阅读说明：本技术 基于特异性交联酪氨酸构建蛋白质三维结构的方法 (Method for constructing three-dimensional structure of protein based on specific cross-linked tyrosine ) 是由 魏忠林 崔利利 马咏歌 郑连友 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明的基于特异性交联酪氨酸构建蛋白质三维结构的方法,属于交联质谱技术领域。具体包括化学交联反应、酶解、电化学还原、质谱分析、重建蛋白质三维信息等步骤。本发明将近期兴起的电点击化学技术与电化学、高分辨质谱等多种先进分析测量手段综合运用,进行蛋白质空间结构的研究,并通过首次设计合成新型特异性靶向酪氨酸的交联剂和EC-EC/LC-MS<Sup>n</Sup>实验方法补充交联-质谱现有的技术,为蛋白质参与的高度复杂和动态的相互作用网络等研究提供理论依据和实验基础。(The invention discloses a method for constructing a three-dimensional structure of protein based on specific cross-linked tyrosine, belonging to the technical field of cross-linked mass spectrometry. The method specifically comprises the steps of chemical crosslinking reaction, enzymolysis, electrochemical reduction, mass spectrometry, reconstruction of protein three-dimensional information and the like. The invention comprehensively uses the recently-developed electro-click chemistry technology and various advanced analysis and measurement means such as electrochemistry, high-resolution mass spectrometry and the like to research the space structure of protein, and synthesizes a novel cross-linking agent of specific target tyrosine and EC-EC/LC-MS by first design n The experimental method supplements the existing technology of cross-linking-mass spectrometry, and provides theoretical basis and experimental basis for researches such as highly complex and dynamic interaction networks involved by protein.)

基于特异性交联酪氨酸构建蛋白质三维结构的方法

技术领域

本发明属于交联质谱技术领域，具体涉及一种基于特异性交联酪氨酸来构建蛋白质的三维结构的方法。

背景技术

在探索蛋白质和蛋白质复合物的三维结构以及蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)等方面，交联质谱技术(Cross-linking massspectrometry,XL-MS)的重大进展已经极大地推动了人类病理学、诊断学和治疗学的发展(Nature,2016,537,347；Analytical chemistry,2017,90,144；CN105651852A)。与常规核磁共振谱学和X射线晶体学相比，交联质谱中酶切步骤的存在使得质谱分析得以在肽水平上进行，因此蛋白质组装本身的质量是不受限制的(Angewandte Chemie InternationalEdition,2018,57,6390)。此外，交联质谱可以应用于膜蛋白、高度柔性的蛋白质复合物和非常大的蛋白质组装体，因此也被称为“分子机器”(Trends in biochemical sciences,2016,41,20.)。在常规的交联质谱实验方法中，蛋白质首先与交联试剂共价结合，然后被酶解消化成交联多肽片段，最后被液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分离、分析(Expert reviewof proteomics,2014,11,733；The EMBO journal,2016,35,2634)。由于具有确定长度的交联剂赋予两个连接的残基之间的距离限制，因此不论在体外研究(Science,2012,337,1348)还是体内研究(Journal of Biological Chemistry,2017,292,16310)中均能推导出蛋白质和蛋白质复合物的结构信息。

然而，交联质谱技术也面临交联碎片复杂和交联产物结构不均一等挑战(Molecular&Cellular Proteomics,2016,15,1105；Molecular&Cellular Proteomics,2010,9,1634)。因此，开发各种类型的可裂解的交联剂来促进和简化交联肽的质谱鉴定就变得刻不容缓。其中，质谱可裂解的交联剂受到广大研究者的青睐，因为它们能够在质谱分析过程中得到特征性碎片(Analytical chemistry,2014,86,2099；Analyticalchemistry,2008,80,9279)。Huang课题组成功开发了一系列新型含亚砜的、质谱可裂解的交联剂，例如：特异性交联赖氨酸残基的二琥珀酰亚胺基亚砜(DSSO)(Molecular&CellularProteomics,2011,10,M110.002212)、特异性交联羧酸残基的二酰肼亚砜(DHSO)(Analytical chemistry,2016,88,8315)、以及特异性交联半胱氨酸残基的双马来酰亚胺亚砜(BMSO)(Analytical chemistry,2018,90,7600)。同时，专利CN109897078A和专利CN109900814A报道了一种糖苷键质谱可碎裂型交联剂的制备和分析方法。这些质谱不稳定的C-S键在碰撞诱导的解离过程中会选择性地优先断裂，从而产生可预测的特征片段，用于后续的测序。到目前为止，主要的特异性交联剂的研究是以赖氨酸(Journal of proteomeresearch,2013,12,1569；Journal of The American Society for Mass Spectrometry,2017,28,2039)、谷氨酸、天冬氨酸(Analytical chemistry,2018,90,1195；EuropeanJournal of Mass Spectrometry,2008,14,355；Proceedings of the National Academyof Sciences,2014,111,9455)、和半胱氨酸为目标，而针对其余16种氨基酸的研究较少。酪氨酸(Y)作为必需氨基酸之一，广泛存在于许多肽和蛋白质，例如肌红蛋白，重组人生长激素(r-hGH)和酪氨酸蛋白激酶中。同时，蛋白质表面的芳香族氨基酸残基的优势是能够产生高程度的生物共轭，而不改变总体电荷状态或氧化还原敏感性(Journal of the AmericanChemical Society,2004,126,15942)。但是，这些芳香族氨基酸残基的氧化还原电位相似，C(sp²)–H功能化困难，因此几乎没有关于酪氨酸残基交联的技术报道(Journal of theAmerican Chemical Society,2016,138,15118；Journal of the American ChemicalSociety,2017,139,7152)。

发明内容

针对背景技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于特异性交联酪氨酸来构建蛋白质的三维结构的方法，在分析含有二硫键的多肽和蛋白质时，不需使用任何化学还原剂就可以实现二硫键的电化学还原，以此来提供更多的二级碎裂信息。

本发明使用一种新型的交联剂与蛋白质通过“电点击化学”的方式进行化学交联反应，将交联的蛋白酶解产物进行质谱鉴定，通过电化学还原的方式，使得交联产物中S-S键发生优先碎裂，产生特征片段。这些特征片段的质量关系和交联肽段的MS²碎裂质谱图能准确确定蛋白质中的交联位点，降低对蛋白质交联位点的数据库检索规模。

本发明的具体技术方案如下：

一种基于特异性交联酪氨酸构建蛋白质三维结构的方法，具体步骤如下：

(1)化学交联反应：将蛋白质样品溶解于pH为7.40的100mM PB缓冲液中，得到1mM样品溶液，将样品溶液与交联剂以1:2～30的摩尔比在0.36V的电压下室温反应4h，反应使用三电极系统：石墨工作电极、铂对电极和饱和甘汞参比电极；所述的蛋白质样品为血管紧张素Ⅱ、胰岛素或重组人生长激素(r-hGH)；所述的交联剂的结构式为：

(2)酶解：当所述的蛋白质样品为胰岛素或重组人生长激素时，要对步骤(1)交联反应的产物进行酶解反应，当蛋白质样品为胰岛素时，使用溶解于1％乙酸溶液的胃蛋白酶进行酶解反应，37℃下孵育6.5h，胃蛋白酶与蛋白的质量比为50:1；当蛋白质样品为重组人生长激素时，使用溶解于pH为7.50、50mM的Tris-HCl缓冲液的胰蛋白酶进行酶解反应，37℃下孵育4h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为12:1；

(3)电化学还原：使用注射泵将经步骤(1)或步骤(2)处理过的蛋白质样品通入电化学池进行电化学还原，在电化学电池上施加-3V的电压来裂解交联蛋白质中的二硫键和交联剂，随后将样品用100mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)溶液处理至最终半胱氨酸/烷基化物的摩尔比为1:50，并在室温下孵育2h；电化学还原是在由铅工作电极(WE)，Ag/AgCl(3mol/LNaCl)参比电极(RE)和不锈钢辅助电极(AE)组成的薄层电化学电池中进行的，所述的电化学电池的体积为7μL；

(4)质谱分析：将电化学还原反应前后的样品溶液分别使用液相色谱质谱联用仪(LC-MSⁿ)进行分析，在进行质谱分析之前，使用C18反相柱进行液相分离，MS²谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV，质谱采集模式为一级质谱和二级质谱；

(5)重建蛋白质三维信息：对得到的质谱数据进行分析整理，用Gaussian View 6软件计算交联剂的间隔长度和酪氨酸侧链贡献的距离；利用PyMOL 2.3软件计算胰岛素和R-hGH的Cα-Cα欧式距离，得到蛋白质三维结构信息。

本发明将近期兴起的电点击化学技术与电化学、高分辨质谱等多种先进分析测量手段综合运用，进行蛋白质空间结构的研究，并通过首次设计合成新型特异性靶向酪氨酸的交联剂和EC-EC/LC-MSⁿ实验方法补充交联-质谱现有的技术，为蛋白质参与的高度复杂和动态的相互作用网络等研究提供理论依据和实验基础。

本发明有以下有益效果：

1、采用电点击化学技术能够特异性交联酪氨酸，从而补充了现有交联-质谱研究方法中交联剂的种类，这也标志着第一代特异性交联酪氨酸的交联剂的诞生。

2、利用电化学裂解二硫键这一特性，开发可产生特征离子的交联质谱鉴定战略，为蛋白质参与的高度复杂和动态的相互作用网络等研究提供理论依据和实验基础。

3、在分析含有二硫键的多肽和蛋白质时，不需使用任何化学还原剂就可以实现二硫键的电化学还原，以此来提供更多的二级碎裂信息。

附图说明

图1为基于特异性靶向酪氨酸的EC可裂解的交联剂，提出了用于进行交联和电化学还原以鉴定交联肽的工作流程。

图2为血管紧张素Ⅱ交联前后的MS²质谱图。

图3为识别的胰岛素质谱数据和交联位点

图4为重组人生长激素的三维结构和交联位点

具体实施方式

实施例1

本实施例公开了特异性交联酪氨酸交联剂的制备方法，包含三个步骤：

第一步：1,2,2-二羧酸乙基苯基肼的合成(EPHD，1)

将0.5g碳酸二苯酯(1eq.，2.3mM)在100mL烧瓶中于80℃熔化，然后添加0.5g氨基甲酸乙酯(2eq.，4.6mM)以反应1h。通过硅胶柱色谱法(EtOAc/石油醚溶液1：3)进行纯化，得到白色固体1。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.68(s,1H),9.25(s,1H),7.41(t,J＝7.9Hz,2H),7.24(t,J＝7.4Hz,1H),7.11(d,J＝7.9Hz,2H),4.07(dd,J＝14.1,7.1Hz,2H),1.19(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ156.90,155.32,151.07,129.95,125.86,121.94,61.17,14.98.

第二步：化合物2的合成

在惰性气氛下将0.226g的乙基苯基肼-1，2-二羧酸酯(化合物1，1eq.)加热至80℃。加入三乙胺(1eq.)和胱胺二盐酸盐(0.5eq.)的混合物，并将反应物溶液在80℃搅拌1h。添加三乙胺的目的是中和胱胺二盐酸盐中的盐酸。反应产物通过硅胶柱色谱法纯化(CH₃OH/CH₂Cl₂为1:15)，得到白色固体2。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.77(s,2H),7.82(s,2H),6.56(s,2H),4.02(q,J＝7.1Hz,4H),3.28(t,4H),2.75(t,J＝6.9Hz,4H),1.17(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ158.63,157.33,60.85,39.14,38.30,15.02.

第三步：4,4'-(二硫代二基双(乙烷-2,1-二基))双(1,2,4-三唑烷-3,5-二酮)的合成(3)

在100mL圆底烧瓶中，将30mg KOH(5eq.)溶解在无水乙醇(20mL)中。加入化合物2(41.2mg，0.1mM，1eq.)，将混合物在78℃下回流12h。将反应混合物冷却至室温，并用HCl溶液酸化至pH为4。除去溶剂，并用甲醇将固体再溶解。滤出沉淀后，将溶液真空浓缩，获得产物3。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.18(s,4H),3.66(t,J＝6.5Hz,4H),2.96(t,J＝6.6Hz,4H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ155.15,37.60,35.35.

实施例2

交联剂特异性靶向血管紧张素Ⅱ中酪氨酸

(1)化学交联反应：将血管紧张素Ⅱ溶解于pH为7.40的100mM PB缓冲液中。3mL1mM胰岛素与交联剂以1：2的摩尔比在0.36V的电压下室温反应4小时。

(2)将交联后血管紧张素Ⅱ使用Agilent 1290Infinity液相色谱-BrukermicrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSⁿ)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS²谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV。

(4)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3V的电压来裂解交联和酶解后的胰岛素样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50。

(5)使用步骤(3)中相同方法进行分析。

图2为血管紧张素Ⅱ交联前后的MS²质谱图。

上述数据的结果表明，该交联剂可以对血管紧张素Ⅱ中酪氨酸进行特异性交联。

实施例3

对胰岛素进行三维结构鉴定

(1)化学交联反应：将胰岛素溶解于pH为7.40的100mM PB缓冲液中。3mL 0.2mM胰岛素与交联剂以1：2、1：10和1:20的摩尔比在0.36V的电压下室温反应4小时。

(2)使用溶解于1％乙酸溶液的胃蛋白酶对上述溶液进行酶解反应，37℃下孵育6.5h，胃蛋白酶与蛋白的质量比为50：1，酶解后胰岛素的最终浓度为0.5mg/mL。

(3)将上述酶解产物使用Agilent 1290Infinity液相色谱-Bruker micrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSⁿ)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS²谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV。

(4)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3V的电压来裂解交联和酶解后的胰岛素样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50。

(5)使用步骤(3)中相同方法进行分析。

(6)数据整理：交联剂在0.36V vs SCE的电位下，N-N键被电化学氧化为N＝N键，随后与蛋白质中的酪氨酸特异性交联，形成三种类型的交联多肽，分别是链端交联、链间交联和链内交联。

在交联和酶解之后，如果交联多肽的质量比未修饰多肽的质量高318.0Da，则该多肽被认为是链端交联肽。同样，链间交联和链内交联肽是交联剂中两个脲唑基团均与多肽发生反应的结果，多肽质量将增加316.0Da。顾名思义，若该反应发生在一个多肽片段中，则被认为是链内交联；若一个交联剂分子连接两个多肽，则被认为是链间交联。

经过电化学还原后，如果交联蛋白的质量比未修饰蛋白的质量高125×n+284Da(其中“n”是半胱氨酸残基的数量)，则被认为是链端交联或链间交联的结果。同时，如果交联蛋白的质量比未修饰蛋白的质量高125×n+284×2Da，则认为这是链内交联的结果。

(7)用Gaussian View 6软件计算DBB交联剂的间隔长度和酪氨酸侧链贡献的距离。胰岛素的Cα-Cα欧式距离由PyMOL 2.3软件对PDB文件(网站：http：//www.rcsb.org/)进行计算。

图3为识别的胰岛素质谱数据和交联位点。

具体的结果信息如表1所示。

表1通过LC-MSⁿ的方法鉴定DBB与胰岛素的交联位点信息。

由以上的分析可得，交联剂将胰岛素A链中14位的酪氨酸和19位酪氨酸连接，将胰岛素A链中19位的酪氨酸和B链中25位酪氨酸连接。这些结果说明：该交联剂可以对胰岛素中全部酪氨酸实现特异性交联。

实施例4

对重组人生长激素(r-hGH)进行三维结构鉴定

(1)化学交联反应：将r-hGH溶解于pH为7.40的100mM PB缓冲液中。3mL 0.2mM r-hGH与交联剂以1:30的摩尔比在0.36V的电压下室温反应4h。

(2)将上述溶液使用pH为7.50、50mM的Tris-HCl缓冲液洗三次，在12000rpm下离心各5min。

(3)使用溶解于pH为7.50、50mM的Tris-HCl缓冲液的胰蛋白酶对上述溶液进行酶解反应，37℃下孵育4h，胰蛋白酶与蛋白的质量比为12：1，酶解后r-hGH的最终浓度为0.5mg/mL。

(4)将上述酶解产物使用Agilent 1290Infinity液相色谱-Bruker micrOTOF-QⅡ质谱联用仪(LC-MSⁿ)进行分析。在进行质谱分析之前，使用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱(4.6×250mm，5μm，柱温为40℃)进行液相分离。流速为1mL/min；线性梯度为：0-5min为5％B，6-55min为5-60％B，56-60min为60-98％B，流动相缓冲液A和B分别为含有0.1％甲酸的水和乙腈。MS²谱图是通过碰撞诱导解离(CID)产生的，能量为15eV。

(5)通过使用DY 2300恒电位仪(Digi-Ivy Inc.，美国)在电化学电池上施加-3V的电压来裂解交联和酶解后的r-hGH样品。随后将上述样品用100mM N-乙基马来酰亚胺溶液在室温下孵育2h进行烷基化反应，半胱氨酸与烷基化物的摩尔比约为1:50。

(6)使用步骤(4)中相同方法进行分析。

(7)数据整理与胰岛素相同。

(8)用Gaussian View 6软件计算交联剂的间隔长度和酪氨酸侧链贡献的距离。R-hGH的Cα-Cα欧式距离由PyMOL 2.3软件对PDB文件(网站：http：//www.rcsb.org/)进行计算。

图4为重组人生长激素的三维结构和交联位点。

表2为交联剂与r-hGH中酪氨酸的特异性交联结果信息。

表2通过LC-MSⁿ的方法鉴定DBB与r-hGH的交联位点信息

上述数据结果表明，通过使用交联剂对含有8个酪氨酸的r-hGH进行化学交联反应，共鉴定到8对交联位点信息，补充了现有交联剂的种类和鉴定方法，为现有的交联质谱方法学提供有价值的工具。