阅读说明：本技术 通过靶向抑制dna扩增来选择性富集混合dna样品中的dna群体 (Selective enrichment of DNA populations in mixed DNA samples by targeted inhibition of DNA amplification ) 是由 奇亚豪·徐 梅利斯·N·阿纳赫塔尔 杜格尔·麦克劳林 米丽娅姆·H·亨特利 杰斯里·D·布鲁 于 2018-10-18 设计创作，主要内容包括：本公开内容提供了用于在包含多个DNA群体的混合样品中选择性富集一个DNA群体的方法和产物。在一些实施方案中,所述混合样品包含一个或更多个微生物DNA和哺乳动物宿主DNA群体,特别是包含在来自感染个体的临床样品中与哺乳动物宿主DNA混合的病原微生物DNA。(The present disclosure provides methods and products for selectively enriching one DNA population in a mixed sample comprising multiple DNA populations. In some embodiments, the mixed sample comprises one or more populations of microbial DNA and mammalian host DNA, particularly pathogenic microbial DNA mixed with mammalian host DNA in a clinical sample from an infected individual.)

通过靶向抑制DNA扩增来选择性富集混合DNA样品中的DNA 群体

技术背景

哺乳动物组织中的病原微生物感染是一个主要的保健问题。血液的细菌感染(称为菌血症(bacteremia))通常可用抗生素进行治疗，但有时导致脓毒症，脓毒症是危及生命的疾病，其中如果不及时治疗整个身体会变得发炎，导致多器官衰竭并最终死亡。随着抗菌抗性的提高，细菌感染的治疗变得更加具有挑战性。仅在美国，每年约有2,000,000名患者患有具抗菌抗性生物体的细菌感染并且这些患者中的约100,000名因感染而死亡。目前在医院中诊断的感染中接近一半对至少一种常见的抗菌药物具有抗性，并且在药物抗性感染的情况下，死亡风险可翻倍。迅速且正确鉴定感染中所涉及的病原体及其抗菌易感性模式对避免永久性伤害或死亡可以是至关重要的。

迅速且全面鉴定病原体及其抗菌易感性模式的一个主要挑战是病原体通常是生物样品中的非常小的部分。例如，在临床相关的血液样品中，每毫升血液中的病原性细胞可少于10个。同时，可存在数十亿个人细胞，每个人细胞容纳约1,000倍以上的基因组物质，这对于诊断，特别是基于核酸的诊断提出了严峻的挑战。用于克服该挑战的传统方法是通过在允许生长的环境(例如对于细菌或真菌而言的营养丰富的肉汤或者对于病毒而言的允许的细胞系)中培养试样来产生更大的病原体群体。培养病原体可使病原体：人DNA的比提高至少一百万倍，但这很耗时并且通常可能无法产生成功的结果。

例如，从血液中进行细菌培养可花费至少36小时来产生纯菌落，并且在几乎一半的严重脓毒症病例中无法培养病原微生物(Martin et al.(2003)，New Eng.J.Med.，348：1546-1554)。另外，尽管在存在抗生素的情况下培养细菌仍然是全面抗生素易感性测试(antibiotic susceptibility testing，AST)的黄金标准，但该过程需要至少数天，而在难以培养的病原体(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))的情况下则需要三周或更长时间。这种延迟对于患者而言可能是致命的，他们在严重血流感染中的死亡风险每小时可提高8％。医师使用采用功能强大的旨在对感染“进行地毯式轰炸(carpet bomb)”的广谱抗生素的经验治疗进行治疗而不是等待。这种方法是昂贵的，使患者暴露于显著的药物毒性并促使抗生素抗性的扩散。最重要的是，由于多个药物抗性病原微生物的风险，经验治疗正在变得越来越低效。

为了缩短诊断时间，经常采用基于核酸的诊断。目前的测定主要依赖于以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)形式的靶向核酸扩增来选择性地将病原体基因组的短的(＜1千碱基)、预选的区域扩增至在背景人DNA水平之上的可检测水平。基于PCR的诊断可以是快速的，但是其对靶探针的依赖将其限制于有限数量的靶标，这阻止了其全面鉴定已知病原体物种(其中有数千种)和已知抗菌抗性基因(其中存在至少1,600种基于PCR的诊断在确定复杂的、基于多态性的抗性方面也不总是精确的)。另外，靶向扩增对抗菌抗性(antimicrobial resistance，AMR)基因的遗传背景是缺乏了解的(blind)，该遗传背景对于以下情况，例如多种微生物细菌感染、污染物(例如携带mecA的表皮葡萄球菌(Staphylococcal epidermidis))的存在以及当基因位置重要时是至关重要的。

为了允许病原体的全面鉴定以及不仅鉴定公知的且良好表征的抗性基因，而且鉴定更复杂的抗性机制，全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)在过去的数年中已作为用于病原体鉴定和抗菌易感性二者的有希望的新诊断方法出现。在全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)之后对病原微生物的全基因组进行测序可解决与传统培养相关的一些问题。例如，在细胞培养中使用体外酶活性来扩增DNA序列而不是体内复制，可将产生可用量的微生物遗传物质所需的时间从数天显著缩短至数小时。另外，避免细胞培养还使得能够从微生物(包括即使用现代培养方法也不可培养的病原微生物物种)中扩增DNA(例如Kvist et al.(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.74(4)：926-935；Huanget al.(2015)，Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.，16：79-102)。然而，当宿主DNA或污染性DNA可比目的DNA更丰富多达8至9个对数时，在本领域中仍需要有效地成功产生全基因组序列的改进方法。以无偏的方法在包含微生物和哺乳动物核酸的混合物的生物样品中选择性或优先扩增和富集核酸(包括病原微生物DNA)的子集可使得能够使用WGA进行高灵敏度诊断。