一种sirpa人源化动物模型的构建方法及其应用
阅读说明：本技术 一种sirpa人源化动物模型的构建方法及其应用 (Construction method and application of SIRPA humanized animal model ) 是由 琚存祥 李松 张明坤 侯欢欢 赵静 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备SIRPA人源化动物模型的方法,该方法利用基因编辑技术,用人源SIRPA基因编码的胞外区替换鼠源Sirpa基因编码的胞外区,通过免疫系统指标评价和肿瘤药效试验检测了该模型,证实获得的小鼠模型构建成功。该模型将助力SIRPA靶向药物的筛选评价。(The invention provides a method for preparing a SIRPA humanized animal model, which utilizes a gene editing technology to replace an extracellular region coded by a murine Sirpa gene with an extracellular region coded by a humanized SIRPA gene, detects the model through immune system index evaluation and tumor pharmacodynamic test, and proves that the obtained mouse model is successfully constructed. The model is used for screening and evaluating the assisted SIRPA targeted drug.)
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编 辑技术的SIRPA基因修饰人源化动物模型的构建方法。
背景技术
癌症免疫疗法是借助人体自身的免疫系统，去攻击癌细胞的治疗方法。免疫 系统和癌细胞之间的抗衡是一个长期博弈的动态过程，既正面交锋也相互交织。 健康机体的免疫细胞能够发现和杀灭大部分癌变细胞，但在各种先天或者后天因 素的诱导下，免疫系统会失去绝对优势，甚至被癌细胞“策反”，成为癌症发生 和发展中关键的一员。
由于许多肿瘤调理抗体和检查点抑制剂被批准，甚至更多的药物正在评估临 床使用，抗体为基础的癌症治疗已成为治疗恶性肿瘤患者最成功和重要的战略之 一。然而，癌症免疫治疗领域的一个主要挑战是只有一小部分癌症患者才能获得 完全持久的反应。联合免疫疗法不仅可以靶向免疫和癌细胞中不同的调控途径， 而且可以靶向不同类型的肿瘤浸润免疫细胞，可能是一种有前途的方法来诱导快 速和持久的抗肿瘤反应，并阻止治疗诱导的耐药、传播和癌细胞转移。
抑制性受体信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα，SIRPA)是SIRP 家族中一个典型的抑制性免疫受体，其与CD47结合形成CD47-SIRPA信号复合 体，该复合体具有调控免疫应答及介导双向信号调节的作用，也参与多种生理活 动，如中性粒细胞的趋化、巨噬细胞的吞噬等，同时在诱导T细胞的免疫耐受、 活化等方面也发挥着调节作用。
癌细胞表面高表达CD47，其与SIRPA结合抑制巨噬细胞介导的吞噬作用。 在一项研究中，用SIRPA的高亲和力变体，拮抗癌细胞上CD47引起癌细胞的 吞噬作用增加。另一项在小鼠中的研究发现，抗SIRPA抗体在单独或与其他药 物协同使用时，能够抑制癌症生长和转移。利用SIRPA的单克隆抗体来阻断 CD47-SIRPA这一信号通路，能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的趋化吞噬，为肿瘤的 靶向治疗提供新的方法。
免疫检查点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，啮齿类动 物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为人类肿瘤治疗研究中不可或缺的替 代模型。但由于种属性的差异，在小鼠上筛选的免疫检查点抗体并不完全试用于 人类。我们通过基因修饰的方法，将人类的编码基因替换小鼠相应的基因，制备 的免疫检查点人源化小鼠模型，具有人类的功能性基因，可用来筛选评价人类的 免疫检查点药物。
SIRPA人源化小鼠是指利用基因修饰的方法，在免疫系统健全的小鼠上，将 鼠源的SIRPA基因替换为人源的基因，构建能与抗人源SIRPA单抗相互作用的 小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留 了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人类基因的药物，是非常理想的临床 前药物测试模型。同时我们将自主研发的PD1人源化小鼠与SIRPA人源化小鼠 配繁，获得PD1与SIRPA均人源化小鼠模型，能够用于评价人类PD1抗体，SIRPA 抗体以及两者联合使用的肿瘤抑制效果及药物的安全性评价，为临床实验提供更 有效的用药策略。在SIRPA人源化小鼠的过程中，我们对于基因编辑技术中用 到的各个原件和步骤包括sgRNA、打靶载体等进行了充分的优化和调整，保证 了采用该技术制备SIRPA人源化动物模型的高成功率和高准确率。
发明内容
本发明提供了一种制备SIRPA人源化动物模型的方法，其特征在于，利用 Crispr/Cas9技术将鼠源Sirpa基因编码的胞外区用人源SIRPA基因编码的胞外区 替换，保留鼠源的胞内区，打靶成功的SIRPA人源化产物的氨基酸序列为SEQ ID No:2所示。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1)选择鼠源Sirpa基因的胞外区两端作为打靶位点，设计包含人源SIRPA 基因胞外区的同源DNA供体；
2)制备Cas9或其表达载体；在人源化替换区域设计针对鼠源序列的sgRNA， sgRNA序列见下：
sgRNA名称
sgRNA序列(5’→3’)
hSIRPA-5S3
CGTGAATTCCCCACAGA(SEQNo.3)
hSIRPA-3S3
GCTGGCGATCTGGCTCA(SEQNo.4)
3)将Cas9/sgRNA系统及打靶载体共注射或共电转至鼠受精卵中，并将受精 卵移植入受体母鼠生产SIRPA人源化鼠。
优选地，其中人源SIRPA基因胞外区的序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，其中所述鼠为C57BL/6背景或BALB/c背景鼠。
优选地，所述方法进一步包括基因鉴定筛选出中靶F0鼠，将其与背景鼠配 繁，其后代鼠为F1，对获得的F1鼠进行PCR鉴定的步骤。
优选地，其中PCR鉴定使用的引物为：
优选地，进行PCR鉴定时，引物003657-msirpa-5tF1/003657-hSIRPA-5tR1 分别位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产 物，说明目标载体在鼠基因组5’进行了有效***； 003657-hSIRPA-3tF1/003657-hSIRPA-3tR1分别位于打靶载体的人源片段内及3’ 同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在鼠基因组3’进行 了有效***。
优选地，所述方法进一步包括对鼠模型进行人源SIRPA的表达检测和/或免 疫系统指标评价。
本发明还提供所述方法在制备筛选SIRPA靶向药物的动物模型中的应用。
本发明还提供所述方法在制备评价SIRPA靶向药物或评价SIRPA靶向药物和 其他药物联用的疗效的动物模型中的应用。
进一步地，本发明提供特异性靶向鼠源Sirpa基因胞外区的sgRNA，其序列 如SEQID NO：3-4所示。
本发明具有以下积极效果：
1、本发明采用了Crispr/Cas9技术，用人源SIRPA的胞外区针对性的替换鼠 源SIRPA的胞外区，与现有技术中制备SIRPA人源化动物模型的手段不同。实 现了在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的SIRPA基因替换为人源的基因，构建 能与抗人源SIRPA单抗相互作用的小鼠模型。该模型与普通小鼠相比，实现了 关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对 人类基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。
2.本发明提供了优化的制备人源化SIRPA动物模型的具体操作方法，该方 法中优化了各个步骤和参数。尤其是，通过大量的创造性劳动，获得了效果最优 的hSIRPA-5S3和hSIRPA-3S3对，在目前sgRNA设计难度大且效果不可预期的 情况下，该对sgRNA的选择有着显著的意义。此外，制备流程中的基因鉴定手 段、免疫系统评价手段等均是申请人付出创造性劳动确定的，这些都确保了动物 模型制备的高成功率。
附图说明
图1为SIRPA-KI-target 5端与3端鉴定电泳图：其中B6阴性对照为基因组 DNA；N为空白对照,无模板的对照；TRANS 2K PLUS II条带： 8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图2为SIRPA-KI-target 5端与3端鉴定电泳图：WT阴性对照为基因组DNA； N为空白对照,无模板的对照；P为阳性对照；M为TRANS 2K PLUS II条带： 8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图3为BALB/c-hPD1/hSIRPA纯合小鼠与BALB/c背景鼠中的SIRPA表达 结果。
图4为B6-hSIRPA纯合小鼠和B6背景鼠中的SIRPA表达结果。
图5为B6-hSIRPA纯合小鼠和B6背景鼠中的淋巴细胞分群检测。
图6为BALB/c-hPD1/hSIRPA纯合小鼠和BALB/c背景鼠中的淋巴细胞分群 检测。
图7为各组荷瘤鼠的体重变化曲线。
图8为不同组的肿瘤体积变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明 书文字能够据以实施。
实施例1：SIRPA人源化小鼠模型建立
利用CRISPR Cas9的方式在C57BL/6背景和BALB/c背景的小鼠上将人类 SIRPA替换鼠的Sirpa基因，从而构建可以表达人源SIRPA的小鼠模型。并通过与 自主产权的PD1人源化鼠配繁，获得可以表达人源SIRPA和PD1的双人源小鼠模 型。
1、确定人源片段替换区域及***的人源序列
根据人源SIRPA的结构及功能，我们选取人源SIRPA基因编码的胞外区替 换鼠源Sirpa基因编码的胞外区，保留小鼠的胞内区，选取的人源SIRPA基因编 码的胞外区氨基酸序列(Aa：28-362)为SEQ No.1所示。
GVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFP RVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVS GPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTRE DVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQ LTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHD LKVSAHPKEQGSNTAA
2、人源化SIRPA蛋白的拼接序列确定
利用同源重组将人源SIRPA基因编码的胞外区替换BALB/c和B6鼠源Sirpa 基因编码的胞外区，保留BALB/c和B6小鼠的胞内区序列,打靶成功的SIRPA人 源化小鼠的氨基酸序列为SEQ No.2所示(下划线部分为人源氨基酸序列，加粗 斜体字体为鼠源氨基酸序列)。
SEQ No.2：
MEPAGPAPGRLGPLLLCLLLSASCFCTGVAGEEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQW FRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVR AKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDV HSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETA STVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAADNNATHN
3、载体注射移植获得阳性鼠
1)选择小鼠Sirpa基因的胞外区两端作为打靶位点，设计包含人源SIRPA基 因胞外区的同源DNA供体和鉴定方案；
2)基于CRISPR/Cas9技术，制备Cas9或其表达载体；在人源化替换区域设 计针对鼠源序列的sgRNA。设计并合成识别5’端靶位点和3’端靶位点，并构 建sgRNA表达载体。两端sgRNA识别位点分别位于小鼠Sirpa基因胞外区的两端， 各sgRNA在Sirpa上的靶位点序列见表1。将各sgRNA序列克隆至 pUC57kan-T7-delG载体中，构建puc57-sgRNA质粒。
表1sgRNA序列
sgRNA名称
sgRNA序列(5’→3’)
PAM
hSIRPA-5S1
ACAAATTCAGGCCGGGCG
TGG
hSIRPA-5S2
GAGCGTGAATTCCCCACAG
AGG
hSIRPA-5S3
CGTGAATTCCCCACAGA
AGG
hSIRPA-3S1
CCTCTATGAGACATTAA
AGG
hSIRPA-3S2
AGGCTGGCGATCTGGCTC
AGG
hSIRPA-3S3
GCTGGCGATCTGGCTCA
GGG
sgRNA转录制备方法：以PrimerStar或PrimerStar Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R 为引物，测序正确的puc57-sgRNA质粒为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制 备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(AM1354)进行 sgRNA的转录。
sgRNA筛选：分别将5’端和3’端的sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，将混 合液注射至0.5天的受精卵中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠Sirpa基因的ko阳 性率的鉴定，以此筛选切割活性高的sgRNA，分别选择5’端和3’端切割活性 高的sgRNA配对成sgRNA对。
sgRNA切割鉴定方法：对收集的囊胚进行PCR扩增(PCR方案如下表2)，将 扩增条带进行二代测序(5S1-5S3测序引物：Sirpa-sgRNA-In5F1，3S1-3S3测序引 物：Sirpa-sgRNA-In3R1)，与wt条带比对，统计发生突变的概率(鉴定结果见下 表3)，最终选择hSIRPA-5S3和hSIRPA-3S3。
表2sgRNA切割PCR鉴定方案
表3sgRNA切割活性
sgRNA名称
切割效率
hSIRPA-5S1
19/20＝95％
hSIRPA-5S2
15/16＝93.8％
hSIRPA-5S3
18/19＝95％
hSIRPA-3S1
20/20＝100％
hSIRPA-3S2
17/20＝85％
hSIRPA-3S3
18/19＝95％
根据表3结果选择切割效率高的hSIRPA-5S3和hSIRPA-3S3用于下一步实验。
3)将Cas9/sgRNA系统及打靶载体注射至0.5天的小鼠受精卵中(敲除小鼠 Sirpa基因的胞外区的同时将人源SIRPA基因的胞外区***到基因组)，移植至0.5 天假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠(F0)。
4)人源化小鼠F1代基因型鉴定：将基因鉴定筛选出中靶F0小鼠与背景鼠 配繁，其后代小鼠为F1，对获得的F1小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物 进行中靶后的两端PCR鉴定，引物003657-msirpa-5tF1/003657-hSIRPA-5tR1分别 位于5’同源臂外及打靶载体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明 目标载体在小鼠基因组5’进行了有效***；
003657-hSIRPA-3tF1/003657-hSIRPA-3tR1分别位于打靶载体的人源片段内及3’同 源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标载体在小鼠基因组3’进行了有 效***。对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证，同源DNA供体在小鼠 基因组中替换小鼠相应序列后，测序正确的克隆经鉴定为阳性小鼠。
表4F1鉴定引物
注：KI为中靶基因型；WT为野生型；KI/KI为纯合子；KI/WT为杂合子
PCR反应体系以及反应条件如下表所示：
表5PCR反应体系
试剂(TakaraR045)
体积(μl)
规格
PrimeSTAR Max Premix(2×)
12.5
\
ddH<sub>2</sub>O
9.5
\
Primer
1
10μM
Primer
1
10μM
Template
1
表6PCR反应条件
结果：BALB/c背景获得10只阳性F1小鼠。如图1所示，hSIRPA F1鼠尾DNA 鉴定电泳图，5’及3’鉴定有目的条带的均为阳性，表明小鼠为正确中靶的阳性小 鼠；其余鉴定无条带的均为阴性，小鼠处理。B6背景获得11只阳性F0小鼠。 如图2所示，hSIRPA F1鼠尾DNA鉴定电泳图，5’及3’鉴定有目的条带的均为阳 性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠；其余鉴定无条带的均为阴性，小 鼠处理。
BALB/c背景F1代鼠尾进行SIRPA基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果见 图1所示，92#、96#、98-103#，105#，111#小鼠的人源SIRPA基因5’及3’鉴 定均为阳性，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠。F1大量扩繁后可与自 主产权PD1人源化小鼠配繁，获得SIRPA与PD1双人源化小鼠纯合子小鼠，简 称BALB/c-hPD1/hSIRPA。
B6背景F1代鼠尾进行SIRPA基因鉴定，F1代小鼠PCR实验结果见图2所 示，71-73#、77#、83#小鼠的人源SIRPA基因5’及3’鉴定均为阳性，表明 小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠。F1大量扩繁后可与自主产权PD1人源化 小鼠配繁，获得SIRPA与PD1双人源化小鼠纯合子小鼠，简称B6-hPD1/hSIRPA。
实施例2B6-hSIRPA和BALB/c-hPD1/hSIRPA小鼠中人源SIRPA表达及免 疫系统验证
通过流式细胞术分析SIRPA纯合小鼠的表达情况并对免疫细胞类群进行检 查，经分析能够成功表达人源化基因，且未造成免疫系统明显异常的小鼠可供肿 瘤药效实验。
1.蛋白表达检测
选取SIRPA主要表达组织胸腺或脾脏，检测组织中SIRPA蛋白的表达。
SIRPA蛋白流式检测方法：
a)取材：剪取人源化小鼠和背景鼠脾脏，称重，置于C型管。
b)消化：脾脏与胸腺使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+ 30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加 300ul 0.1M的EDTA终止消化。取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块， 每管加2mL FACS buffer中和EDTA。8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每 管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去 上清，加1mL FACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加FACS buffer重悬，调整细胞浓度1×107/mL，分到流式管中100uL，准备孵 育抗体。
c)封闭：根据实验需要，将100uL(约106个)细胞分到不同的流式管中， 加Fcblock(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀， 冰上孵育5min。
d)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(hSIRPA，mSIRPA，CD3 抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50uL抗体混合液，涡旋混匀；单染 管每管加0.5ul抗体，涡旋混匀；冰上避光孵育1h；
e)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添 加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
检测结果：使用人源抗SIRPA抗体及鼠源抗SIRPA抗体，通过流式细胞仪 检测B6-hSIRPA纯合小鼠和C57BL/6背景鼠以及BALB/c-hPD1/hSIRPA纯和小 鼠和BALB/c背景鼠中巨噬细胞表达人源和鼠源SIRPA的情况，背景鼠中未检 测到人源SIRPA表达，而B6-hSIRPA纯合小鼠和BALB/c-hPD1/hSIRPA纯合小 鼠中能检测到人源SIRPA表达。(见下图3，图4)
2.免疫系统验证
选取小鼠的主要免疫器官脾脏，剪取SIRPA人源化纯合小鼠和相应背景鼠 的脾脏，将组织研磨消化成单个细胞，用鼠源T\B\NK表面抗体对组织细胞胞外 蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式细胞检测T(CD4+、CD8+)、B、 NK细胞数量。
免疫细胞流式检测方法：
a)取材：剪取SIRPA人源化纯合小鼠和相应背景鼠脾脏置于C型管。
b)消化：脾脏使用酶消化液(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+ 30ugDNase+1.75mg胶原酶D)，37℃，消化30min。将消化完成的脾脏细胞加 300ul 0.1M的EDTA终止消化。取1mL用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块， 每管加2mL FACS buffer中和EDTA。8℃,400g,离心5min,去上清，脾脏每 管加3ml 1×RBC混匀，室温避光裂解红细胞5min，8℃,400g,离心5min,去 上清，加1mL FACS buffer重悬，过滤；8℃,400g,离心5min,去上清，加 FACSbuffer重悬，调整细胞浓度1×107/mL，分到流式管中100uL，准备孵 育抗体。
c)封闭：根据实验需要，将100uL(约106个)细胞分到不同的流式管中， 加Fcblock(CD16/32抗体)每管加1ul CD16/32抗体(1:100稀释)混匀， 冰上孵育5min。
d)抗体孵育：根据样品管数目配置抗体混合液(CD19，CD4，CD8，CD335， CD3抗体)，按照抗体最佳用量添加，每个样加50uL抗体混合液，涡旋混匀；单 染管每管加0.5ul抗体，涡旋混匀；冰上避光孵育1h；
e)清洗：FACS buffer洗涤，加入FACS buffer，上机检测。上样前5min添 加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死活细胞。
检测结果：如图5所示，B6-hSIRPA纯合小鼠的各T、B、NK免疫细胞数 量与B6背景鼠相比无明显差异；如图6所示，BALB/c-hPD1/hSIRPA纯合小鼠 的各T、B、NK免疫细胞数量与BALB/c背景鼠相比无明显差异。以上数据表 明人源SIRPA参与到了小鼠的免疫应答过程，人源化小鼠免疫系统正常，与普 通背景鼠相较无差异，可用于SIRPA靶向药物评价。
实施例3B6-hSIRPA人源化小鼠评价抗SIRPA抗体的肿瘤药效验证
由于体外水平的验证数据，并不足以反映hSIRPA在人源化小鼠体内的实际 情况，本发明设计实验收集以下体内实验数据：荷瘤的B6-hSIRPA人源化小鼠 对抗hSIRPA抗体抗肿瘤药效反应性以及对抗hSIRPA抗体和抗mPDL1抗体联 用的抗肿瘤药效反应性。
检测方法：MC38-hCD47(鼠源CD47人源化的MC38肿瘤细胞系)细胞培 养。复苏细胞：液氮罐中取出，于37℃水浴锅中迅速解冻，接种在15cm dish中 培养。传代：MC38-hCD47属于贴壁细胞，通常情况下，每2-3天需要进行一次 传代。皮下注射MC38-hCD47细胞：收集细胞，1000rpm离心5min，弃去上清， 用10ml无钙镁离子的PBS洗2次。PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为5×106/ml。 皮下注射，将100μl MC38-hCD47细胞注射到B6-hSIRPA人源化小鼠右侧背部， 大腿上方。观察与测量：分组前每天观察小鼠的生长情况，每周称重2次。确认小鼠荷瘤后，对肿瘤大小进行检测。分组：接MC38-hCD47细胞11天后，肿瘤 平均体积为80-120mm3，将小鼠随机分为Vehicle组，anti-hSIRPA(30mg/kg)单药 组，anti-mPDL1(1mg/kg)单药组，anti-hSIRPA(30mg/kg)+anti-mPDL1(1mg/kg)联 合组(n＝8)，并使用相应的药物进行治疗。每周给药3次，共给药6次。给药当 日测量小鼠体重和肿瘤体积，后续周测量2次，每日给药前测量小鼠体重，依据 体重进行当日给药。给药第25天或者接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时 执行安乐死结束实验。
表7分组及给药方案
1.小鼠体重变化
所有动物在给药后每周称重两次，各组荷瘤鼠的体重变化曲线如图7所示。 不同组小鼠之间的体重变化没有明显的差异，说明在抗体测试剂量下，小鼠耐受 良好，未出现明显毒副反应。
2.肿瘤体积变化
图8为不同组的肿瘤体积变化曲线，联合用药在此模型中出现一定的抑制肿 瘤生长效果。
3.相对肿瘤抑制率TGI(％)
在D25，第4组(G4:anti-hSIRPA+anti-mPDL1)肿瘤体积低于第1组对照(G 1:Vehicle control(PBS))，TGI(％)为48.60％。
表7受试品处理后药效统计分析
结论：
药效实验结果表明，抗人SIRPA抑制剂和抗鼠PDL1抑制剂联合用药组与单独 用药组及对照组相比表现出更加明显的肿瘤抑制效果，证明SIRPA人源化小鼠是 评估SIRPA抑制剂或与其它抑制剂联合用药体内药效的有力工具。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念 下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。