阅读说明：本技术 一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法 (Method for extracting and separating coptisine from celandine ) 是由 田野 高金鑫 周乐 耿阳 韩忠敏 赵绮 郑若楠 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法,采用旋蒸-酸碱提取法,防止高温改变物质的结构和性质,简化提取工艺,减少环境污染,纯化率高,本发明的提取分离方法,分离后分别得到了8-氧化黄连碱(BQC-5)、小檗碱(BQC-6)和黄连碱(BQC-7),分离纯化率高达52.6％,且本发明还发现了高含量的黄连碱在正丁醇相中富集效应促进了抑菌活性。(The invention discloses an extraction and separation method of coptisine in celandine, which adopts a rotary steaming-acid-base extraction method to prevent the structure and properties of substances from being changed at high temperature, simplifies the extraction process, reduces the environmental pollution and has high purification rate.)

一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法

技术领域

本发明属于天然有机化学领域，涉及一种黄连碱的提取方法，具体涉及一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法。

背景技术

白屈菜：【英文名】Greater Celandine Herb，Herb of Greater Celandine【别名】地黄连、牛金花、土黄连、八步紧、断肠草、山西瓜、雄黄草、山黄连、假黄连、小野人血草、黄汤子、胡黄连、小黄连。药材基源：为罂粟科植物白屈菜的全草。多年生草本，高30-100cm，含橘黄色乳汁。主根粗壮，圆锥形，土黄色或暗褐色，密生须根。茎直立，多分枝，有白粉，具白色细长柔毛。化学成份：新鲜植株有浓橙黄色的乳液，乳液中含多种生物碱生物碱含量0.7％或0.97～1.87％。其中有白屈菜碱41％、原阿片碱22％、人血草碱17％、别隐品碱9％、小檗碱5％、白屈菜红碱3％、血根碱1.5％、鹰爪豆碱0.1％，还有羟基白屈菜碱即氧化白屈菜碱、甲氧基白屈菜碱、隐品碱，白屈菜黄碱、白屈菜胺、高白屈菜碱、羟基血根碱即氧化血根碱。除生物碱而外，还含白屈菜酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、胆碱、甲胺、组胺、酪胺、皂甙、黄酮醇、白屈菜醇，还含强心甙，在开花期的含量最高。根含生物碱达1.33％或1.90～4.14％，一部分生物碱与地上部分所含的相同，另含黄连碱、刻叶紫堇明碱、白屈菜玉红碱、白屈菜默碱、菠菜甾醇、少量麦角甾醇和橡胶0.118％。叶含黄酮类1.43％、多量维生素C。维生素C的含量在开花期最高，可达834毫克％，在果实成熟时含量最低，为231毫克％。

黄连碱是白屈菜正丁醇相的主要生物碱类活性成分，黄连碱有抗微生物活性、杀虫活性，诱导神经细胞分化，对胃粘膜有保护作用，抗癌作用，平滑肌松弛作用以及抗肾炎作用等等。

药用植物白屈菜资源丰富易得，本提取工艺可大量富集药用植物白屈菜中的黄连碱，为开发源于自然、用于自然、环境危害小，期望获得高效、低毒、低残留、环境友好型的的绿色新型天然抗菌药物，以保护有限的自然资源，维系生态平衡，提供理论依据和技术参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种白屈菜中黄连碱的提取分离纯化技术路线，采用旋蒸-酸碱提取法，防止高温改变物质的结构和性质，简化提取工艺，并且纯化率高。

本发明采用的技术方案：

一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法，该方法包括以下步骤：

步骤S1：白屈菜中活性成分的提取；

S11：称取白屈菜全草干粉，溶剂为95％工业乙醇，按照固液比为1:15进行混合，混合液放置在旋转蒸发仪上，温度为60℃，常压下提取5次，每次1.5-2.5小时，抽滤提取液，合并五次提取液，45-50℃温度下减压0.09MPa旋转蒸发除掉溶剂，得到浓缩液；

S12:称取20％-30％的浓缩液减压0.09MPa浓缩，得到浸膏；剩余的浓缩液中加入等量的H₂O充分混悬均匀后，再用等量石油醚萃取3-4次，合并萃取液，并减压蒸馏除去石油醚溶剂，得到石油醚相和一次水相；

S13：一次水相用2.5％-5％的HCl调节pH值为1～2，再用等量氯仿溶剂萃取3-4次，合并萃取液，得到酸化氯仿相和二次水相；

S14：二次水相用等量正丁醇萃取3次，合并三次萃取液，并减压0.09MPa除去正丁醇溶剂，得到正丁醇相；

步骤S2：正丁醇相的分离：

S21：将步骤S14制备的正丁醇相利用二氯甲烷进行超声萃取3次至无色，得到二氯甲烷相和不溶物；

S22：将步骤S21中制得的不溶物用甲醇溶解，取棕红色上清液，合并上清液，得到甲醇溶解液；

S23：将步骤S22制得的甲醇溶解液减压0.09MPa蒸馏除去甲醇溶剂，制得红黄色固体粉末，即为黄连碱粗品；

S24：称取60％-70％的黄连碱粗品经氧化铝柱层析，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH按照比例20:1-5:1范围内进行四阶梯度洗脱，得到的混合物再采用薄层制备法，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH＝9:1以及8:1的比例进行二阶梯度洗脱，分离得到8-氧化黄连碱、小檗碱和黄连碱；

S25：将步骤S21制得的二氯甲烷相经氧化铝柱层析，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH按照比例20:1-5:1范围内进行四阶梯度洗脱，分离得到白屈菜碱和8-氧化黄连碱。

优选的，在上述步骤S13中，所述的氯仿溶剂为CHCl₃。

优选的，在上述步骤S21中，所述正丁醇相与二氯甲烷按照固液比1:10进行混合。

优选的，在上述步骤S23中，剩余的黄连碱粗品分次经过C18反相柱层析法，依次以10％、20％、30％、50％CH₃OH-H₂O为梯度洗脱剂至纯CH₃OH，富集分离得到黄连碱。

优选的，在上述步骤S24中，所述的洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH的比例分别为20：1、15:1、10:1以及5:1。

优选的，在上述步骤S25中，所述的洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH的比例分别为20：1、15:1、10:1以及5:1。

一种由上述步骤提取分离的黄连碱在制备植物抗菌药物中的应用。

优选的，所述的黄连碱对玉米弯孢、烟草赤星、马铃薯干腐和番茄早疫病原菌具有显著的抑制活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的白屈菜中黄连碱的提取分离方法，采用旋蒸-酸碱提取法，防止高温改变物质的结构和性质，简化了提取工艺，纯化率高。本发明的白屈菜中黄连碱的提取分离方法，分离后分别得到了8-氧化黄连碱(BQC-5)、小檗碱(BQC-6)和黄连碱(BQC-7)，分离纯化率高达52.6％，且本发明还发现了高含量的黄连碱在正丁醇相中富集效应促进了抑菌活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为白屈菜全草粗提物旋蒸-酸碱提取工艺流程图；

图2为白屈菜正丁醇相生物碱成分提取分离流程图；

图3为白屈菜5种提取物提取率比较图；

图4为黄连碱抗13种植物病原真菌剂量依赖性效应图。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。

实施例1：

参照图1和图2，本发明具体公开了一种白屈菜中黄连碱的提取分离方法，该方法包括以下步骤：

步骤S1:白屈菜中活性成分的提取；

S11：称取100.034g的白屈菜全草干粉，溶剂为95％工业乙醇，按照固液比为1:15(g/mL)进行混合，混合液放置在旋转蒸发仪上，温度为60℃，常压下提取5次，每次2小时，趁热抽滤提取液，合并五次提取液，45-50℃温度下减压(0.09MPa)旋转蒸发除掉溶剂，得到浓缩液175mL；

S12:称取44mL的浓缩液并减压浓缩，得到浸膏4.3833g；剩余131mL浓缩液中加入等量的H₂O充分混悬均匀后，再用等量石油醚萃取3次，合并萃取液，并减压(0.09MPa)蒸馏除去石油醚溶剂，得到石油醚相2.8443g(总计3.7924g，占醇取物比21.63％，占原材料比3.79％)和一次水相；

S13：一次水相用5％的HCl调节pH值为1～2，再用等量CHCl₃萃取3次，合并萃取液，得到酸化氯仿相1.3117g(总计1.7489g，占醇提物比9.97％，占原材料比1.75％)和二次水相；

S14：二次水相用等量正丁醇萃取3次，合并三次萃取液，并减压(0.09MPa)除去正丁醇溶剂，得到正丁醇相2.5668g(总计3.4224g，占醇提物比19.52％，占原材料比3.42％)和三次水相6.4247g(合计8.5663g，占醇提物比48.86％，占原材料比8.56％)；

步骤S2：正丁醇相的分离；

S21：称取棕红色浸膏正丁醇相10.04g，正丁醇相与二氯甲烷按照固液比1:10添加二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷相和不溶物2.31g；

S22：将步骤S21中制得的不溶物用甲醇溶解，取棕红色上清液，合并上清液，得到甲醇溶解液；

S23：将步骤S22制得的甲醇溶解液减压(0.09MPa)蒸馏除去甲醇溶剂，制得红黄色固体粉末，即为黄连碱粗品5.62g；

S24：称取3.67g的黄连碱粗品经氧化铝柱层析(柱型3.5×25/cm)，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH＝20:1、15:1、10:1、5:1的比例梯度洗脱后，再取309.1mg混合物，用薄层制备法，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH＝9:1、8:1的比例梯度洗脱，分离得到分离得到69.3mg BQC-5(8-氧化黄连碱)、48.7mg BQC-6(小檗碱)和138.5mg BQC-7(黄连碱)；

S25：将步骤S21制得的二氯甲烷相经氧化铝柱层析(柱型3.5×25/cm)，依次用洗脱剂CH₂Cl₂：MeOH＝20:1、15:1、10:1、5:1的比例梯度洗脱后，分离得到白色固体粉末225.2mg(白屈菜碱)和淡黄色粉末11.2mg BQC-5(8-氧化黄连碱)。

BQC-5(8-氧化黄连碱)为淡黄色固体粉末，在UV₃₆₅紫外光照射下，呈现天蓝色荧光，在UV₂₅₄紫外光照射下，呈现红斑，溶于氯仿、二氯甲烷，不溶于甲醇，碘化铋钾检测强阳性，显橘红色，空气中逐渐变成灰黑色。

BQC-6(小檗碱)为黄绿色粉末状固体，日光下呈现浅绿色，在UV₃₆₅紫外光照射下，呈现显黄绿色荧光，在UV₂₅₄紫外光照射下，不显色，溶于甲醇，不溶于氯仿、二氯甲烷，碘化铋钾检测强阳性，显橘黄色。

BQC-7(黄连碱)为黄色粉末状固体，日光下呈现黄色，在UV₃₆₅紫外光照射下，呈显黄色荧光，在UV₂₅₄紫外光照射下，不显色，溶于甲醇，不溶于氯仿、二氯甲烷，碘化铋钾检测强阳性，显橘红色。

实施例2

步骤S1:白屈菜中活性成分的提取；

S11：称取100.034g的白屈菜全草干粉，溶剂为95％工业乙醇，按照固液比为1:15(g/mL)进行混合，混合液放置在旋转蒸发仪上，温度为60℃，常压下提取5次，每次2小时，趁热抽滤提取液，合并五次提取液，45-50℃减压(0.09MPa)旋转蒸发除掉溶剂，得到浓缩液175mL；

S12:称取44mL的浓缩液并减压(0.09MPa)浓缩，得到浸膏4.3833g；剩余131mL浓缩液中加入等量的H₂O充分混悬均匀后，再用等量石油醚萃取3次，合并萃取液，并减压蒸馏除去石油醚溶剂，得到石油醚相2.8443g(总计3.7924g，占醇取物比21.63％，占原材料比3.79％)和一次水相；

S13：一次水相用5％的HCl调节pH值为1～2，再用等量CHCl₃萃取3次，合并萃取液，得到酸化氯仿相1.3117g(总计1.7489g，占醇提物比9.97％，占原材料比1.75％)和二次水相；

S14：二次水相用等量正丁醇萃取3次，合并三次萃取液，并减压除去正丁醇溶剂，得到正丁醇相2.5668g(总计3.4224g，占醇提物比19.52％，占原材料比3.42％)和三次水相6.4247g(合计8.5663g，占醇提物比48.86％，占原材料比8.56％)；

步骤S2：正丁醇相的分离；

S21：称取棕红色浸膏正丁醇相10.04g，正丁醇相与二氯甲烷按照固液比1:10添加二氯甲烷进行萃取，得到二氯甲烷相和不溶物2.31g；

S22：将步骤S21中制得的不溶物用甲醇溶解，取棕红色上清液，合并上清液，得到甲醇溶解液；

S23：将步骤S22制得的甲醇溶解液减压蒸馏除去甲醇溶剂，制得红黄色固体粉末，即为黄连碱粗品5.62g；

S24：称取1.955g的由步骤S21制备的黄连碱粗品，分次经过C18反相柱层析法，依次以10％、20％、30％、50％CH₃OH-H₂O为梯度洗脱剂至纯CH₃OH，富集分离得到的黄连碱共计1.05g，分离纯化率高达52.6％。

如果5.62g黄连碱粗品按此法富集，可以得到2.95g黄连碱，按照此提取工艺，黄连碱在白屈菜正丁醇相中的含量高达29.4％。这种富集白屈菜中黄连碱的工艺未见报道。

按照此提取工艺，黄连碱在白屈菜正丁醇相中的含量高达29.4％，黄连碱是白屈菜正丁醇相的主要生物碱类活性成分。虽然黄莲碱单体化合物的活性不高，但是高含量的黄连碱在正丁醇相中富集效应促进了抑菌活性。

在不同提取方法下，步骤S1中白屈菜粗提取物的提取率情况详见表1-1。

表1-1白屈菜5种提取物的提取率比较表

由表1-1和图3所示，采用旋转蒸发仪和超声波提取，白屈菜工业乙醇提取物的平均提取率都为17.22％,其主要成分为水溶性和极性较大的化合物，即水相(平均占醇提物总量的52.2％)和正丁醇相(平均占醇提物总量的18.2％)，其次是石油醚相(平均占醇提物总量的21.63％)，含量最少的是氯仿相(平均占醇提物总量的8.15％)。乙醇提取物(E)、石油醚相(P)、氯仿相(C)、正丁醇相(B)和水相(W)分别占原料比的17.22％、3.72％、1.40％、3.15％、8.96％。由此说明，不管是实验室制备黄连碱，还是工业化大量生产黄连碱，这超声波和旋转提取方法都适合，效果好，经济实惠，因为温度低，化合物不易被破坏；并且省时省力。

黄连碱抗菌剂量或浓度依赖性试验：

剂量(或浓度)依赖性药物(Concentration-dependent drugs or Dose-dependent drugs)是指抗菌药物的杀菌作用具有浓度依赖性，药物峰值浓度越高，对致病菌的杀伤力越强，杀伤速度越快。

在治疗体内致病菌感染时，作用于细菌的抗菌药物浓度和时间是药物取得疗效的两大基本因素。对于不同类型的抗菌药物来说，有些抗菌药物作用浓度是主导因素，有些抗菌药物作用时间是主导因素。

测定高含量的黄连碱在正丁醇相中富集效应的抑菌活性，对黄连碱的浓度分别设置3个梯度，即为100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、50μg/mL共4个梯度，实验黄连碱在正丁醇相中抗13种植物真菌的富集效应和剂量依赖性效应，其浓度梯度与抑菌率相关关系实验结果见表1-2，黄连碱抗13种植物病原真菌剂量依赖性效应(Dose-dependent effect)见图4所示。

由表1-2和图4可以看出，黄连碱的浓度为50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL依次增大时，对玉米弯孢病原菌的抑菌率显著提高，依次为50.5±1.5％、73.0±0.5％、76.4±3.8％、83.2±5.6％；对马铃薯干腐病原菌的抑菌率由50.5±3.9％提高到79.4±4.5％；烟草赤星病原菌的抑菌率由40.1±1.0％提高到61.7±0.7％；番茄早疫病原菌的抑菌率由31.4±3.2％提高到63.3±7.5％。按照本发明的提取工艺，白屈菜正丁醇相中的黄连碱含量高达29.4％。随着黄连碱浓度的增加，黄连碱对13种植物病原真菌的抑制率逐渐增大，抑菌效果与其浓度呈正相关关系，黄连碱的抑菌作用呈普遍而显著的浓度依赖性效应，由此可知白屈菜正丁醇相的抑菌率，与其中主要成分黄连碱的含量呈正相关关系。黄连碱单体化合物活性虽然较低，但其在植物中的含量较高，其高含量，其活性贡献率就大，是本植物正丁醇活性部位的主要活性成分。

依据该试验可以看出，氯仿相和正丁醇相均是白屈菜乙醇提取物的活性部位，但二者的构效关系作用原理不同，白屈菜氯仿相中含有白屈菜碱(15.1％)、血根碱(5.7％)、白屈菜红碱(4.6％)，血根碱和白屈菜红碱具有较高的广谱抑菌活性，血根碱和白屈菜红碱或许是氯仿相的主要活性物质，但其含量并不占绝对优势，所以其活性贡献率并不高，白屈菜碱单体化合物的抑菌效果不好，但其含量是二者总和的1.5倍，其含量的绝对优势具有促进抑菌效果，再者，植物药物的协同效应是普遍存在的，三者在白屈菜酸化氯仿相中的含量共计为25.4％，所以白屈菜酸化氯仿相的抑菌率较高与药物并存促进和协同作用也有关系。