阅读说明：本技术 多巯基肽自组装及其基因载体应用 (Self-assembly of multi-sulfhydryl peptide and application of gene vector thereof ) 是由 曹美文 王瑜 丁榛 玄甲明 刘祯 张子瑾 赵琳杰 孙路 王生杰 夏永清 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明提出一种多巯基肽与DNA共组装及其在基因载体中应用的方法,属于生物材料领域,该载体具有较低的细胞毒性,可成功的诱导基因缩合,能够保护基因不被酶所降解,并且获得了不错的转染效率。该技术方案包括将多肽分子施于缓冲液中,再将所述多肽与基因分子溶液在预定条件下充分混合制备得到,即多肽/基因分子共组装体溶液。本发明能够应用于基因转运过程中。(The invention provides a method for co-assembling multi-sulfhydryl peptide and DNA and applying the multi-sulfhydryl peptide and the DNA in a gene carrier, which belongs to the field of biological materials. The technical scheme comprises the steps of applying polypeptide molecules into a buffer solution, and fully mixing the polypeptide and a gene molecule solution under a preset condition to prepare the polypeptide/gene molecule co-assembly solution. The invention can be applied to the gene transfer process.)

多巯基肽自组装及其基因载体应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种基因载体及其使用方法。

背景技术

基因治疗是一种有前途的治疗策略，主要通过将具有特定功能的基因导入细胞中，以达到疾病治疗的目的。经过20年的深入研究，它正迅速成为治疗各种遗传性疾病的重要策略，对于治疗一些危及生命的疾病起着非常关键的作用，例如癌、心血管疾病、获得性免疫缺陷综合症和某些自身免疫性疾病等。

基因疗法是利用核酸修复、替换或调节基因以预防或治疗疾病，基因治疗的治疗方法决定了它能够从源头上解决疾病的发生。近几年来基因治疗技术发展迅速，大量的研究都致力于将基因转染技术应用到具体的临床应用当中，但是进展缓慢，主要的原因是一直以来没有开发出安全有效的基因递送载体。

基因治疗的方式有许多种，但是都离不开将治疗基因导入靶细胞的过程。但是基因药物在溶液中大多为线性伸展构象，它在人体内具有较差的稳定性，并且容易被多种酶所降解，同时由于基因药物本身带有负电荷会与细胞膜外层的阴离子产生静电排斥等，这些特点也为基因载体提出了要求，它必须是一种高效的DNA凝聚试剂，基因载体应该可以将DNA凝聚为体积较小的颗粒，从而使DNA分子易于通过内吞或胞饮作用进入细胞内。

自组装肽将是开发下一代生物材料以及未来基因药物输送材料的优良选择，它可以产生一系列定义明确的纳米结构。相对于其他递送载体，自组装肽纳米结构存在多方面优势，例如，肽分子生物相容性高，肽分子结构可调可控，可设计性强等。通过合理的设计可以在多分子中引入较多正电荷，使其具有强的DNA结合能力。并且可以引入半胱氨酸(Cys)，由于氧化还原敏感的巯基的引入，肽可能形成能够稳定DNA载体复合物的肽间二硫键，从而起到了改善基因递送效果的作用。另外，分子的电荷类型、电荷间距和疏水性的变化也会对基因的转染效率产生影响。

发明内容

本发明提出一种多巯基肽自组装及其基因载体应用方法，属于生物材料领域，该多巯基肽在一定浓度时可自组装成特定纳米结构，例如纤维结构、短棒结构和串珠结构等，并且该基因载体具有较低的细胞毒性，可成功的诱导DNA缩合，并且能够保护其不被酶所降解，最终获得了较高的基因转染效率。

为了达到上述目的，本发明提供了一种基因载体，将多肽分子溶于缓冲液中，再与基因分子溶液在预定条件下充分混合，使得多肽分子与DNA分子进行共组装，从而制备得到多肽/基因分子共组装体溶液。

作为优选，上述技术方案中使用的缓冲液为浓度为50mM的Tris缓冲液，其pH为7.4。多肽溶于此缓冲液中，利用多肽所带的正电荷与带负电的DNA进行共组装，并且分子中Cys起到了稳定组装体结构，将DNA凝聚为体积较小的颗粒从而实现基因分子的输运。

作为优选，所述系列多肽分子具有以下序列：

设计了如下多肽分子：Nap-FF-GPLGLAG(CK_n)_mC(简写为(CK_n)_mC,n＝2,3,5，m＝2,3,4)，Nap-FF-GPLGLAG(CR_n)_mC(简写为(CR_n)_mC,n＝2,3,5，m＝2,3,4)，Nap-FF-GPLGLAGCK₁₁C

优选地，七条多巯基肽主要由三部分组成，首先第一部分为Nap-Phe-Phe(Nap-FF)自组装基元，通过提供π-π相互作用和疏水性相互作用来促进水溶液中的肽自组装。第二部分为-PLGLA-片段，它可以被基质金属蛋白酶特异性切割，以期获得酶响应性自组装行为。第三部分为亲水片段。

优选地，七条肽的亲水性片段组成如下：(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C四条肽的亲水片段由赖氨酸(Lys)和Cys组成，(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C条肽的亲水片段由精氨酸(Arg)和Cys组成，其中，Cys在稳定组装体结构方面发挥作用，通过调整该片段中Lys(Arg)和Cys残基的个数及位置来调整分子所带的电荷性质、数目和分布，从而调控分子的自组装及与DNA的共组装行为。

作为优选，所述多肽分子溶于缓冲液中自组装为特定纳米结构的步骤包括：

配制浓度为50μM-1.5mM的多肽分子溶液，溶于pH为7.4的缓冲溶液中，放置3天以上。

作为优选，所述多肽分子可以自组装为特定的结构，比如(CK₂)₄C组装形成了短棒状结构，长度约40-60nm，直径在7.5nm左右。(CK₃)₃C形成类似串珠状结构，串珠的直径在7nm左右。CK₁₁C组装后形成长纤维状结构，其直径在8nm左右。(CR₃)₃C、(CR₅)₂C两条多肽的组装结构，它们均形成了短纤维状结构，(CR₃)₃C形成的纤维长度约200-300nm，(CR₅)₂C形成的纤维长度大多在150nm左右，两条肽的纤维直径均在9.5nm左右。另外(CK₅)₂C、(CR₂)₄C未形成有序的组装结构。

作为优边，所述多肽/基因分子共组装体溶液的配制步骤包括：

配制浓度为50μg/mL的DNA溶液，溶于pH为7.4的Tris缓冲溶液中，得到基因分子溶液。

将上述多肽溶液与基因分子溶液按照预定条件充分混合，得到多肽/基因分子共组装体溶液。

上述技术方案中，基因分子以绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2为模型。

作为优选，所述预定条件为：多肽分子与DNA的电荷比为20。

上述技术方案中，当多肽分子与DNA分子的电荷比为5以上时，可诱导DNA分子的有效凝聚，并保护DNA分子免受酶切降解：当多肽分子与DNA分子比值为5-20时，可以使DNA分子由伸展构象转变为高度压缩的凝聚构象，并且能有效介导基因转染。

本发明还提供了一种如上述任一项技术方案所述的基因载体的使用方法，包括：

将多肽/基因分子共组装体溶液与细胞共培养，6-10小时后将培养液更新为含10％血清的DMEM培养基，继续培养24-48小时，即可实现细胞内基因的有效转染。

上述技术方案中，在96孔板中接种细胞，接种的细胞悬液的密度为1×10⁵细胞/mL，接种后在细胞培养箱中培养24小时。从每个孔中移出原有的完全培养基，并重新用100μL的培养基进行更新，之后，将50μL肽/DNA混合溶液注入每个孔中，与细胞共培养4-6小时后，用150μL含有胎牛血清的新鲜培养基替换掉原先的培养基，继续培养24-48小时。

作为优选，所述细胞为293E细胞。

上述技术方案中，当多肽分子与DNA分子的比为20时，将pEGFP-N2质粒转染进入293E细胞的效果最优，(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C、(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C七条肽均取得了较高的转染效率，分别为29.67％、49.49％、11.39％、37.73％、54.49％、48.74％、48.98％。

作为优选，在基因获得最好转染效果的电荷比下，多肽分子对细胞的毒性不大，细胞仍然可以保持良好的形态。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于

(1)本发明所提供的七条多肽分子的亲水性片段都由Cys组成，Cys在稳定组装体结构方面发挥作用，通过调整该片段中Lys(Arg)和Cys残基的个数及位置来调整分子所带的电荷性质、数目和分布，从而调控分子的自组装及与DNA的共组装行为。

(2)本发明所提供的基因载体合成过程简单，所得载体具有较低的细胞毒性，该载体可成功的诱导DNA缩合，并且能够保护其不被酶所降解，获得了不错的转染效率。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的透射电镜表征多肽在Tris缓冲液中聚集体结构形貌，(a)：(CK₂)₄C，(b)：(CK₃)₃C，(c)：(CK₅)₂C，(d)：CK₁₁C，(e)：(CR₂)₄C，(f)：(CR₃)₃C，(g)：(CR₅)₂C。

图2为本发明实施例所提供的EB替代实验相对荧光强度随电荷比的变化曲线。

图3为本发明实施例所提供的多肽/DNA复合物在不同电荷比时，与HindIII和EcoRI两种酶作用后的凝胶电泳图，(a):(CK₂)₄C，(b):(CK₃)₃C，(c):(CK₅)₂C，(d)CK₁₁C，(e):(CR₂)₄C，(f):(CR₂)₄C，(g):7-(CR₅)₂C，泳道1：pDNA，泳道2-7：DNA浓度固定，含有不同量多肽的多肽/DNA复合物

图4为本发明实施例所提供的通过流式细胞仪表征的多肽/pEGFP-N2转染293E细胞后的基因转染效率。

具体实施方式

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的多巯基肽与DNA共组装及其在基因载体中应用的方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

多肽分子溶液配制：配制浓度为50μM-1.5mM的(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C、(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C七多肽溶液，溶于pH为7.4、浓度为50mM的Tris缓冲液。将配好的溶液常温下放置3天以上，使多肽能够充分的自组装。通过透射电子显微镜表征其形貌结构，结果如图1所示，七条多肽分别形成了纤维状、短棒状和串珠状等有序结构。

配制基因分子溶液：配制绿色荧光蛋白报告基因(pEGFP-N2)溶液，溶于pH为7.4、浓度为50mM的Tris缓冲液，使得基因溶液的浓度为50μg/ml。

将上述多肽溶液与pEGFP-N2溶液混合制备多肽/基因分子共组装溶液，其中，多肽与基因的电荷比为0-80。多肽/基因分子共组装溶液进行了细胞毒性实验，(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C、(CR₂)₄C和(CR₅)₂C几条肽具有更好的生物相容性，当多肽和质粒的电荷比低于30时，细胞相对存活率能够在80％以上。(CK₂)₄C和(CR₂)₄C两条多肽与pDNA共组装形成的复合物的相容性相对差一些，当电荷比在20以下时，细胞的相对存活率达到80％以上。

将上述多肽溶液与pEGFP-N2溶液混合制备多肽/基因分子共组装溶液，其中，多肽与基因的电荷比为0-5，如图2所示，多肽分子与pDNA的结合可以造成荧光强度的降低，当电荷比为3-5时，荧光强度趋于平稳，稳定在30％左右，显示这些肽都具有很好的DNA结合能力。其中(CR₅)₂C荧光强度下降程度最大，稳定在20％左右，是七条肽中与DNA结合能力最强的。

将上述多肽溶液与pEGFP-N2溶液混合，制备多肽/基因分子共组装溶液，其中，多肽与基因的电荷比为0-50。通过Zeta电势来表征多肽和DNA聚合物颗粒表面的带电情况，电荷比在0-10时，七条肽与质粒DNA形成的聚合物的表面电势均出现了由负到正的转变，主要是由于带正电的多肽结合到了带负电的DNA表面，中和了DNA表面的部分负电，使之发生聚集，之后随着多肽量的的不断增多，聚集体结构由原来的松散状态变得更加聚集，聚合体表面电荷密度加大，表现为Zeta电势的增高。当电荷比为30-50时，电势基本达到了稳定，结果很好地证明了七条多肽都具有很好的DNA结合能力；透射电镜(TEM)形貌表征显示肽分子可将DNA凝聚，CK₁₁C的凝聚效果相对较差，与pDNA相互作用后形成的聚集体的形貌比较松散，直径较大，其余几条多肽形成更为致密的聚集体结构，并且尺寸更小，(CK₃)₃C凝聚形成了指纹状结构，尺寸在60-70nm左右，(CK₂)₄C、(CK₅)₂C凝聚形成了球形结构，尺寸在50-60nm左右。另外，(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C凝聚形成了短棒或短纤维状结构，(CR₂)₄C凝聚形成的短棒或球状结构的尺寸在10-20nm之间，(CR₃)₃C、(CR₅)₂C凝聚形成了短纤维状结构直径分别为7.5nm和9nm，长度在60-80nm左右。

将上述多肽溶液与pEGFP-N2溶液混合，制备多肽/基因分子共组装溶液，其中，多肽与基因的电荷比为0-20，琼脂糖凝胶电泳结果显示，肽分子可以使DNA凝聚，凝聚后的DNA不能通过琼脂糖凝胶的孔洞而被滞留在点样孔中。

将上述多肽溶液与pEGFP-N2溶液混合，制备多肽/基因分子共组装溶液，其中，多肽与基因的电荷比为0-20。上述结果皆证明多肽分子能够有效诱导DNA分子的凝聚，之后，以HindIII、EcoRI两种酶做为分子稳定试剂，将混合溶液加入50μL的双酶切体系中进行酶切实验，最后用琼脂糖凝胶电泳实验进行检测，酶切实验结果如图3所示，结果表明多肽可防止DNA被酶降解。

基因的细胞内转运：上述技术方案中，在96孔板中接种细胞，接种的细胞悬液的密度为1×10⁵细胞/mL，接种后在细胞培养箱中培养24小时。从每个孔中移出原有的完全培养基，并重新用100μL的DMEM培养基进行更新，之后，将50μL肽/DNA混合溶液注入每个孔中，与细胞共培养4-6小时后，用150μL含有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基替换掉原先的培养基，继续培养24-48小时，在倒置荧光显微镜下观察多肽分子与质粒pEGFP-N2在电荷比为20条件下转染293E细胞后的细胞转染效果，进一步通过流式细胞仪对转染效率进行了检测，流式细胞仪检测结果如图4所示。

如图4所示，(a-g)图分别代表(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C、(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C七条多肽介导的绿色荧光蛋白表达效率直方图。由结果可以得出(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C、CK₁₁C、(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C七条肽均取得了较高的转染效率，分别为29.67％、49.49％、11.39％、37.73％、54.49％、48.74％、48.98％，其中含精氨酸的(CR₂)₄C、(CR₃)₃C、(CR₅)₂C三条多肽的转染效率要高于含赖氨酸的(CK₂)₄C、(CK₃)₃C、(CK₅)₂C三条多肽。

实施例2

实验步骤同实施例1，区别在于：多肽/基因分子共组装体溶液制备步骤中将多肽和基因分子的电荷比为10，体系同样能够成功实现绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)的有效转染。

实施例3

实验步骤同实施例1，区别在于：多肽/基因分子共组装体溶液制备步骤中将多肽和基因分子的电荷比为16，体系同样能够成功实现绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)的有效转染。

实施例4

实验步骤同实施例1，区别在于：多肽/基因分子共组装体溶液制备步骤中将多肽和基因分子的电荷比为32，体系同样能够成功实现绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)的有效转染。