阅读说明：本技术 植物氮吸收相关蛋白nar及其编码基因与应用 (Plant nitrogen absorption related protein NAR and coding gene and application thereof ) 是由 白文钦 胡明瑜 王春萍 吴红 雷开荣 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本申请提供了植物氮吸收相关蛋白及其编码基因与应用,属于分子育种及生物工程领域。本申请提供的植物氮吸收相关蛋白NAR及其编码基因,通过转基因的方式,在植物尤其是作物体内表达植物氮吸收相关蛋白NAR的基因,表达出植物氮吸收相关蛋白NAR,尤其是在根系中特异性的过表达,就能提高植物氮素尤其是在低浓度氮素环境下的氮素吸收和转运能力,提高植物尤其是作物的产出,提高经济效益；还能减少氮肥的使用,减少环境污染,还具有一定的社会效益和环境效益。(The application provides plant nitrogen absorption related protein, and a coding gene and application thereof, belonging to the field of molecular breeding and bioengineering. According to the plant nitrogen absorption related protein NAR and the coding gene thereof, the gene of the plant nitrogen absorption related protein NAR is expressed in plants, particularly crops, in a transgenic manner, the plant nitrogen absorption related protein NAR is expressed, particularly, the specific overexpression in root systems is realized, the nitrogen absorption and transport capacity of the plants, particularly in the low-concentration nitrogen environment can be improved, the yield of the plants, particularly the crops, is improved, and the economic benefit is improved; the use of nitrogen fertilizer can be reduced, the environmental pollution is reduced, and certain social and environmental benefits are achieved.)

植物氮吸收相关蛋白NAR及其编码基因与应用

技术领域

本申请涉及分子育种及生物工程领域，具体而言，涉及植物氮吸收相关蛋白NAR及其编码基因与应用。

背景技术

氮素是植物生长的必需营养元素，世界范围内常施用大量氮肥以提高作物的产量。然而，氮肥不仅价格昂贵，还会污染环境，威胁人类身体健康。解决这一问题的其中一个策略是开发一些能够固氮和高效利用氮肥的作物，这样可以在减少氮肥利用的情况下获得较高的作物产量。

目前，仅有豆科等少数植物具有固氮能力，但是豆科植物是通过与固氮菌共生，通过固氮菌固定氮素；如果能使作物都具有强的氮吸收转运能力；一方面不仅能减少氮肥的使用，还能一定程度上提高植物的产出或产量。

因此，使作物具有强的氮吸收转运能力，是目前的研究的重点、热点和难点。

发明内容

本申请的公开了植物氮吸收相关蛋白NAR，植物氮吸收相关蛋白NAR的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

植物对氮素的吸收和利用，往往是通过根系完成。植物根系通过硝酸盐转运蛋白的介导，从土壤中吸收硝态氮和铵态氮。根据硝酸盐转运蛋白家族对硝酸盐的转运活性，可分为低亲和性和高亲和性两大类，其中硝酸盐转运蛋白1(NRT1)，属于低亲和力系统，除了拟南芥中的NRT1.1和水稻中的NRT1.1B之外，它们都具有低硝酸盐亲和力。在拟南芥的53个NP F/NRT1蛋白中，迄今为止已经有16个蛋白的功能被鉴定出。与NRT1不同，NRT2的大多数成员具有高亲活性，主要在低硝酸盐浓度下调控植物对硝酸盐的吸收或转运。在拟南芥中，已克隆并鉴定到7个NRT2蛋白与硝酸盐转运相关。有趣的是，NRT2蛋白不能单独转运硝酸盐，需在辅助蛋白NAR2的协助下完成，说明NAR2对于植物的氮吸收具有十分重要的作用。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸的序列MTMARPGAAL PLLLVVVGAC CARLAAAVHLSALGRTLIVE ASPKAGQVLH AGEDTITVTW HLNASASSVG YKALEVTLCY APASQE DRGW RKANDDLSKDKACQFRIARH AYAGGQGTLR YRVARDVPTA SYHVRAYALD A SGAPVGYGQ TAPAYYFHVA GVSGVHASLRVAAAVLSAFS IAALAFFVVV EKRRKDE *。

本申请的公开了编码植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因。

前述植物氮吸收相关蛋白NAR(nitrate assimilation related protein)的序列如SEQ ID NO.1所示，根据密码子的简并性和不同组合方法，因此编码植物氮吸收相关蛋白的编码基因的条数是一个巨大的数值。

在前述的编码基因的一些实施例中，编码基因可以是如SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2所示编码基因序列如ATGACGATGGCTCGTCCTGGGGCGGCTTTGCCG CTGCTGCTGGTCGTGGTCGGCGCTTGCTGCGCGCGCCTGGCGGCGGCAGTGCACCTCTC CGCGCTCGGCAGGACACTCATCGTCGAGGCGTCGCCGAAGGCCGGACAAGTCCTGCAC GCCGGCGAGGACACGATAACCGTGACATGGCACCTCAACGCGTCGGCGTCCAGCGTCG GGTACAAGGCGCTGGAGGTGACCCTCTGCTACGCGCCGGCGAGCCAGGAGGACCGCGG GTGGCGCAAGGCCAACGACGACTTGAGCAAGGACAAGGCGTGCCAGTTCAGGATCGCC CGGCATGCATACGCCGGCGGCCAGGGGACGCTCCGGTACAGGGTCGCCCGCGACGTCC CCACCGCGTCCTACCACGTGCGCGCCTACGCGCTGGACGCGTCCGGGGCGCCGGTGGG CTACGGCCAGACCGCGCCCGCCTACTACTTCCACGTCGCGGGCGTCTCGGGCGTCCACG CGTCCCTCCGGGTCGCCGCCGCCGTGCTCTCCGCGTTCTCCATCGCCGCGCTCGCCTTCT TTGTCGTCGTCGAGAAGAGGAGGAAGGACGAGTAG。

本申请公开了包含植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因的表达载体。

通过表达载体，可以表达出氮吸收相关蛋白NAR。

本申请公开了包含植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因的表达载体。

宿主细胞，宿主细胞表达植物氮吸收相关蛋白NAR；或包含表达植物氮吸收相关蛋白N AR的编码基因；或包含表达植物氮吸收相关蛋白NAR的表达载体。

宿主细胞可以是高表达植物氮吸收相关蛋白NAR，可以通过将编码植物氮吸收相关蛋白 NAR的基因整合到宿主细胞基因组进行植物氮吸收相关蛋白NAR的表达，或者直接以质粒形式独立在宿主细胞中进行表达。

本申请的公开了提高植物吸收和转运氮能力的方法，种植一种体内过表达植物氮吸收相关蛋白NAR的植物，植物氮吸收相关蛋白NAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过在植物体内过表达植物氮吸收相关蛋白NAR，植物氮吸收相关蛋白NAR的作用，协同植物硝酸盐转运蛋白进行氮素，尤其是低氮素环境进行氮素的吸收和转运工作，提高植物氮素的吸收和转运能力。

在前述提高植物吸收和转运氮能力的方法的一些实施例中，植物是在根系过表达氮吸收相关蛋白NAR。

在实施例中，一般情况下，植物吸收和转运氮素主要是通过根系进行吸收和转运，通过根系的主动运输，吸收土壤环境中氮素；因此通过增强根系吸收和转运氮素的能力，就能在很多程度上提高植物吸收、转运和利用氮素的能力。

由于施肥方式的不同也可以继续调整，通过改善叶面的吸收能力，通过叶面施用叶面肥，也可以一定程度上提高植物吸收和转运氮素的能力。

在前述提高植物吸收和转运氮能力的方法的一些实施例中，植物是水稻、小麦、玉米、高粱、烟草和小米中的一种。

在实施例中，目前人类的主要粮食作物包括大米、小麦、玉米等，高粱作为一种表现优异的作物种植业比较广泛；烟草作为一种经济作物也是广泛种植。但是目前这些作物的种植过程中都需要大量的使用化肥，化肥的使用不仅会导致环境污染，还会导致土壤的肥力下降，突然板结等问题；因此通过提高大米、小麦、玉米、高粱和烟草等作物，提高植物的氮素吸收和转运能力，尤其在低浓度氮素条件下，也能具有较好的氮素吸收和转运能力，就能减少化肥的使用，提高氮素的利用效率。

本申请的公开了一种检测植物氮吸收转运能力的试剂盒，试剂盒包含检测编码氮吸收相关蛋白NAR基因的检测引物，检测引物包含正向引物和反向引物，正向引物如序列SEQ ID NO.3所示，反向引物如序列SEQ ID NO.4所示。

检测引物正向引物SEQ ID NO.3：5’-CGATAACCGTGACATGGCACCT-3’；

检测引物反向引物SEQ ID NO.3：5’-CTACTCGTCCTTCCTCCTCTT-3’；

通过试剂盒中的引物，可以快速对作物进行检测，当然试剂盒中还可以有其他的方便进行实验的试剂，如DNA聚合酶，dNTP等，通过这些试剂可以实现快速的检测。

本申请的公开了一种检测植物氮吸收转运能力的方法，方法包括以下步骤：

取植物样本，提取植物样本的基因组DNA；

以如序列SEQ ID NO.3所示正向引物，如序列SEQ ID NO.4所示反向引物进行扩增；

如果扩增得到目的基因条带，则植物具有较好的氮吸收转运能力。

在实施例中，通过检测引物，检测作物中是否具有该基因片段，就能判断植物对氮素吸收和转运能力；如果检测到有该基因片段，则该植物就可能具有较好的氮素吸收和转运能力。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的植物氮吸收相关蛋白NAR及其编码基因，通过转基因的方式，在植物尤其是作物体内表达植物氮吸收相关蛋白NAR的基因，表达出植物氮吸收相关蛋白NAR，尤其是在根系中特异性的过表达，就能提高植物氮素尤其是在低浓度氮素环境下的氮素吸收和转运能力，提高植物尤其是作物的产出，提高经济效益；还能减少氮肥的使用，减少环境污染，还具有一定的社会效益和环境效益。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1是实施例1中ZmNAR2.3在玉米不同部位的表达水平示意图；

图2是实施例2中ZR启动子扩展GUS基因在根系中表达的示意图；

图3是实验例2中8个独立转化事件ZmNAR2.3基因的表达水平示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

植物氮吸收相关蛋白NAR编码基因的克隆及表达检测

玉米自交系B72种植在温室中(白天30℃，晚上24℃)，正常肥水管理，待玉米苗萌发后15d开始取幼嫩的根、茎和叶。对采集样品分别提取总RNA，并加入DNase Ⅰ酶去除DNA污染，体系为2μL DNA酶，45μL总RNA和5μL DNase Ⅰ酶buffer。37℃放置12～15min，然后用RNA清洁试剂盒纯化RNA(购自北京博迈德科技发展有限公司)。以提取的总RNA为模板，利用Clontech SMARTTM Library试剂盒(购自Clontech)合成cDNA。

利用ZmNAR2.3基因的克隆引物，克隆引物的正向引物如SEQ ID NO.5所示：5’-CCCCCGGGATGACGATGGCTCGTCCT(下划线表示SmaI酶切位点)；反向引物正向引物如S EQ IDNO.6所示：5’-CGAGCTCCTACTCGTCCTTCCTCCTCTT(下划线表示SacI酶切位点)，将基因片段克隆都相关克隆或表达载体，转化到宿主细胞，并测序得到ZmN AR2.3基因(即植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因)的序列如SEQ ID NO.2所示；得到植物氮吸收相关蛋白NAR的序列如SEQ ID NO.1所示。

以检测ZmNAR2.3基因表达的引物，正向引物如SEQ ID NO.3所示：5’-CGATAACCGTGACATGGCACCT-3’；检测引物的反向引物如SEQ ID NO.4所示：5’-CTACTCGTCCTTCCTCCTCTT-3’。以玉米ZmNADPH为内参基因，内参基因正向引物SEQ ID NO.7：CCCTTCATCACCACGGACTAC，内参基因反向引物SEQ ID NO.8：AACCTTCTTGGCACCACCCT，检测ZmNAR2.3的表达；按照SYBR Premix ExTaqTM试剂盒(购自宝生物工程有限公司) 操作指导，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative)PCR，qPCR)方法检测基因的相对表达量。ZmNAR2.3基因和内标ZmNADPH基因qPCR扩增的总反应体系为25μL，包括：12.5μL SYBRpremix ExTaqTM混合液，3μL cDNA，0.5μL上游引物(10μmol·L^-1)，0.5μ L下游引物(10μmol·L^-1，反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火20s， 72℃延伸30s，40个循环，每次循环第3步进行荧光采集。最后从60℃升温至95℃，每隔30s上升0.5℃，总共71个循环，实验设置3次重复。

实时荧光定量PCR结果如图1所示显示，该基因在玉米的茎秆中表达水平最高，其次是叶片、雌蕊以及雄蕊，而在根系中几乎没有表达。

实施例2

将得到ZmN AR2.3基因(即植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因)转化烟草检测基因的表达。

2.1玉米根系特异性启动子的克隆

利用玉米基因组克隆扩增根系特异启动子全长序列，将其命名为ZR启动子，在扩增引物的5＇端和3＇端分别添加限制性内切酶位点SmaI，克隆根系特异启动子的正向引物如S EQ ID NO.9所示：5’-CCCCGGGCTGTGCAGCAATAATGGCAGGCAA-3’(下划线表示 SmaI酶切位点)；反向引物如SEQ ID NO.10所示：5’-CCCCGGGCTTGCTTGATCACTAG CGCGAA-3’(下划线表示SmaI酶切位点)；克隆的启动子基因序列如SEQ ID NO.11所示；通过单酶切连接的方式构建到pBI121-35S-GUS载体上(pBI121用HindIII和SmaI酶切收集载体片段以后补平)，构建成pBI121-ZR-GUS载体，用农杆菌介导的遗传转化将其转入烟草中。同时，将pBI121-35S-GUS转入烟草中作为阳性对照。

对pBI121-ZR-GUS转基因烟草幼苗进行GUS染色，结果如图2所示，图2中A图是阴性对照烟草幼苗GUS染色照片，B图是转入pBI121-35S-GUS载体的阳性对照烟草幼苗GUS 染色照片，C图是转入pBI121-ZR-GUS载体的烟草幼苗GUS染色照片；从图中的对比可以看出，阴性对照未能染色，而阳性对照则是全株都有表达，全株能被染色；而有根系特异启动子实验组C图中，仅根系中有表达，能被染色，说明ZR启动子能够控制GUS基因在烟草根系中特异表达。

2.2利用玉米特异性启动子与ZmNAR2.3基因共表达检测ZmNAR2.3基因的表达

将扩增的带有限制性内切酶位点SmaI和SacI位点的ZmNAR2.3基因的序列通过酶切和连接，将ZmNAR2.3基因构建到pBI121-ZR-GUS载体中，得到pBI121-ZR-ZmNAR2.3载体；并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其转化到烟草中，共得到30个独立的转化事件分别命名为RZ1到RZ30，选取其中8个独立转化事件的根系进行ZmNAR2.3表达水平的检测。检测ZmNAR2.3基因表达的引物，正向引物如SEQ ID NO.3所示：5’-CGATAACCGTGACATG GCACCT-3’；检测引物的反向引物如SEQ ID NO.4所示：5’-CTACTCGTCCTTCCTCCTC TT-3’

结果如图3所示，在8个独立转化事件的ZmNAR2.3基因都能够在烟草的根系中正常表达，且部分转化事件还具有较高的表达水平。

实施例3

验证转基因烟草在低氮条件下的生长

选取T2代纯合的转基因烟草种子RZ13和RZ27进行低氮耐受实验。将种子置于人工气候箱，25～28℃，黑暗条件下发芽，一周以后，将幼苗移至山崎营养液培养，山崎培养液佩服见表1；进行水培一个月。一个月后，选取长势一致的烟草幼苗进行低氮处理。处理时，山崎营养液中的Ca(NO₃)₂·4H₂O，KNO₃，NH₄H₂PO₄浓度分别为对照组的50％和20％，并通过补充添加CaCl₂、K₂SO₄、KH₂PO₄来弥补Ca(NO₃)₂·4H₂O，KNO₃，NH₄H₂PO₄用量减少导致的Ca、K、P缺乏。营养液pH为6.2～6.4，培养温度25℃，每天光照12h，光照强度200 μmol·m^-2·s^-1，空气相对湿度70％～80％，每3天更换一次营养液。一个月以后测量实验组烟草和对照组烟草整株、地上部分及地下部分的干重；以及实验组烟草和对照组烟草整株、地上部分及地下部分的含氮量。

表1山崎营养液组成

表2低氮处理对烟草生长的影响

结果如表2所示，在只含有50％N元素的山崎培养液中，转基因烟草的高度较非转基因分离后代(NULL系)分别提高了12.1％和16.2％，地上部分干重提高了17％和15.4％，地下部分干重均提高了7.5％，地上部分含氮量提高了17％和12.6％，而地下部分含氮量变化不大。

在只含有20％N元素的山崎培养液中，转基因烟草的高度较非转基因分离后代分别提高了19％和19.4％，地上部分干重提高了9％和7％，地下部分干重提高了5.1％和7.7％，地上部分含氮量提高了17.4％和13.2％，而地下部分含氮量变化不大。以上结果显示，在低氮条件下，转基因烟草较非转基因烟草的生长状况更加良好，表现出了一定耐低氮能力。

综上可以看出，本发明提供的ZmN AR2.3基因(即植物氮吸收相关蛋白NAR的编码基因)在植物中能正常表达出ZmNAR2.3蛋白，并发挥作用。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

序列表

<110> 重庆市农业科学院

<120> 植物氮吸收相关蛋白NAR及其编码基因与应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 197

<212> PRT

<213> 1(Zea mays)

<400> 1

Met Thr Met Ala Arg Pro Gly Ala Ala Leu Pro Leu Leu Leu Val Val

1 5 10 15

Val Gly Ala Cys Cys Ala Arg Leu Ala Ala Ala Val His Leu Ser Ala

20 25 30

Leu Gly Arg Thr Leu Ile Val Glu Ala Ser Pro Lys Ala Gly Gln Val

35 40 45

Leu His Ala Gly Glu Asp Thr Ile Thr Val Thr Trp His Leu Asn Ala

50 55 60

Ser Ala Ser Ser Val Gly Tyr Lys Ala Leu Glu Val Thr Leu Cys Tyr

65 70 75 80

Ala Pro Ala Ser Gln Glu Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Asn Asp Asp

85 90 95

Leu Ser Lys Asp Lys Ala Cys Gln Phe Arg Ile Ala Arg His Ala Tyr

100 105 110

Ala Gly Gly Gln Gly Thr Leu Arg Tyr Arg Val Ala Arg Asp Val Pro

115 120 125

Thr Ala Ser Tyr His Val Arg Ala Tyr Ala Leu Asp Ala Ser Gly Ala

130 135 140

Pro Val Gly Tyr Gly Gln Thr Ala Pro Ala Tyr Tyr Phe His Val Ala

145 150 155 160

Gly Val Ser Gly Val His Ala Ser Leu Arg Val Ala Ala Ala Val Leu

165 170 175

Ser Ala Phe Ser Ile Ala Ala Leu Ala Phe Phe Val Val Val Glu Lys

180 185 190

Arg Arg Lys Asp Glu

195

<210> 2

<211> 594

<212> DNA

<213> 2(Zea mays)

<400> 2

atgacgatgg ctcgtcctgg ggcggctttg ccgctgctgc tggtcgtggt cggcgcttgc 60

tgcgcgcgcc tggcggcggc agtgcacctc tccgcgctcg gcaggacact catcgtcgag 120

gcgtcgccga aggccggaca agtcctgcac gccggcgagg acacgataac cgtgacatgg 180

cacctcaacg cgtcggcgtc cagcgtcggg tacaaggcgc tggaggtgac cctctgctac 240

gcgccggcga gccaggagga ccgcgggtgg cgcaaggcca acgacgactt gagcaaggac 300

aaggcgtgcc agttcaggat cgcccggcat gcatacgccg gcggccaggg gacgctccgg 360

tacagggtcg cccgcgacgt ccccaccgcg tcctaccacg tgcgcgccta cgcgctggac 420

gcgtccgggg cgccggtggg ctacggccag accgcgcccg cctactactt ccacgtcgcg 480

ggcgtctcgg gcgtccacgc gtccctccgg gtcgccgccg ccgtgctctc cgcgttctcc 540

atcgccgcgc tcgccttctt tgtcgtcgtc gagaagagga ggaaggacga gtag 594

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

cgataaccgt gacatggcac ct 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

ctactcgtcc ttcctcctct t 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

<400> 5

cccccgggat gacgatggct cgtcct 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(6)

<400> 6

cgagctccta ctcgtccttc ctcctctt 28

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

<400> 7

cccttcatca ccacggacta c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 8

aaccttcttg gcaccaccct 20

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(9)

<400> 9

ccccgggctg tgcagcaata atggcaggca a 31

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(10)

<400> 10

ccccgggctt gcttgatcac tagcgcgaa 29

<210> 11

<211> 3154

<212> DNA

<213> 11(Zea mays)

<400> 11

ctgtgcagca ataatggcag gcaacgcatc gatgacgctg ttcctggccg ttagcctagt 60

gatgttcgcc atggccagcg cgtgcggtgg caactgcccc acgccgaccc cgtccacccc 120

gaccccaacg ccggcctcgt tcggcaagtg cccccgcgac gcgctcaagc tgggcgtgtg 180

cgctaatgtt ctggggctga tcaaggccaa ggtgggcgtg ccgcccacgg agccatgctg 240

cccgctgctg aagggactcg tcgacctcga ggccgccgtg tgcctctgca ccgccatcaa 300

gggagaggtc ctcggaatca agctcaacct accggtcgac ctcagcctta tcctcaacca 360

ctgcggcaag agagtgccca ccggattcaa gtgcctctaa gctataagcc gcggggagca 420

tgccgacgtg ctcttctgct tgccattctt cgtcttactg tctcaataat gcagccttct 480

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gcagctttcg cttttgggtg tttcttttat gtaagtgtct cgtcctttga atggacgtga 660

ccctgaacta ttaagatttt tgttctttta tttgtatccg gcaatctgct tgatgaataa 720

agcttatata ttgttcgaaa tatgtgtgca tattgttcta atatcagatt ttgttatgag 780

tcatatttca ttttcataca cgtttgcaaa tgcactacat aaaacataat taattgaggc 840

aacgatccat atacatttga gacgtcgaat tactagtatt catgcatgat acatttgagg 900

caattatcca taattaatcg atcggcaacg gctagcttcc aaccgttagc tagtccatgt 960

agaaggcact agacgtgtct agtggcacgc catacatatc ggttcctgtc caaaaaactc 1020

taccacgcct ttcaatagct cttttgggct tgagggctat aaatagcacc acaatgggtc 1080

atttctcaag ttttgtgctg aaaaacatag caagagaaat tgagactccg atctattagt 1140

tcttagacat ctaagtgctt taaggttact cggtgattcg tgtaggtgtt ttgcaaagta 1200

cttaagtcag ttagaccgtc actatgacac ttgctctagg ttatgcctag ttgagctaga 1260

caccctcaaa cccttgatgc ttgtgcgcac cattatatgc attgacactt gcgcgtgttc 1320

gtagagttgt accagtaagg gttgtatctt gtgagatcac actaaccatg tttgtgctgc 1380

ggcctccacc gtatactaga gcgaacgagg tcatgatgtt tcagtcagaa gttcgatagt 1440

gaagacaacc aagagcatcc gagagaggcc aaatgcggag cgccacttat gagtggtgaa 1500

ggctcgtgac tatctgcgga gttacatggc taggagcttg gccctcgtgt gggctaccct 1560

ttgcgtaggg gctctaacga ggattaggaa gaagcttacg tatttcttga taccttagta 1620

aaaatatcag cgtgtccaca tgacttatat ctctatctca tttaagcttc cgcatttata 1680

ttgctaactt tggttgtgtg ctttaccttt cctaacttag ttatatgcta gttagtagga 1740

ctgaaaacct aggttacata actccattat agagatagca acacttaaac aaaaccttag 1800

ttgcactagc tttcttggtt atatatttgt ataggttttg cttaagagat tcaattaaaa 1860

gcctaaatta gcgtgaatag ttgttcggat tcatccctct cttagatgcc cacgttcctt 1920

ctagagagca tttgatcctg cttgcacgga tgaaggggga gcgacacact tacatgggtg 1980

ctctaacaag gatcaatgag gagtgttgac tctctgatat ctcgataaaa catcatcata 2040

ttaataatcc ttctttactt tgaacattta cattcaagca attcaattct tgttttgtat 2100

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ataattgaaa atttatgtat gcttaaagag tgaagtgggc tattcgatag cattgatcta 2220

ttataagaag tattatttta atataattta ccgttctttt ggacatctta gtcttgtatt 2280

aaactatttt tgaacttatg cacgtcattt atgtttctta agcttggagc ttgccaagtg 2340

ttttctggac tttgtgaagt gcatgaagca ctcggcaaaa gagttatctg cggtagtgaa 2400

gagttcgggt aaatttatta gtacactctt ttttcataaa caagcggaac catctagcca 2460

acagtacgtc atacaaaaag ggcacccacc gttgtttgtg ggaatgcttt ttaagcaaat 2520

tcaagcctct aactttgaat gttccaactg aacataataa accttgaccc gatcaggaac 2580

agagctaaag caaattttag tgattgcaat tgccttctga gcgcattcag ttttaccatg 2640

caagggtgca cccgtaccca ccgctatatg caattatgca tagctctgcg cttggatccc 2700

gtgaagtgca gaaaaaaaaa tacttcaact gttcaacaac ttgggcgtcc accgtccatg 2760

catcaccatg atacctctgc tgatgtttag cactcgatca cgttactaga tacaagcagc 2820

caacccatat gacaagttcg tcctaaactg aataaaaatg atcaaccatc aagcgagaac 2880

aaacatcaac atgcatccac cagtggagca atcttggcca cttgcgctgt tctgcattga 2940

tcagccatct aattaataat cgccctcaca tgcactcatg ctcacgggaa tgtaaactca 3000

cacaacaaca ctgctattac aataatcggc actgcgccga tggttctcct ataaatgcaa 3060

caatcaagcg ccaccacgaa ccatcacaag cgcttagtga tcagttaata ctaagggcag 3120

gcacacctct gcttcgcgct agtgatcaag caag 3154