阅读说明：本技术 发根农杆菌介导的植物转化系统及其方法 (Agrobacterium rhizogenes-mediated plant transformation system and method thereof ) 是由 文琴 于鲲 刘清利 许建平 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本申请涉及植物组织培养和转化领域,特别地涉及发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的植物(尤其是向日葵)转化技术。本申请建立了由发根农杆菌介导的向日葵转化,并获得复合植物的技术体系。(The present application relates to the field of plant tissue culture and transformation, in particular to Agrobacterium rhizogenes (Agrobacterium rhizogenes) mediated plant (especially sunflower) transformation techniques. The application establishes a technical system for transforming the sunflower mediated by agrobacterium rhizogenes and obtaining the composite plant.)

发根农杆菌介导的植物转化系统及其方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及植物转化技术领域，更特别地涉及双子叶植物的转基因技术。本发明建立了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的向日葵及其他双子叶植物的转化系统。

背景技术

发根农杆菌(一种格兰氏阴性细菌)能致使植物在受伤部位产生不定发状根。由发根农杆菌介导的植物转化获得的发根，在没有任何植物体外生长调节素的作用下，能快速地派生出大量的侧根^[1]。同时，发根农杆菌能将含有外源基因的T-DNA由Ri质粒整合到植物基因组中，或者在共转化时，双元载体的T-DNA区域也可以整合到植物基因组中^[2][3]。发根农杆菌介导的转化方法具有快速简单的优点，为基因功能研究和根生物生理研究提供了一个有力的工具^[4]。

具体的，发根的应用有以下几个方面。发根转化尤其适合应用于涉及到根系生物学的基因功能研究，如那些在共生和致病相互作用、营养吸收和激素转运中起作用的基因^[5]。在大豆上，K599能有效地诱导多个品种子叶上的毛状根，其离体培养的毛状根可用于大豆胞囊线虫的繁殖，为大豆胞囊线虫的功能研究提供了一种简便有效的工具^[6]。发根的大量培养对于高价值的次生代谢产物的积累是一个独特的方法。而且，发根也通常应用于次生代谢物代谢途径的研究。

除此之外，发根也可应用于植物生物强化、重金属生物积累、植物生长修复以及人工种子等领域^[7][8]。

复合植物是通过发根农杆菌介导的植物转化获得的一种植物形式。它包含了两部分：地上部分，非转基因的野生型的幼芽、茎和叶片等；地下部分，转基因的发根。这种植物形式的最大优势是，转基因发根与非转基因的茎和叶片部分的组合形成完整植株，大大延长了发根的存活期，拓展了发根的应用^[1]。

复合植物的应用一般包括以下几个方面：首先，复合植物的应用包括了所有发根的应用领域；其次，复合植物可用于与根茎互作相关的植物修复、植物营养和发育的研究；还可应用于基于植物的疫苗开发、感应作用和功能基因组学等方面的研究。

在我们的研究中，我们将复合植物体系应用于寄生植物向日葵列当(Orobanchecumana Wallr.)对于寄主植物侵染萌发寄生瘤的病理研究。

植物发根农杆菌转化系统在植物转化领域的研究与应用由来已久，尤其是在双子叶植物的研究中很普遍。可是，发根农杆菌介导的向日葵转化却不多见。迄今为止，我们仅检索到一篇关于向日葵发根转化的报道，Yakupova等人利用发根农杆菌菌株a4和15834对向日葵子叶进行转化，获得了独立的发根^[9]。该文章报道的体系的不足之处在于，该体系获得的发根是独立的，并不是复合植株，而且操作繁琐，转化周期长。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种实验操作简单、转化周期短、无基因型依赖的发根农杆菌介导的植物转化系统，其中转化产物是复合植物，其生理特性优于独立的转基因发根。

进一步地，相对于现有植物转化体系，本发明的优势包括：

1.根癌农杆菌介导的植物转化和基因枪转化是现阶段向日葵转化领域中应用的最主要的方法^[10]。这两种转化方法都有明显的局限性，包括：长周期的转化和组织培养过程，劳动量大，消耗资源多，而且具有很明显的基因限制性，很难实现高通量的生产，限制了基因功能研究的拓展。而发根农杆菌介导的向日葵转化方法具有操作简单、周期短、通量大的明显优势^[11]。

2.一般的发根农杆菌介导的植物转化获得转化体都是独立的发根。而本发明获得的转化体是复合植株，转基因发根离开培养基环境后存活时间从不长于一周可延长至三周以上。而且，复合植物的离体培养不需要培养基，减少了时间和资源的成本投入，这样大大拓展了发根的科学研究和生产前景。

3.传统的获得复合植物的方法通常采用萌发了近一周的植物，在其茎上进行农杆菌注射，等转基因发根萌发到一定长度后，再去除自然根。该方法对于植物培养条件要求繁琐，全程需要特殊的高湿度密闭培养箱^[11]。相对于现有的发根农杆菌介导的植物转化方法，本发明的优势体现在转化流程、植物培养条件上得以大大简化。这是因为，本发明的转化外植体选择的是下胚轴连接着子叶的种子部分，其关键在于包含了顶端生长点的子叶节部分。这样的外植体保证了在经过农杆菌转化后，转化产物是完整的复合植物，包含了地下部分和地上部分，即转基因的发根和非转基因的茎和叶。这是直接的获得复合植物的方法，提高了转化效率。

4.本发明不仅适用于向日葵多个品种的转化，而且已成功地在多个大豆品种上实现转化，并获得了复合植物。

发明内容

总体而言，本发明涉及一种发根农杆菌介导的植物遗传转化方法，其包括以下步骤：

1)种子消毒与萌发

选择饱满的植物种子用于进行消毒；

将消毒后的种子播种于含有培养基的培养皿中，并置于适宜于种子萌发的环境中萌发培养；

2)外植体分离

选取萌发好的种子，切除接近根一端的一段下胚轴，剩下的种子部分作为外植体用于侵染；

3)侵染与共培养

将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染，然后将外植体转移到培养皿中进行共培养；

4)筛选培养与根诱导培养

共培养完后，将外植体转移到筛选培养基上培养，并诱导生根，直到获得复合植物。

在一个进一步的实施方案中，所述消毒通过下述方式来进行：用75％的酒精进行表面消毒，然后用次氯酸钠溶液浸泡15分钟，最后用超纯水润洗多次。

在一个进一步的实施方案中，所述适宜于种子萌发的环境为处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境。

在一个进一步的实施方案中，所述共培养进行2到5天，在培养皿中铺有滤纸，且滤纸上含有液体共培养基。

在一个进一步的实施方案中，在共培养时，将滤纸平铺于培养皿中，加入液体培养基，然后将外植体置于滤纸上。

在一个进一步的实施方案中，所述外植体来自于萌发1至7天的种子，优选地萌发3至7天的种子。

在一个进一步的实施方案中，用于外植体分离的种子不带种皮或者带有部分种皮。

在一个进一步的实施方案中，所述外植体分离通过下述方式来进行：选取萌发好的种子，在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处制造伤口，而剩下的种子部分作为外植体用于侵染。

在一个进一步的实施方案中，所述外植体分离通过下述方式来进行：选取萌发好的种子，在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处制造伤口，同时去掉部分子叶，而剩下的种子部分作为外植体用于侵染。

在一个进一步的实施方案中，在筛选培养阶段，所使用的筛选剂为草铵膦，并且其浓度范围为4-8mg/L，优选4mg/L。

在一个进一步的实施方案中，在筛选培养阶段，在筛选培养一周以后，降低或去除筛选剂，从而短期内增殖发根。

在一个进一步的实施方案中，在将外植体浸入农杆菌悬浮液中浸染时，通过离心或震荡来加强基因转化进细胞中。

在一个进一步的实施方案中，所述离心采用600-1000rpm的转速。

在一个进一步的实施方案中，通过所述方法所获得的转化产物为复合植物，其不仅包括发根，而且还包括完整的地上部分。

在一个进一步的实施方案中，所述植物为双子叶植物，尤其是向日葵或大豆。

通过本发明方法获得的转化产物为复合植物，不仅包括发根，还包括植物完整的地上部分。

本发明的转化方法不仅适用于向日葵多个品种，还适用于大豆多个品种，由此可普遍适用于双子叶植物。

附图说明

图1.植物双元表达载体15312示意图。

图2.种子萌发示意图。

图3.外植体示意图。A：外植体分离方法1；B：外植体分离方法2。

图4.共培养示意图。

图5.复合植物示意图。

图6.根的GFP信号表达示意图。

图7.PCR检测示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.通过发根农杆菌介导的向日葵转化获得向日葵复合植物

1.材料与方法

1.1.转化载体构建

本实验转化用到的载体结构如图1所示。载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。所有的载体均含有PAT基因作为植物中的筛选标记，用草铵膦作为筛选剂。最终构建形成的双元载体15312用于遗传转化。

1.2.向日葵的农杆菌转化

实验中所用的向日葵品种为先正达公司的列当易感自交系1、列当易感自交系2、列当抗性自交系3。具体的转化方法包括以下步骤。

1.2.1.种子的消毒与萌发

向日葵种子表面被一层厚的种皮包被着，种皮起到了保护种子的的作用。首先，在进行种子消毒前，需要将种皮小心地剥掉，避免伤害种子。接着，用75％的酒精对种子表面消毒2分钟。然后，在纯的次氯酸钠(Sigma-Aldrich,Vienna,Austria)中滴入一滴吐温20，将种子浸泡其中消毒15分钟。最后，用超纯水润洗种子四至五遍。

种子消毒后，将种子播种于含有培养基的培养皿中，培养基成分包含Gamborg B5基本盐和维生素、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，且pH＝5.6。将培养皿放置在处于室温且光照/黑暗替换周期为16/8小时的环境中培养一直四天，优选一天。

1.2.2.农杆菌的制备

将农杆菌菌株从-80℃冰箱中取出，挑取含有15312质粒的农杆菌菌落，在加有抗生素抗性的YP培养基上划线，在28℃且黑暗条件下培养2-3天。在侵染前一天，刮取YP培养基上的菌斑，在新的YP培养基上过夜培养。刮取菌落，放入含有20ml侵染培养基的50ml离心管中，震荡，使得农杆菌完全稀释在侵染液中，将农杆菌稀释到OD₆₆₀＝0.5-1.0，待用。

1.2.3.外植体的分离

外植体的制备有两种方法：其一如图3A所示，在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处用刀片划出伤口，保留完整的子叶；其二如图3B所示，同样是在接近生长点的子叶节部分，切除下胚轴，并在切口处用刀片划出伤口，但不同的是，切除任意一片或两片子叶的部分。

1.2.4.侵染与共培养

将外植体至于农杆菌菌液中，每10毫升菌液放置30个外植体，在600-1000rpm的速度下离心5分钟，然后静置约一到两小时。

侵染完后，收集外植体于培养皿中，并用医用胶带缠绕培养皿四周，保持湿度。培养皿里预先放置滤纸，再加入液体共培养基(如图4所示)。

1.2.5.筛选培养和根诱导培养

共培养两至三天后，将外植体转移至筛选培养基培养3周。筛选培养基主要成分包括：MS基本盐、30g/L蔗糖、2g/L MES、200X B5维生素、250mg/L头孢霉素、8g/L琼脂以及筛选剂(本发明所用筛选剂为草铵膦)。

在筛选培养一周之后，在外植体侵染部位会萌发生成发根。在筛选培养三周之后，发根长度能达到5-6厘米长，同时地上部分的幼苗部分正常生长，形成茎和叶。由此，获得的转化体为复合植株，其地上部分的茎和叶是非转基因的，和其地下部分的发根是转基因的(如图5所示)。

1.3.转化发根的鉴定

A.转化发根的GFP表达鉴定

通过荧光显微镜观察发根的GFP表达效果，确定发根为转基因阳性的。具体如图6所示，转化的发根均有GFP荧光表达；而非转化的自然根作为阴性对照，没有绿色荧光。

B.PCR检测转化发根

从图7中可以看出，通过PCR对6个转化发根的基因组DNA进行检测，结果均为阳性，进一步证明T-DNA成功整合到转化发根基因组中。

2.实验结果

2.1.发根农杆菌介导的多个向日葵品种转化结果(实验SHR29)

由表1中的结果所示，本发明的发根农杆菌介导的向日葵转化方法可在多个向日葵品种中得以成功实现，无基因型依赖。其转化频率均在85％以上，且获得健康复合植物的比例也达到了50％。实验中所用的向日葵品种为先正达公司的列当易感自交系1、列当易感自交系2、列当抗性自交系3。

表1.多个向日葵品种转化结果

说明：转化效率表示健康完整的复合植物数占实验起始外植体总数的比例

2.2.转化外植体及其分离方法的优化实验结果(实验SHR25、SHR39、SHR40和SHR27)

在下面的表格中，表2是实验结果，表3是表2实验处理的具体说明。从结果可以看出：萌发一天到七天的种子均可作为转化受体进行发根农杆菌的转化；在分离外植体时，子叶留下一片或者完全保留也可以实验转化，获得发根及复合植物；同时，在子叶上创造伤口，农杆菌侵染后的伤口细胞也能诱导出发根；最后，保留种皮与否，均能获得发根和复合植物。

还可以看出，选择3-7天的外植体作为侵染受体，由于其对于农杆菌侵染和除草剂筛选耐受性增加，可明显提高转化效率，既提高了后期健康的复合植株利用率。

整个转化周期仅需3-4周，大大缩短了转化周期；且全程在培养基环境直接获得向日葵复合植物，操作简单。

表2.不同外植体转化结果-1(SHR25/SHR39/SHR40)

注：TID A-F实验结果出自实验SHR25；TID G实验结果出自实验SHR39；TID H实验结果出自实验SHR40。

表3.不同外植体转化结果-2(SHR25)

在下面的表格中，表4是实验结果，表5是表4实验处理的具体说明。结果说明：无论向日葵种子保留完整的或者不完整的子叶，发根农杆菌侵染在其下胚轴上的切口细胞，都能成功诱导发根，并获得健康的复合植物。

表4.不同外植体转化结果-3(SHR27)

表5.不同外植体转化结果-4(SHR27)

2.3.农杆菌侵染方法的优化实验结果(实验SHR27)

如6表所示，分离外植体后，将外植体浸泡在农杆菌菌液中，离心处理有助于提高转化效率。

表6.不同侵染方法的转化结果

2.4.农杆菌侵染方法的筛选剂浓度优化实验结果(实验SHR41和SHR40)

如7表所示，筛选培养阶段，筛选剂草铵膦浓度范围在4-8mg/L时，筛选两周以后，都能获得健康的带有生长点的复合植物，且4mg/L优于8mg/L。

特别地，在外植体筛选培养一周后，即可获得大量健康的复合植株。如果后续将外植体至于低浓度筛选及的培养基上或无筛选剂的培养基上培养，将在短期内使得发根大量增殖，用于后续测试实验。由此可见，从准备外植体开始，获得复合植株的周期可缩短为三周。

实验SHR41，针对7天的外植体，在侵染完，农杆菌与外植体的共培养时间由原来的2天(如实验SHR25)，延长至5天，有助于外源基因整合进入植物细胞中，获得转基因发根。

表7.筛选剂浓度优化实验结果

实施例2.通过发根农杆菌介导的大豆转化获得大豆复合植物

1.材料与方法

发根农杆菌介导的大豆转化所用到的材料与方法参照实施例1，并保持一致。

2.实验结果

发根农杆菌介导的多个大豆品种转化结果(实验SHR30)

由表8中的结果所示，本发明的发根农杆菌介导的植物转化方法可在多个大豆品种中得以成功实现。其转化频率均在10％以上，且获得了健康完整的的复合植物。

表8.多个大豆品种转化结果

讨论：

综上所述，本发明提供了一种实验操作简单、转化周期短、无基因型依赖的发根农杆菌介导的植物转化系统，转化产物是复合植物，其生理特性优于独立的转基因发根，大大拓展了发根的应用领域。该方法不仅适用于向日葵和大豆的多个品种，在其他双子叶作物上也能实现转化。

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