阅读说明：本技术 在成像质谱法中跨越长测量时间段维持光谱质量 (Maintaining spectral quality across a long measurement period in imaging mass spectrometry ) 是由 延斯·赫恩多尔夫 安德烈亚斯·哈泽 于 2020-02-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及在薄样品切片上的成像质谱法,特别是通过基质辅助激光解吸(MALDI)法利用电离来进行,其中高横向图像分辨率意味着必须获取数百万个(甚至上亿个)质谱图并且图像获取要跨越多个小时进行。在这种情况下质谱图的质量从一个小时到下一小时明显劣化。本发明基于如下发现：跨越多个小时的连续测量系列的光谱质量下降仅部分地由检测器增益的减小引起,并且另一显著原因是每个离子产生脉冲的可用离子数量的下降,这归因于几种难以调节的现象。现在本发明提出以这样一种方式代替仅调节检测器增益：不仅补偿了检测器增益的减小,而且还补偿了每个离子产生脉冲(例如,激光发射)的可用离子数量的减少。(The present invention relates to imaging mass spectrometry on thin sample sections, in particular by ionization by matrix-assisted laser desorption (MALDI) methods, where high lateral image resolution means that millions (or even billions) of mass spectra must be acquired and image acquisition takes place over many hours. In which case the mass of the mass spectrum is significantly degraded from one hour to the next. The present invention is based on the following findings: the spectral quality degradation of a continuous measurement series over many hours is only partly caused by the reduction of the detector gain, and another significant cause is the degradation of the number of available ions per ion generating pulse, due to several phenomena that are difficult to adjust. The present invention now proposes to replace adjusting only the detector gain in such a way: not only the reduction in detector gain is compensated for, but also the reduction in the number of available ions per ion generation pulse (e.g., laser emission).)

在成像质谱法中跨越长测量时间段维持光谱质量

技术领域

本发明涉及在薄样品切片上、尤其是在薄组织切片上的成像质谱法，并且优选地通过基质辅助激光解吸(MALDI)法利用电离来进行，其中，高横向图像分辨率意味着必须获取数百万(甚至数亿)个独立的质谱图，并且图像获取要跨越多个小时进行。在这种情况下，质谱图的质量通常从一个小时到下一小时明显劣化。如果不采取特殊措施，通常在几个小时之后再也无法对质谱图中的质量信号进行有用的评价。

背景技术

下面参考特殊方面来说明现有技术，特别是飞行时间质谱法，具体来说是MALDI飞行时间质谱法，并且另外地在特别是作为薄样品切片的薄组织切片上。然而，这不应解释为限制。现有技术已知的有用的进一步发展和修改也可以在本背景技术介绍的相对窄的范围之上和之外使用，并且对于本领域技术人员来说在阅读了下面的本公开之后将是显而易见的。

薄组织切片的质谱图像显示每个图像点的完整质谱图，就像彩色图像包含每个像素的彩色光谱一样。质谱图可以用于帮助将组织图像中的特定分子的分布可视化，特定分子例如为肽、脂质、磷酸化分子、药剂或者甚至是用于异常组织状态的复合标记。这种异常组织状态可能与一直到致癌性退变(carcinogenic degeneration)的特定形式的组织应力有关。

薄组织切片的质谱图像的获取可能花费多个小时，这取决于薄组织切片的尺寸或期望的横向分辨率。28小时或更长(有时长达40小时)的获取时间是已知的。电离通常是通过基质辅助激光解吸(MALDI)法利用来自脉冲激光器的精确聚焦的激光束来进行的；每个图像点的质谱图通常是在特殊的飞行时间质谱仪中测量的。一般来说，如此获取每秒10,000个独立的质谱图，但全部源自薄组织切片的小区域的大约10个至1,000个独立的质谱图加起来以形成总谱图。薄组织切片的该小区域称为“像素”；因此，质谱组织图像由像素的质谱图组成。通常选取边长大致为10μm至200μm的正方形像素。像素的尺寸限定了质谱图像的横向分辨率。

用激光束扫描像素：将激光束聚焦到样品上，在样品上形成所谓的“激光光斑”；该光斑的直径典型地小于像素尺寸(例如，5μm)。

在若干小时的长获取时间期间，如通常在成像质谱法的情况中那样，光谱质量连续地劣化，这特别地表现为质谱图中的质量信号的强度下降。许多现象可能同时对光谱质量的下降有贡献。

例如，激光焦点的位置可能会因温度影响而改变；这意味着样品上的激光光斑直径发生改变，因此电离的强度改变。电离的强度与激光能量密度的六次方大致成正比，这就是为什么即使小的改变也会产生相应大的影响。整个质谱仪的温度稳定性非常复杂并且仍然不能完全消除这种影响，因为质谱仪包含诸如涡轮泵等局部热源。对涡轮泵进行冷却也是有帮助的，但这也不能完全消除这种影响。

激光器还可能会遭受疲劳，或者平均激光能量可能会波动。例如，考虑到重新校准样品支撑件所需的时间，传统操作中的28小时的获取意味着2亿次激光发射。例如，从出版物WO 2017/108091 A1(PCT/EP2015/080926；A.Haase 2017)中已知延长脉冲激光器的使用寿命的方法，但它们要求对激光器系统的附加适配。

可能导致光谱质量下降的另一个影响是基于来自薄组织切片的基质材料的气化。可以使用各种低分子量有机酸作为基质材料以辅助样品分子的电离，但所有都具有或多或少容易气化的缺点。在极端情况下，液体可能会在持续数小时的获取结束之前几乎完全气化，结果是在要采样的最后部位不再形成分析物离子。选择具有极低蒸气压力的基质物质可以延长光谱获取的有用持续时间，参见J.Yang等人在J.Mass Spectrom.2018；1-8上的工作，其使用了芳香族和肉桂基酮。还必须减少支承薄组织切片的样品支撑件的升温。对质谱仪中的任何热源进行冷却同样是有帮助的。样品支撑件应当设计成防止样品升温太快，或者甚至设计成使样品降温。

导致光谱质量下降的另一影响在于如下事实：在离子源中，吸走该离子源的脉冲中生成的离子并将它们引导到飞行时间质谱仪的飞行路径中的加速膜可能会被基质和/或样品材料的气相沉积(或者甚至喷溅)污染，并因此变成带电的。在用于成像质谱法的现代质谱仪中，离子源易于更换和清洁，但为了这样做而中断组织图像的获取是不期望的，因为中断前后的测量条件的连续性是值得怀疑的，因此可能会损害图像的均质性。利用合适设计的离子源可以获得清洁周期之间的较长的操作时间。

另外有更多的影响造成光谱质量下降。作为另一个实例，将激光束反射到样品上以进行激光解吸方法的反射镜可能会由于没有立即被吸走的气化材料而变得模糊。

另一个显著的影响是因使用引起的老化而造成的离子检测器的增益减小。不同类型的离子检测器展现出不同的老化速率，所以原则上可以选择只会缓慢老化的检测器；但在这里必须考虑进一步的参数，诸如对质量分辨率、动态测量范围、最大测量速率以及更多参数的影响。因此，通常不可能完全防止检测器老化。

原则上可以在光谱获取之后对信号幅值进行数学调整，通常称为归一化，但不能完全纠正上述问题，因为它对实际上关注的分析信号以及无处不在的背景信号两者都有影响，并因此对分析信号峰值有影响，该分析信号峰值在测量开始时就已经处于低丰度中，并且由于先前说明的性能劣化而在经历测量过程后甚至变得更弱，因此可能使分析信号峰值丢失在噪声中，并且不再能检测到。

然而，已知几种方法用于借助对策来控制离子检测器的增益减小并使该增益保持恒定。在专利US 8,193,484 B2(S.T.Quarmby和M.W.Senko，“Method and Apparatus forAutomatic Estimation of Detector Gain in a Mass Spectrometer(在质谱仪中自动估计检测器增益的方法和装置)”)中公布了一种相对较新的控制检测器增益的方法的一个实例。在这里，在连续的一系列质谱图的获取期间对测量数据进行评价，使得识别出增益中的变化并且通过改变在检测器处的电压来进行补偿。该方法特别地利用了如下事实：根据统计定律可以从质量信号的测量数据的方差(RSD＝相对标准偏差)计算出质量信号中的离子数量。当所有其它参数保持相同时，该方差与离子数量的平方根严格地成正比。从信号中的离子数量与测得的信号强度的比率可以计算出检测器的增益，并且在必要时进行校正。

然而，应当明确指出的是，保持恒定的检测器增益仅对维持光谱质量有部分贡献，因为如上所述，这种质量下降具有一系列原因。因此，迫切需要一种允许补偿在质谱图像的长久获取期间的光谱质量下降的方法。

在专利US 7,745,781 B2(U.Steiner，“Real-time Control of Ion Detectionwith Extended Dynamic Range(具有扩展动态范围的离子检测的实时控制)”)公开了用于调节检测器增益的方法的另一个实例。然而，其目的是扩展动态范围，即，目标是通过动态调节增益因子来记录质谱图中强度变化大的离子信号，并且与需要进行多个小时持续时间的获取的成像质谱法无关。

发明内容

本发明基于如下发现：跨越多个小时的连续测量系列中的光谱质量下降仅部分地由检测器增益的减小引起，并且另一显著原因是每个离子产生脉冲(例如，激光发射)的可用离子数量的下降。在这里采用的术语“可用离子”是指如下这些离子：在离子源中产生并且到达检测器，而不受任何空间或时间的干扰。借助于背景技术介绍中所描述的措施，诸如为MALDI选择挥发性较小的基质材料、质谱仪的冷却或温度稳定化、使用寿命长的激光器、防止加速膜带电等等，可以确保直到获取系列结束时为止，在像素的质谱图中可得到每个离子种类的充分的离子。然而，在没有补偿措施的情况下，信号可能会变得如此小，以至于它们不再能够与无处不在的噪声分开到充分的程度。

当选择最佳部件和技术时，当前的现有技术指出，光谱质量的下降因各现象大致如下地分布：检测器增益减小或检测器老化大约占40％至60％(例如，使用商用的多通道板(multi-channel plate)作为二次电子倍增器)、因基质材料的气化导致的离子产生的下降大约占20％至40％(例如，使用挥发性基质物质，诸如MALDI常规使用的2,5-二羟基苯甲酸)、因激光器的老化导致的离子产生的下降大约占5％至15％(例如，对于商用的掺钕固态激光器)、因其它现象导致的下降占5％至15％。

离子产生的下降可以通过调节激光光斑中的能量密度来补偿。然而，已经发现，激光束的能量密度的调节是不合适的，因为质谱图不仅在数量上改变(即，关于离子产量)，而且随能量密度而在质量上也改变。特别地，在等离子体中形成的离子与自发形成的碎片离子(通过在离子源中的自发裂解，即所谓的源内裂解，ISD)的比率发生改变。此外，电离的强度在极大地取决于能量密度，所以用于设定相继的激光发射中的能量密度的平衡是很难维持的。任何调节都可能会以不可预知的方式干扰精心创建的平衡。

现在本发明提出以这样一种方式代替检测器增益的调节：不仅补偿了检测器增益的减小，而且还补偿了每个产生脉冲(例如，激光发射)的可用离子的数量的减少。与所引用的专利US 8,193,484 B2中描述的情况不同，不仅检测器增益保持恒定，而且所测得的质谱图的质量和可评价性也保持恒定。

如果跨越质谱图的预定质量范围加起来的在检测器输出端处的放大离子电流信号(优选为它们的平均值)保持恒定，例如m/z大致在500到20,000之间，则可以实现这一点，不过已经发现较窄范围对于某些分析物质是有用的，诸如对于相当轻的脂质而言m/z在500到1,100之间。还可以优选的是，跨越完整质谱图计算总离子数(TIC)。此外，用于MALDI应用的光谱获取(其通常掩盖基质离子的离子电流的大部分)也可以包括基质离子的较大部分，其基本上具有高达大约1,000(包括基质簇)的m/z值，因为已经发现，与仅仅来自组织样品的物质(其为实际关注的分析物)的离子电流相比，包括来自基质物质的离子在内的所有离子电流的总和随时间保持更加恒定。

为了抵消在成像测量的尚不可得到可评价数据的初始时段(尤其是在开始后的首个五到十分钟内)可能的光谱质量下降，特别优选的实施例为离子检测器处的电压的连续改变指定初始漂移，该初始漂移的大小设定为例如每秒2.00毫伏至5.00毫伏，使得即使对于特定测量来说漂移被高估或低估了，也预期光谱质量没有缺点，直到可得到充分的测量数据，以允许在这里提出的调节(其基于加起来的离子电流信号)生效。然后利用该漂移值连续地改变检测器电压，并因此改变检测器增益。

然后，优选地，通过连续地监测用于检测器电压的漂移值并在必要时改变它，来实现检测器增益的这种调节，以实现光谱质量的恒定性，以便获得一致的评价。有许多可能的方法来监测此情况。可以形成跨越几百到几千个像素的滑动平均值作为用于确定光谱质量变化的基础，但也可以更简单地形成每个情况中横跨几百或几千个像素的一系列平均值。在这里，将后者称为“区段平均值”。然后可以简单地确定滑动平均值或区段平均值的梯度并使用该梯度进行调节。已经发现特别成功的步骤是形成作为时间的函数的平均值的导数。优选的方法是计算每个情况中相继的平均值之间的差异。这些差异的变化形成一条曲线，该曲线呈现为关于零点的高斯分布。当光谱质量得到很好的调节时，差异应精确地在零值附近变化；如果该高斯分布的质心偏离零，则必须相应地改变用于检测器电压的漂移值。

调节检测器电压以维持光谱质量要求一种平稳的方法。其优选地基于跨越多个像素在检测器输出端处的放大离子电流的平均值的改变，这些改变是跨越长测量时间以及薄切片的较大区段获取的，以便将归因于薄切片中的不同类型组织的改变平均化。许多实验表明，利用这里所描述的措施，在实践中可以实现稳定的调节。

附图说明

通过参考以下附图可以更好地理解本发明。图中的元件不一定按比例绘制，而是主要旨在说明本发明的原理(大体上示意性地)。

图1描绘了在横跨薄切片内的五种不同类型组织进行扫描期间的理想离子电流曲线，其中为检测器电压的连续调整设定良好的漂移值(x轴：第#个像素；y轴：以任意单位表示的离子电流)；区段a1至e1代表当扫描五种不同类型组织时的总离子电流；所示常规尺寸的100,000个像素的扫描持续时间可以假定为大约一个小时。

图2示出了相同的初始状况，除了在该情况中检测器电压的校正不是最佳的(或者根本没有校正)，所以例如尽管增益被保持恒定，测得的离子电流仍连续地下降。

图3a描绘了来自图1的离子电流曲线的导数。该导数通过简单地形成相继的测得值之间的差异而生成；除了源自组织类型之间的过渡的尖峰外，这些值精确地分布在零附近。

图3b描绘了通过拉伸强度轴线而放大了的零附近的伸展。

图4以分布曲线示出了来自图3a和图3b的测得值的伸展；当不考虑尖峰时，该分布为高斯分布；在这里高斯分布的质心精确为零，因此表明检测器增益的校正是正确的。

图5通过对比示出了从图2中的测得值得到的高斯分布；分布的质心不再为零；质心与零的偏差可以用于计算更好的漂移值，以重新调整检测器电压。

具体实施方式

虽然已经参考多个实施例示出并说明了本发明，但本领域技术人员将认识到，可以在不脱离随附专利权利要求中所限定的技术教导的情况下，对其形式和细节进行各种改变。

如上所述，本发明基于如下发现：光谱质量的下降仅部分地由检测器增益的下降引起，并且还相当显著地由每个产生脉冲(例如，激光发射)的可用离子的数量下降引起。术语“可用离子”在这里被认为是指如下所述的所有离子：例如在激光解吸电离方法的激光发射期间在离子源中产生并且在正确的时间到达检测器，即，它们产生可以进行评价的信号。可用离子(每个激光发射)的数量下降意味着跨越获取时间过程测量的每个质谱图的离子越来越少。信噪比稳步下降：光谱的质量连续地下降，并因此其可评价性连续地下降。检测器增益的同时下降自然会加剧这种影响。

背景技术介绍描述了用于MALDI时间飞行质谱仪的措施，特别地该措施可能会造成如下状况：其中，在长获取系列的最后(有时在跨越20小时之后)，对于像素的每个质谱图，仍然产生每个离子种类的充分数量的离子。然而，在没有补偿措施的情况下，信号会变得如此地小以至于信号不能与无处不在的噪声充分良好地分开。这样的措施包括选择挥发性较小的基质材料以及冷却质谱仪，两个措施的目的是减慢基质材料的气化。进一步的措施牵涉到具有长使用寿命的脉冲激光器的设计、不太容易因沉积物形成而变成带电的离子源的设计以及离子光学器件中的高电压条件的稳定化。此外，合适的设计也可以很大程度上减小温度对脉冲激光器的焦距的影响，并因此减小对光斑直径和激光光斑中的能量密度的影响。尽管这种措施对于在获取结束之前提供每像素足够的离子而言是充分的，但是因为信号变得越来越小，所以它们通常不能防止相关联的质谱图的可评价性的连续下降。

当质谱图中的质量分辨率降低时，换言之，当质量信号变宽或移位时，质谱图的可评价性也会劣化。这可能特别地由于在靠近飞行路径的表面上的带电效应而引起。通过应用以名称“盘(pan)”知名的方法(参见DE 196 38 577 C1，对应于US 5,969,348 A和GB2317 495 B)，可以跨越宽的质量范围使质量分辨率很大程度上保持恒定。该方法使用了离子的延时加速(DE＝延时提取)，随后使加速电压随时间连续改变。

为了使每个激光发射产生的离子量保持恒定，人们可能想到调节激光光斑中的能量密度。但是，已经发现，以这样的方式调节激光束的能量密度是不太合适的，因为质谱图随能量密度而定性地发生变化。特别地，在气化云的等离子体中形成的分子离子与在样品的表面中自发地形成(通过所谓的源内裂解，ISD)的碎片离子的比率发生改变，因此质谱图的特征也改变。此外，电离的强度极大地取决于能量密度，所以用于设定相继的激光发射中的能量密度的平衡是很难维持的。任何调节都可能会以不可预知的方式干扰精心创建的质谱图相对于分析物离子分布的平衡，并因此会破坏组织图像的均质性。

因此，本发明提出以这样一种方式来调节检测器增益：不仅跨越持续数小时的连续测量系列补偿了检测器增益的减小(这是二维薄样品切片的成像质谱法所要求的)，而且还补偿了可用离子数量的降低。与所引用的专利US 8,193,484 B2中描述的情况不同，因此不是检测器增益保持恒定，而是所测量的质谱图的质量和可评价性保持恒定。这听起来很简单，但是已经发现，对于较大的薄组织切片的成像质谱法或者对于横向图像分辨率要求非常高的薄组织切片来说是相当必要的。这意味着一直到花费多个小时的获取系列结束都可以维持令人满意的信噪比，并且质谱图中的质量信号的可评价性可以保持恒定。

如果由检测器测量然后被数字化的质谱图的放大离子电流的总和横跨质谱图的选定质量范围长期保持恒定，例如对于作为相当轻的分析物质的脂质来说m/z大约从500到1,100，则可以实现恒定的可评价性的该目的。

最优选的是总离子数跨越整个质谱图保持恒定的实施例。在特殊的实施例中，利用MALDI方法(其通常在质量范围开始处掩盖轻基质离子的离子电流的大部分)的光谱获取甚至包括轻基质离子的较大质量范围，通常在高达m/z大约1,000的范围内，包括基质簇离子。已经发现，包括来自基质物质的离子在内的所有离子电流的总和随时间保持恒定，因此仅比跨越来自组织样品物质的离子的流更合适作为受控变量，这很可能是因为当组织分子被较低程度地离子化时，会残留更大量的基质离子。

在这里必须非常平稳地调节检测器增益。由薄切片中的不同类型组织引起的改变应当在尽可能大的区域内进行平均。因此，优选的是，跨越长测量时间以及薄切片的较大区段观察离子电流的平均值的变化。如果在离子电流的平均值中出现跳跃，则出于调节的目的必须拒绝这些测量。调节应当是非常稳健的。然而，许多实验都表明，可以利用这里所描述的措施来实现这样的调节。

在特别优选的实施例中，为检测器电压的连续改变指定初始漂移，该初始漂移的大小设定为例如每秒0.002伏至0.005伏，使得即使漂移被高估或低估，也预期光谱质量没有缺点，直到可得到充分的测量数据，以允许这里提出的离子电流信号调节生效。然后以该漂移值连续地改变检测器电压。然后使用在每个情况中跨越几百万个测得值(数千个像素)的(总)离子电流的平均值的变化作为基础，以连续地监测所指定的漂移值对于补偿来说是否充分或者是否需要改变。该实施例具有如下优点：检测器增益的调节从来不是突然的，而仅需要漂移值的不定期调节。

图1描绘了在横跨薄切片内的五种不同类型组织进行扫描期间的理想离子电流曲线，其中为检测器电压的连续调整设定良好的漂移值(x轴：第#个像素；y轴：以任意单位表示的离子电流)。区段a1至e1代表当扫描五种不同类型组织时的总离子电流。所示常规尺寸的100,000个像素的扫描持续时间可以假定为大约一个小时。在单独的组织类型内，在每个情况中离子电流的平均值都保持非常恒定，但由于分子量的差异，从一种类型的组织到另一种类型的组织展现出小的跳跃。某些类型的组织(例如，富含脂质的组织)的分子更容易电离，并因此供应较大的离子电流(例如，d1)。在这里，出于说明的目的，将从一种类型的组织到另一种类型的组织的离子电流平均值的变化选取为夸张地大。如上面已经提到的，跨越在同样测量轻基质离子的大区段时进行的扫描，来自不同类型组织的离子电流的平均值可以几乎保持恒定。

相比之下，图2示出了如下状况：其中，检测器电压的校正不是最佳的，因为例如仅二次电子倍增器的增益变化被校正，或者根本没有得到校正，所以尽管有该校正措施，但测得的离子电流仍连续地下降。在这种情况下，必须针对离子电流漂移校正检测器电压。

可以形成跨越几百到几千个像素的滑动平均值作为用于确定光谱质量变化的基础，但也可以更简单地形成每个情况中横跨几百或几千个像素的一系列平均值。在这里，将后者称为“区段平均值”。

有许多方法可以确定检测器电压连续变化的漂移值的校正：

例如，可以简单地使直线适应于横跨均质类型的组织的每个区段的滑动平均值或区段平均值的曲线，并使用其梯度进行调节，即，沿着图1或2中的区段a1、b1、c1等的梯度。在图1中，梯度是零；在图2中，平均值随时间减小。优选的是，单独地确定跳跃之间的每个区段，以避免不同组织类型之间的过渡处的奇异性。

已经发现特别成功的步骤是形成作为时间的函数的平均值的导数。优选的方法是计算每个情况中相继的平均值之间的差异，如图3a和图3b所示。这些差异的变化形成一条曲线，该曲线(理想情况下)应对应于零点附近的高斯分布。当光谱质量得到良好的调节时，差异应精确地在零值附近变化；如果该高斯分布的质心偏离零，则必须相应地改变用于检测器电压的漂移值。图4和图5代表伸展的这种分布曲线；图4是对于检测器电压中的得到很好调节的改变，图5是对于要求校正的漂移值。

也可以形成跨越每个情况中完整扫描线的离子电流的平均值的总和，并利用跨越该一系列扫描线的改变来校正离子电流漂移。

通常通过数模转换器来控制检测器电压。在这里使用深度为14位至16位的控制器来实现高控制精度。尽管进行了精密的控制，但发现与上述实例相比，将该控制改变一个单位要花费数秒，即，不能连续地完成，而是只能逐步地进行。因此，指定在多少秒之后使控制改变一个单位并且在必要时改变该时间跨度，是有利的。

已经发现，在测量开始时可评价性的改变比在其余测量时间段期间可评价性的改变大。造成这种情况的原因可能是多种多样的，还没有明确解释。因此，分别追踪这些改变是有利的。特别地，通过在测量开始时跨越较短时间间隔(例如，跨越10秒，而不是在测量时间段的中间部分和结束时的每次几分钟)观察放大的离子电流或它们的一个或多个平均值，可以考虑这些改变。

上面已经参考不同的具体示例性实施例描述了本发明。然而，应理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以修改所描述的实施例的各个方面或细节。除了MALDI方法之外，诸如SIMS等其它类型的脉冲电离也可以用于薄样品切片的像素扫描。此外，可以设想将质量过滤器或离子回旋共振质谱仪代替飞行时间质谱仪作为质量分析仪。因此，本发明不应限于所阐述的实施例。此外，如果本领域技术人员认为可行，则可以根据需要组合结合不同实施例所公开的特征和措施。此外，以上描述仅作为本发明的说明，而不作为对保护范围的限制，本发明的保护范围由所附权利要求书(考虑了可能存在的等同形式)排他性地限定。