阅读说明：本技术 一种鲨鱼软骨粉替代品及其制备方法 (Shark cartilage powder substitute and preparation method thereof ) 是由 付鹏磊 王冠丹 孙倩 王晓瞳 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鲨鱼软骨粉替代品及其制备方法,属于海洋生物技术领域。本申请以鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨为原料,集成生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、现代生物分离技术,研制开发出具有突出免疫增强的鲨鱼软骨粉替代品,其中生物酶解技术采用的复合酶系为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶的中的一种或几种的混合物,混菌微生物发酵的发酵菌种主要包括地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。利用本发明工艺制备的鲨鱼软骨粉替代品硫酸软骨素含量高,且具有较高的抗氧化能力和显著的抗肿瘤功效,可广泛应用于补钙和预防肿瘤等医用食品中。(The invention discloses a shark cartilage powder substitute and a preparation method thereof, belonging to the technical field of marine organisms. According to the method, shark cartilage powder and sturgeon bone are used as raw materials, a biological enzymolysis technology, a mixed-bacteria microbial fermentation technology and a modern biological separation technology are integrated, and a shark cartilage powder substitute with outstanding immunity enhancement is developed and developed, wherein a compound enzyme system adopted by the biological enzymolysis technology is one or a mixture of papain, trypsin, neutral protease and pepsin, and a fermentation strain fermented by the mixed-bacteria microbial mainly comprises bacillus licheniformis and bacillus subtilis. The shark cartilage powder substitute prepared by the process has high chondroitin sulfate content, high oxidation resistance and obvious anti-tumor effect, and can be widely applied to medical foods for calcium supplement, tumor prevention and the like.)

一种鲨鱼软骨粉替代品及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鲨鱼软骨粉替代品及其制备方法，尤其是一种利用生物酶解和微生物发酵协同制备免疫增强效果的鲨鱼软骨粉替代品新产品，属于海洋生物技术领域。

背景技术

鲨鱼是世界上最古老、最长寿的深海海洋生物之一，在地球上已生存了四亿年之久，它具有完善免疫系统，生命力极强，几乎不被疾病感染，即使受到外伤，伤口也能很快复原，鲨鱼患癌症的几率约为1/百万。我国鲨鱼药用始见于《本草经集注》，其软骨主要由软骨细胞和含有胶原纤维及大量蛋白多糖和细胞外基质构成，从鲨鱼软骨中提取的多糖在临床上主要用于治疗神经痛、偏头痛、腹腔手术后疼痛等。在欧、美、日等发达国家，鲨鱼软骨多糖作为保健食品或保健药品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病，无明显的毒副作用。近年来研究表明鲨鱼软骨中除富含钙、磷、镁等矿物质外，还含有多种粘多糖及硫酸软骨素，具有显著的抗凝血、降血脂、抗病毒和抗肿瘤等功用，是不可多得的天然食品资源。由于鲨鱼软骨粉具备促进人体软骨再生，抑制新生血管的天然功效，因此鲨鱼软骨粉是一种优良的免疫增强原料。近年来，鲨鱼翅骨粉保健食品开发得到快速发展，但因为鲨鱼资源量的制约，其在医药、食品等领域的广发应用受到制约。目前尚未发现鲨鱼软骨粉替代品的技术报道，本发明为解决上述技术问题，提供一种鲨鱼软骨粉替代品及其制备方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，实现鲨鱼软骨粉等海洋生物资源的功能活性物质高效提取及广泛应用，本申请提供一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、海洋生物资源营养调配技术，研制开发出高免疫增强能力的鲨鱼软骨粉替代品，满足保健、医疗、食品等领域对鲨鱼软骨粉替代品的应用需求，该工艺制备硫酸软骨素产品得率高，具有较高的抗氧化能力和显著的抗肿瘤功效，可广泛应用于医养食品中。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比1～2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4～6h；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.15～0.20%(NH₄)₂SO₄、0.10～0.15% KH₂PO₄、0.1%MgSO₄，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12～24h；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

上述步骤（1）中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:3～5。

上述步骤(1)中所述氢氧化纳溶液的浓度为1～1.5%，所述氧化纳溶液的浓度为5～6%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的2.5～3.5倍。

上述步骤(2)中所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶的中的一种或几种的混合物。

优选的，上述步骤(2)中所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1。

优选的，上述步骤（3）中发酵液配制过程中添加0.5～1%的几丁聚糖。

上述步骤（5）中所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3。

上述复合微生物菌剂种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，分别制得液体地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；然后将二种芽孢杆菌的种子液按比例混合。

本发明提供一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，所得鲨鱼软骨粉替代品免疫增强功效优于鲨鱼软骨粉，可广泛的应用于医疗、食品和保健产品中。

本发明提供一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：

（1）本申请利用好氧菌（地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）共同发酵酶解液，充分利用微生物间的协同作用，提升鲨鱼软骨粉替代品的免疫增强功效；多菌种混合发酵不仅提高了鲨鱼软骨粉替代品的得率，而且通过微生物间的发酵作用提升了鲨鱼软骨粉替代品的免疫增强能力；

（2）实验结果表明本申请在发酵液中添加一定量的几丁聚糖可以显著提升鲨鱼软骨粉替代品的营养保健活性；

（3）本发明采用酶解和混菌微生物发酵制备鲨鱼软骨粉替代品，显著提升了鲨鱼软骨粉替代品的提取率和产品营养保健功效，实验结果表明在此工艺条件制备的鲨鱼软骨粉替代品较直接食用鲨鱼软骨粉免疫增强功效显著提升，丰富了鲨鱼软骨粉类产品原料来源，具有广阔的市场应用价值。

具体实施方式

以下实施例中复合微生物菌剂活化方法均采用以下工艺制备：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，分别制得液体地衣芽孢杆菌、和枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥10⁹cfu/mL；然后将二种芽孢杆菌的种子液按2:3的比例混合。

实施例1

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:3；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例2

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:4；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例3

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:5；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例4

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:3；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄、0.5%几丁聚糖，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例5

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:4；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄、0.5%几丁聚糖，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例6

一种鲨鱼软骨粉替代品的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）预处理：将鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨粉碎过100目筛，加入氢氧化纳溶液和氧化纳溶液，于温度为40～50℃的条件下提取12～13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6～7.9；其中鲨鱼软骨粉和鲟鱼骨的质量比为1:3；所述氢氧化纳溶液的浓度为1%，所述氧化纳溶液的浓度为5%，所述的氢氧化纳溶液和氧化纳溶液的加入量均为鲨鱼软骨和鲟鱼骨重量和的3.5倍；

（2）复合酶解：向步骤（1）中的滤液中加入鲨鱼软骨粉质量比2%的复合酶制剂，在40～60℃的条件下酶解4h；所述复合酶制剂为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合，其质量比为2:1；

（3）发酵液制备：向酶解液中加入酶解液质量比2%葡萄糖、0.20%(NH₄)₂SO₄、0.15%KH₂PO₄、0.1%MgSO₄、0.5%几丁聚糖，制备液体发酵培养基；

（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；

（5）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵24h；所述复合微生物为地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为2:3；

（6）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物；

（7）浓缩干燥：将步骤（6）过滤后的发酵液进行和干燥，获得鲨鱼软骨粉替代品。

实施例7 不同工艺条件对鲨鱼软骨粉替代品免疫增强能力的影响

1、指标测定方法

根据张秀娟等《鲨鱼软骨粉对S180荷瘤小鼠免疫细胞调节功能的影响》文中所述试验方法测定本申请鲨鱼软骨粉替代品对对S₁₈₀荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖功能和吞噬细胞吞噬活性的影响。

、试验方法及分组

小鼠随机分成9组,试验组鲨鱼软骨粉替代品灌胃给予100mg·kg^-1，阴性对照组给予同体积生理盐水,每组10只。无菌抽取接种第7天的生长良好的S₁₈₀荷瘤小鼠腹水(活细胞数>97%),生理盐水1∶3稀释,按0.2mL/只,小鼠右前腋皮下接种。接种24 h后给药,1次/d,连续给药10d,停药次日眼球采血；

分组方法为：实施例1-6组分别灌胃实施例1-6所述鲨鱼软骨粉替代品，对照1组灌胃等质量鲨鱼软骨粉，所述鲨鱼软骨粉生产工艺同实施例4，原料仅含鲨鱼软骨粉；对照2组灌胃等质量鲨鱼软骨粉替代品，所述鲨鱼软骨粉替代品生产工艺仅含鲟鱼骨，其余同实施例4；

3、试验结果

表1 不同工艺条件对鲨鱼软骨粉替代品免疫增强抗肿瘤能力的影响

试验组别	A<sub>570</sub>值	A<sub>490</sub>值
			阴性对照组	0.2648	0.6581
实施例1试验组	0.5053	1.3525
			实施例2试验组	0.4843	1.1738
实施例3试验组	0.4436	0.9969
			实施例4试验组	0.5649	1.3784
实施例5试验组	0.5572	1.3550
			实施例6试验组	0.5609	1.3583
对照1组	0.5947	1.4726
			对照2组	0.3543	0.8357

上述实验结果表明，本发明实施例鲨鱼软骨粉替代品均具有较好的抗肿瘤免疫增强活性，营养保健价值较高，可以替代鲨鱼软骨粉，丰富原料来源；此外，试验结果还表明在发酵液中添加一定比例的几丁聚糖能够提高鲨鱼软骨粉替代品的鲟鱼骨添加量。实施例6为本发明最佳实施例。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。