阅读说明：本技术 一种具有抗氧化活性的新酚酸类化合物的制备方法及应用 (Preparation method and application of novel phenolic acid compound with antioxidant activity ) 是由 李志峰 冯育林 王�琦 杨世林 杜伟东 黄文平 游梦 于 2020-07-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种新的酚酸类化合物在制备抗氧化药物中的应用,发明还涉及从中药小花清风藤中提取、分离、纯化本化合物的制备方法。该制备方法简单易行,所得化合物纯度高。药理研究表明该新化合物具有较好的体外清除自由基的能力,可以降低H<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>诱导的巨噬细胞RAW264.7内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成。此外,还可以升高细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性。表明本发明所述化合物具有明显的抗氧化活性,可用于抗氧化药物的制备。具有良好的经济效益和应用前景。(The invention relates to application of a novel phenolic acid compound in preparing an antioxidant medicine, and also relates to a preparation method for extracting, separating and purifying the compound from a traditional Chinese medicine caulis sinomenii. The preparation method is simple and feasible, and the obtained compound has high purity. Pharmacological research shows that the new compound has better capacity of eliminating free radicals in vitro and can reduce H 2 O 2 Induced generation of Reactive Oxygen Species (ROS) within macrophage RAW 264.7. In addition, the activity of intracellular superoxide dismutase (SOD) can be increased. Show thatThe compound of the invention has obvious antioxidant activity and can be used for preparing antioxidant drugs. Has good economic benefit and application prospect.)

一种具有抗氧化活性的新酚酸类化合物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于中医药技术领域，具体为从小花清风藤茎叶中提取分离酚酸类化合物及含有该化合物的中药提取物或混合物的制备方法和在制备抗氧化药物中的用途。

背景技术

氧化应激反应对人体衰老和健康具有非常重大的影响，各种因素导致的过量自由基可以引发和加剧多种疾病，例如阿尔兹海默症、心血管疾病、恶性肿瘤等，因此应用抗氧化剂来维持人体健康具有广泛的需求。由于合成抗氧化剂存在潜在的致癌、毒性等风险，寻找安全、有效、无毒的天然抗氧化剂，成为了当今食品科学中抗氧化剂开发的必然趋势。H₂O₂是诱导氧化损伤细胞模型的关键因子，它能够刺激体内的巨噬细胞合成和释放多种内源性活性因子。利用H₂O₂处理巨噬细胞是常用的体外氧化损伤细胞模型的造模手段。

花清风藤为清风藤科Sabiaceae清风藤属Sabia植物小花清风藤Sabia parviflora Wall. ex Roxb.的干燥茎和叶，大部分生长在我国贵州省和广西省的西南部地区和云南省的西南部至东南部等地。在民间有“小黄药”之称，通常被用来治疗肝炎、黄疸、风湿关节痛和跌打损伤等。

中药是我国巨大的资源宝库，具有五千余年的临床应用经验，从中药中寻找先导化合物已成为近年来新药研究的重要来源，本发明应用现代分离技术与波谱分析方法相结合，从小花清风藤中分离出一种具有抗H₂O₂致RAW264.7氧化损伤细胞模型的酚酸类化合物，非常有望开发成具有知识产权的抗氧化新药候选药物，并将其应用于治疗氧化应激反应的相关疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的酚酸类化合物及其在制备抗氧化药物中的应用。用这种方法制备的该化合物具有较好的体外清除自由基的能力，该化合物还可以降低H₂O₂诱导的巨噬细胞RAW264.7内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。此外，可以升高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

实施本发明的技术方案如下：

一种具有抗氧化活性的酚酸类化合物，其特征为：名称为：5-(3-羧基-4-羟基)-5-氧-2-甲基-2-戊烯酸，其结构式如下：

本发明提供的一种具有抗氧化活性的酚酸类化合物其制备方法为：

方法的具体步骤为：

S1用70%乙醇将小花清风藤的干燥茎和叶提取三次，小花清风藤的茎叶与溶剂的质量比约为1：（10-16），浓缩至无醇味得到浸膏；

S2 将得到浸膏上样于大孔树脂树脂，分别用30%，50%，70%，95%，乙醇进行洗脱；

S3对于经HP-20树脂30%乙醇洗脱部位的部分进行分离，将所得浸膏，依次采用大孔树脂、反相柱色谱、半制备型高效液相色谱、制备型高效液相色谱进行分离，得到该化合物。

优选的，所述的提取方法包括冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法和连续回流提取法。

优选的，所述大孔树脂主要包括以下型号：HP-20、HP-21、SP850、SP700、SP207、AB-8、D101、XDA1、X-5、NKA-2、ADS-2。

优选的，所述反相柱色谱主要包括低压制备色谱、中压制备色谱、高效液相色谱或动态轴向压缩色谱，其中，反相色谱所用的流动相为有机溶剂的水溶液，有机溶剂为甲醇或乙腈。

优选的，所述反相柱色谱的洗脱为梯度洗脱，以体积分数计，所述梯度洗脱程序为：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%有机溶剂的水溶液，分别洗脱2个柱体积。

优选的，所述的制备型高效液相色谱的流动相为甲醇-水溶液或乙腈-水溶液。

上述方法制备的一种酚酸类化合物或含有该化合物的中药提取物或混合物在制备抗氧化类药物中的应用。

上述方法制备的酚酸类化合物或含有该化合物的提取物或混合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。

用这种方法制备的该新化合物具有较好的体外清除自由基的能力，细胞模型法评价结果显示该化合物还可以降低H₂O₂诱导的巨噬细胞RAW264.7内活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的生成。此外，可以升高细胞内超氧化物歧化酶（SOD）的活性。显示良好的抗氧化活性，可用于开发抗氧化的相关药物。

附图说明

附图1为本发明提供一种新的酚酸类化合物结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

制备该酚酸化合物的方法，包括如下步骤：

（1）将小花清风藤茎叶用12倍量的70%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；

（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用30%乙醇溶解，过滤后得上清液；

（3）取步骤（2）得到的上清液上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95 %乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），MeOH-H₂O（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份A～G。D经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，10μm），乙腈-水20:80为流动相，流速10 ml/min，保留时间为65min，最后分离得到所述酚酸类化合物(134.4mg)。

实施例2

制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：

（1）将小花清风藤茎叶用20倍量的95%乙醇溶液加热回流提取2次，每次3小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；

（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用30%乙醇溶解，过滤后得上清液；

（3）取步骤（2）得到的上清液上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95 %乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），MeOH-H₂O（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份A～G。D经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，10μm），乙腈-水20:80为流动相，流速10 ml/min，保留时间为65min，最后分离得到所述酚酸类化合物(134.4mg)。

实施例3

制备如式1结构的化合物的方法，包括如下步骤：

（1）将小花清风藤茎叶用30倍量的75%乙醇溶液冷浸法提取3次，每次24小时，过滤，将滤液减压浓缩得到粗浸膏；

（2）将步骤（1）所得粗浸膏，用30%乙醇溶解，过滤后得上清液；

（3）取步骤（2）得到的上清液上样于HP-20型大孔树脂柱（样品：树脂按照1：3的体积比填充），依次用水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95 %乙醇、乙醇洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积。取30%乙醇洗脱部位经ODS中低压反相液相色谱柱（50*500mm），MeOH-H₂O（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）洗脱得到7个馏份A～G。D经制备型高效液相色谱，色谱条件为：C18-ODS色谱柱（30mm×250mm，10μm），乙腈-水20:80为流动相，流速10 ml/min，保留时间为65min，最后分离得到所述酚酸类化合物(134.4mg)。

实施例4结构鉴定

取实施例1制备得到的该化合物利用光谱技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振（UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR）鉴定其结构，再经TOF高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。

其解析过程与波谱数据如下：

黄色油状物，较易溶于甲醇。通过Q-TOF-MS得到分子离子峰为m/z 264.0634 ([M+H]⁺,calcd. 265.0710)，推断其分子式为C₁₃H₁₂O₆。在其氢谱上观察到三个苯环质子ABX偶合信号[δ _H 6.93 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 7.67 (1H, m, H-2) , 7.67 (1H, d, J = 8.2Hz, H-6)]。一个烯烃质子(δ _H 6.00, dt, J = 14.9, 7.4 Hz, 1H)，一个亚甲基(δ _H 3.66,d , J = 7.3 Hz, 2H)，一个甲基 (δ _H 1.88, s, 3H)。其¹³C-NMR(见表1-2)显示结构包含13个碳，显示结构中包含一个羰基碳信号(δ _C 192.1)，一个苯环信号，两个羧基碳信号(δ _C169.5，169.6)，一个亚甲基碳信号(δ _C 30.1)，一个烯烃信号(δ _C 131.5, 128.9)，一个甲基(δ _C 21.1)。

结合HMBC谱，支链的结构和连接位置的确定与化合物24相同，再根据ABX偶合信号确定羟基和羧基的链接位置。在¹H-¹H ROESY谱中(δ _H 6.00/δ _H 1.88)的交叉峰，证明烯烃的氢处于同侧，为顺式烯烃。根据以上证据，将化合物25鉴定为5-(3-羧基-4-羟基)-5-氧-2-甲基-2-戊烯酸。

波谱数据如下表所示：

核磁数据表

实施例5药效学实验

采用H₂O₂致小鼠单核巨噬细胞RAW264.7氧化损伤细胞模型，考察该化合物的抗氧化作用。

1实验方法

1.1 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素的DMEM培养液于37℃、5%CO₂恒温培养箱中传代培养。

1.2 MTT法检测RAW264.7细胞活力

取对数期的RAW264.7细胞，调整细胞密度2×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。细胞贴壁后，将培养基更换为不含或含有10，20，40，80μmol/L该化合物的DMEM，每个浓度设5个复孔，分别于培养24，36，48h时进行MTT实验。每孔各加入MTT10mL，继续培养4 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置振荡器上振荡10 min，待结晶充分溶解，在490nm处测定吸光度A。实验重复3次。按细胞存活率=(A检测孔/A空白孔)×100%计算细胞存活率。

1.3 H₂O₂致RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型的建立

将RAW264.7 的细胞密度调整为2×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24h后弃去培养基，加入含H₂O₂、10%胎牛血清的DMEM培养基。H₂O₂的终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L，每个浓度设置3个重复孔。培养24h后加入CCK8溶液，继续培养3h，于450nm处检测吸光度值，计算细胞存活率。

RAW264.7巨噬细胞存活率（%）=（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%

1.4 DPPH自由基清除率检测

分别取20μL浓度为20、40、80μmol/L的样品，加入60μmol/L的DPPH 溶液 (以95%乙醇作为溶剂) 100μL，在室温下密封避光反应60 min，然后检测517nm处的吸光度，清除率计算公式

如下：DPPH自由基清除率（%）=[1–(As–Ab)/Ac]×100%

其中As代表实验组吸光度，Ab代表用95%乙醇代替DPPH后的吸光度，Ac代表用双蒸水代替样品后的吸光度，每组做3 次重复实验。

1.5羟基自由基清除率检测

取40μL浓度为2 mmol/L 的FeSO₄，加入40μL浓度为2 mmol/L 的邻菲罗啉及80μL样品后，加入40μL浓度为0.03%（v/v）的H₂O₂启动反应，37℃孵育60min，于536 nm处检测吸光度。

羟基自由基清除率（%）=[ (As–An)/(Ab–An)]×100%

其中As代表实验组吸光度，An代表用双蒸水代替样品后的吸光度，Ab代表用双蒸水代替H₂O₂后的吸光度，每组做3次重复实验。

1.6 RAW264.7巨噬细胞内ROS水平的检测

将RAW264.7巨噬细胞以2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，无血清培养液同步化饥饿培养24h后，分为对照组、过氧化氢组（0.2 mmol/L H₂O₂）、H₂O₂+样品组低中高剂量组（0.2mmol/L H₂O₂+样品浓度20、40、80μg/mL），分别培养24 h。用无血清培养基按1:1000 比例稀释DCFH₂-DA探针，使其终浓度为10μmol/L，之后每孔加入1mL稀释好的DCFH₂-DA，37℃避光孵育40min后，用PBS洗涤细胞3次。胰酶消化细胞收取细胞悬液，装于流式管中用流式细胞仪进行检测。

1.7 该化合物对RAW264.7巨噬细胞内抗氧化酶活性的调节

将RAW264.7 巨噬细胞以2×10⁵个/mL 的密度接种于6孔板中，无血清培养液同步化饥饿培养24h后，分为对照组、过氧化氢组（0.2 mmol/L H₂O₂）、H₂O₂+样品组低中高剂量组（0.2mmol/L H₂O₂+样品浓度20、40、80μg/mL），分别培养24 h，收集细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃，12000r/min，离心15 min，收集上清，按照试剂盒说明书对SOD活性进行检测。

1.8统计学分析采用SPSS18.0软件，实验结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2实验结果

2.1 化合物对RAW264.7 细胞活力的影响

不同浓度化合物与细胞共孵育0～48h，细胞存活率并未降低，药物与细胞共同孵育48h时，细胞存活率仍可达到95%以上，与空白组比较，差异无统计学意义。镜下观察细胞形态良好，无显著差异，未观察到细胞毒性作用。结果表明实验中采用的化合物给药浓度在安全浓度范围之内。见表1。

表1化合物对RAW264.7细胞存活率的影响（x±s，n=5）

2.2 H₂O₂致RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型的建立

0.1、0.2 mmol/L 的H₂O₂对巨噬细胞存活率影响较小，故后续实验选择浓度为0.2mmol/L 的H₂O₂建立氧化损伤细胞模型。见表2。

表2 H₂O₂对RAW264.7细胞存活率的影响（x±s，n=5）

2.3该化合物对DPPH自由基的清除能力呈现出一定的浓度依赖性，对DPPH的清除率可达到80%左右。该化合物还表现出较强的羟基自由基清除能力，当浓度为80 μmol/L时，该化合物的羟基自由基清除率为89.2%。见表3。

表3化合物对DPPH和羟基自由基的清除作用（x±s，n=5）

2.4 该化合物对H₂O₂诱导RAW264.7巨噬细胞内ROS水平和SOD活性的影响

ROS是指化学性质活泼的具有含氧基团的化合物。ROS过度增加或持续存在可对细胞形成氧化应激，造成多种损伤。H₂O₂是研究ROS的重要工具，H₂O₂可以迅速穿过细胞膜，通过Fention反应，生成•OH，•OH激发链式反应，产生更多的ROS，可用于模拟ROS对RAW264.7 巨噬细胞的氧化损伤。如表3所示，0.2 mmol/L H₂O₂处理的RAW264.7巨噬细胞相较对照组中的细胞具有更强的荧光强度。0.2 mmol/L H₂O₂和80μmol/L样品处理组的细胞与对照组基本一样，荧光强度显著降低。该结果表明，该化合物可以有效降低RAW264.7巨噬细胞中的ROS水平。见表4。

表4化合物对H₂O₂诱导的RAW264.7产生ROS和SOD的影响