铋锡合金，使得熔融状态的铋锡合金能够完全充满所述第一电极流道141和所述第二电极流道142内，在自然冷却后即可形成满足上述特殊构型要求的所述第一电极EL1和所述第二电极EL2。

由此，通过上述结构设置，使得本申请所述微流控芯片1在所述主流道110内可以实 现对纳米颗粒同时施加介电泳力及流场力的共同作用，以实现不同粒径微粒的分离。

将图1所示微流控芯片1应用于一种纳米颗粒分离装置时，将图1所示第一基板10与 所述第二基板20密封贴合，并分别在图2A中所示的所述三个进液流道120A、120B和120C的进液口121A、121B和121C、所述两个出液流道130A和130B的出液口131A和131B、 所述第一电极流道141及所述第二电极流道142的金属注入口1411和1421，以及，所述第 一电极流道141及所述第二电极流道142的气体排出口1412和1421分别***密封连接的 管路30即可。

使用时，如图1、图2A和图2B所示，通过与所述第一电极流道141及所述第二电极流道142的所述金属注入口1411和1421密封连接的管路30，向所述第一电极流道141及 所述第二电极流道142内分别注入熔融状态的铋锡合金。而所述第一电极流道141和所述 第二电极流道142内的空气则随着熔融状态的铋锡合金的注入而经由与所述气体排出口1412和1421密封连接的管路30排出。待注入的熔融状态的金属固化后，即可使得所述第 一电极流道141和所述第二电极流道142内形成用于产生不均匀电场的第一电极EL1和第 二电极EL2。将与所述第一电极流道141及所述第二电极流道142的所述金属注入口1411 和1421密封连接的管路30与一直流电电源连接，即可使得所述第一电极EL1和第二电极 EL2之间产生不均匀电场。

同时，将与所述进液流道120B的进液口121B连接的管路30与一待分离液源流体连接， 而将与所述进液流道120A和120C的进液口121A和121C连接的管路30分别与缓冲液源流体连接，以实现向所述微流控芯片1内导入待分离液和缓冲液。

再者，将与所述出液流道130A和130B的出液口131A和131B连接的管路30分别与一收集器密封连接，从而使得所述主流道110内的待分离液在介电泳力及流场力的共同作用下，待分离液内较小尺寸的纳米颗粒(例如外泌体)继续在壁附近流动并进入一出液流道130A，进而通过出液口131A及管路30被一收集器收集；而待分离液内较大尺寸的纳米 颗粒(例如蛋白质和碎屑)则在介电泳力的作用下发生偏移并进入另一出液流道130B，， 进而通过出液口131B及管路30被另一收集器收集。