一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法
阅读说明：本技术 一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法 (Acellular dermal matrix tissue engineering scaffold and preparation method thereof ) 是由 陈维明 白玉龙 陈金发 周小垚 胡凯 姚杰 侯立存 李淼 骆井万 汪晶晶 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及组织工程支架技术领域,尤其涉及一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法。本发明将异种或异体皮浸入盐溶液中去除表皮组织,得到真皮组织；将真皮组织依次进行灭活处理和脱细胞处理,得到真皮基质；将所得真皮基质顺次进行干燥和细化处理,得到真皮基质纤维；将真皮基质纤维与分散液混合后依次进行冷冻干燥和交联处理,即得脱细胞真皮基质组织工程支架。本发明提供的脱细胞真皮基质组织工程支架,制备时无需酶处理和辅助材料的添加,保持了脱细胞真皮基质优异的生物相容性；且孔隙率高,形状可塑性强,有利于细胞的长入和营养物质的渗透,满足复杂形状缺损的修复。(The invention relates to the technical field of tissue engineering scaffolds, in particular to an acellular dermal matrix tissue engineering scaffold and a preparation method thereof. The invention immerses the xenogenous or xenogenous skin into saline solution to remove the epidermal tissue, and then the dermal tissue is obtained; sequentially inactivating and decellularizing the dermal tissue to obtain a dermal matrix; sequentially drying and thinning the obtained dermal matrix to obtain dermal matrix fibers; mixing the dermal matrix fiber and the dispersion liquid, and then sequentially carrying out freeze drying and crosslinking treatment to obtain the acellular dermal matrix tissue engineering scaffold. The acellular dermal matrix tissue engineering scaffold provided by the invention does not need enzyme treatment and addition of auxiliary materials during preparation, and maintains excellent biocompatibility of the acellular dermal matrix; and the porosity is high, the shape plasticity is strong, the cell growth and the nutrient substance permeation are facilitated, and the repair of complex shape defects is met.)
技术领域
本发明涉及组织工程支架技术领域，尤其涉及一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法。
背景技术
脱细胞真皮基质是由异种或异体皮经过脱细胞处理后得到的一种细胞外基质，因其生物相容性良好，被广泛应用于烧伤、整形、组织工程支架等领域。中国专利CN109675112A公开了一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，该方法制备得到的脱细胞异体真皮基质为片状结构，空隙较为致密，难以满足细胞快速长入和作为三维结构组织工程支架及复杂形状填充物的要求。因此，将片状结构的脱细胞真皮基质构建成三维结构、高孔隙率的支架，将克服传统片状结构真皮基质在三维组织工程支架应用方面的不足，有利于细胞的快速长入，加快组织修复进程。
在增加脱细胞真皮基质的空间尺寸的问题上，中国专利CN102258807B公开了一种组织工程用猪脱细胞真皮基质的调孔方法，但该方法需要将阴离子生物大分子或阳离子生物大分子加入真皮基质中，改变了真皮基质原有的成分构成。另外，为实现真皮基质的三维化及获得高孔隙率，中国专利CN109821071A公开了一种基于脱细胞真皮基质的水凝胶及其制备方法，但该方法需要引入胃蛋白酶、胰酶等蛋白酶消化处理，酶处理将会消化真皮基质中的蛋白，降低真皮基质中蛋白聚糖等成分的含量，并且酶处理时间较长，过程较为繁琐。因此，开发一种简单、不改变真皮基质原有成分、具有三维高孔隙结构的脱细胞真皮基质具有重要的临床医用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法，该脱细胞真皮基质组织工程支架为三维多孔结构，具有高孔隙率的特点，克服了传统真皮基质组织工程支架的缺陷和不足。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脱细胞真皮基质组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将异种或异体皮浸入盐溶液中去除表皮组织，得到真皮组织；
(2)将真皮组织依次进行灭活处理和脱细胞处理，得到真皮基质；
(3)将所得真皮基质顺次进行干燥和细化处理，得到真皮基质纤维；
(4)将真皮基质纤维与分散液混合后依次进行冷冻干燥和交联处理，得到脱细胞真皮基质组织工程支架。
作为优选，步骤(1)中所述异种或异体皮与盐溶液的质量体积比为1g:4～6mL，所述盐溶液为氯化钠溶液，所述氯化钠溶液的浓度为1～2mol/L。
作为优选，步骤(2)中所述灭活处理为用酒精灭活，所述真皮组织与酒精的质量体积比为1g:4～6mL，所述酒精的体积浓度为70～80％，所述灭活处理的时间为1～4h。
作为优选，步骤(2)中所述脱细胞处理为将真皮组织浸泡于碱性溶液和聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中，所述真皮组织与碱性溶液的质量体积比为1g:4～6mL，浸泡时间为6～24h，所述碱性溶液的浓度为0.5～2mol/L；所述真皮组织与聚乙二醇辛基苯基醚水溶液的质量体积比为1g:5～15mL，浸泡时间为12～24h，所述聚乙二醇辛基苯基醚水溶液的浓度为0.05～0.15％。
作为优选，步骤(4)中所述分散液为水、生理盐水、叔丁醇中的一种或多种，所述真皮基质纤维与分散液的质量体积比为1g:40～60mL。
作为优选，步骤(4)中所述交联处理为化学交联或物理交联，所述交联处理的时间为4～8h。
作为优选，所述化学交联的交联剂为戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、京尼平中的一种或多种。
作为优选，所述物理交联包括热交联、紫外交联、辐照交联的一种或多种。
本发明还提供了一种所述制备方法制备得到的脱细胞真皮基质组织工程支架。
作为优选，所述脱细胞真皮基质组织工程支架为三维多孔结构。
本发明的有益效果是：
本发明的制备方法简单易行，生产效率高。在制备过程中无需蛋白酶(胃蛋白酶、胰酶等)进行消化处理，无需添加辅助材料，不破坏真皮基质原有的成分组成，保持了脱细胞真皮基质优异的生物相容性。
本发明的脱细胞真皮基质组织工程支架为三维多孔结构，孔隙率高。本发明克服了传统真皮基质组织工程支架的缺陷和不足，孔隙率高达95％，该支架的高孔隙有利于细胞的长入和营养物质的渗透，促进组织修复；且脱细胞真皮基质组织工程支架具有很强的形状可塑性，可以将真皮基质制备成复杂形状的支架，满足复杂形状缺损的修复。
附图说明
图1为片状的脱细胞真皮基质；
图2为片状的脱细胞真皮基质SEM图片；
图3为棉絮状脱细胞真皮基质纤维外观图片；
图4为三维多孔脱细胞真皮基质支架；
图5为三维多孔脱细胞真皮基质支架SEM图片。
具体实施方式
本发明提供了一种脱细胞真皮基质组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)将异种或异体皮浸入盐溶液中去除表皮组织，得到真皮组织；
(2)将真皮组织依次进行灭活处理和脱细胞处理，得到真皮基质；
(3)将所得真皮基质顺次进行干燥和细化处理，得到真皮基质纤维；
(4)将真皮基质纤维与分散液混合后依次进行冷冻干燥和交联处理，得到脱细胞真皮基质组织工程支架。
在本发明中，所述脱细胞真皮基质组织工程支架的制备方法优选先用刀片刮去异种或异体皮毛发，用鼓式取皮机取皮，厚度优选为0.5～2mm，进一步优选为1mm。
在本发明中，步骤(1)中所述异种或异体皮与盐溶液的质量体积比优选为1g:4～6mL，进一步优选为1g:5mL，所述盐溶液优选为氯化钠溶液，所述氯化钠溶液的浓度优选为1～2mol/L，进一步优选为1～1.5mol/L。
在本发明中，所述异种或异体皮浸入盐溶液后优选在摇床上震荡12小时，并用镊子轻轻揭去表皮层；去除表皮组织后优选用纯化水清洗20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，步骤(2)中所述灭活处理优选为用酒精灭活，所述真皮组织与酒精的质量体积比优选为1g:4～6mL，进一步优选为1g:5mL，所述酒精的体积浓度优选为70～80％，进一步优选为75％，所述灭活处理的时间优选为1～4h，进一步优选为2～3h。
在本发明中，所述真皮组织进行酒精灭活后优选用去离子水冲洗20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，步骤(2)中所述脱细胞处理优选将真皮组织浸泡于碱性溶液和聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中，所述真皮组织与碱性溶液的质量体积比优选为1g:4～6mL，进一步优选为1g:5mL，浸泡时间优选为6～24h，进一步优选为12～18h，所述碱性溶液的浓度优选为0.5～2mol/L，进一步优选为1～2mol/L。
在本发明中，所述碱性溶液可优选为氢氧化钠、氢氧化钾等碱性溶液。
在本发明中，所述真皮组织与聚乙二醇辛基苯基醚水溶液的质量体积比优选为1g:5～15mL，进一步优选为1g:8～12mL，浸泡时间优选为12～24h，进一步优选为18～20h，所述聚乙二醇辛基苯基醚水溶液的浓度优选为0.05～0.15％，进一步优选为0.1～0.15％。
在本发明中，所述真皮组织可先浸泡于碱性溶液，再浸泡于聚乙二醇辛基苯基醚水溶液，反之亦可。
在本发明中，所述脱细胞处理优选在摇床上震荡，震荡温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃，震荡速度优选为170～190r/min，进一步优选为180r/min。
在本发明中，所述真皮组织进行脱细胞处理后优选用去离子水冲洗，去除脱细胞液，冲洗时间优选为20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，步骤(3)中所述干燥优选冷冻干燥，所述细化处理优选将真皮基质放入液氮中，再置入超低温粉碎机中粉碎，粉碎时间优选为5～15min，进一步优选为10min。
在本发明中，步骤(4)中所述分散液优选为水、生理盐水、叔丁醇中的一种或多种，所述真皮基质纤维与分散液的质量体积比优选为1g:40～60mL，进一步优选为1g:50～55mL。
在本发明中，步骤(4)中所述冷冻干燥优选在真空冷冻干燥机中进行，干燥时间优选为6～18h，进一步优选为12h。
在本发明中，步骤(4)中所述交联处理为化学交联或物理交联，所述交联处理的时间优选为4～8h，进一步优选为5～7h，更进一步优选为6h。
在本发明中，所述化学交联的交联剂优选为戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、京尼平中的一种或多种。
在本发明中，所述真皮基质纤维与交联剂的料液比优选为1g:15～25ml，进一步优选为1g:18～22ml，更进一步优选为1g:20ml。
在本发明中，所述戊二醛优选浓度为3～5％的水溶液，进一步优选浓度为4％的水溶液；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐优选浓度为0.1～1％的酒精溶液(酒精浓度为90％)，进一步优选浓度为0.5～1％的酒精溶液(酒精浓度为90％)；所述京尼平优选浓度为0.5～2％的酒精溶液(酒精浓度为90％)，进一步优选浓度为1.5～2％的酒精溶液(酒精浓度为90％)。
在本发明中，所述物理交联优选包括热交联、紫外交联、辐照交联的一种或多种，所述热交联优选在100～200℃条件下进行高温处理。
在本发明中，所述交联处理完成后优选用去离子水冲洗20～40min，去除交联剂，并在真空冷冻干燥机中干燥6～18h，进一步优选用去离子水冲洗30min，并在真空冷冻干燥机中干燥12h。
在本发明中，所有冷冻干燥的温度均优选为-60～-20℃，进一步优选为-50～-30℃，更进一步优选为-40℃。
本发明还提供了一种所述制备方法制备得到的脱细胞真皮基质组织工程支架。
在本发明中，所述脱细胞真皮基质组织工程支架为三维多孔结构。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)取皮：用刀片刮去猪皮毛发，用鼓式取皮机取皮，切取真皮基质(含表皮)的厚度为1mm。
(2)去表皮：将异种或异体皮裁剪成1cm×3cm的尺寸，按照1g:5ml的比例浸于1.5mol/L氯化钠溶液中，摇床震荡12h后，用镊子轻轻揭去表皮，得到真皮组织。
(3)病毒灭活：先用纯化水清洗真皮组织30min，再用75％的酒精按照1g:5ml比例浸泡真皮组织2h，去离子水冲洗30min。
(4)脱细胞：将真皮组织浸泡于1mol/L氢氧化钠溶液中，料液比为1g:5mL，浸泡时间为12h；再将真皮组织浸泡于0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中，料液比为1g:10ml，并放入摇床中震荡24h，温度设定为37℃，震荡速度为180r/min，得到真皮基质。
(5)细化：所得真皮基质用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，再将真皮基质放入液氮中，在超低温粉碎机中粉碎10min，得到真皮基质纤维。
(6)交联：将真皮基质纤维置入去离子水中，料液比1g:50ml，混合均匀后倒入圆形的平皿中，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h；然后置于交联剂中交联6h，真皮基质纤维与交联剂的料液比为1g:20ml，交联剂为含有0.6％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的酒精溶液(酒精浓度为90％)；最后用去离子水冲洗，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h，即得脱细胞真皮基质组织工程支架，该支架的孔隙率达到92％。
实施例2
(1)取皮：用刀片刮去猪皮毛发，用鼓式取皮机取皮，切取真皮基质(含表皮)的厚度为1mm。
(2)去表皮：将异种或异体皮裁剪成1cm×3cm的尺寸，按照1g:4ml的比例浸于1mol/L氯化钠溶液中，摇床震荡12h后，用镊子轻轻揭去表皮，得到真皮组织。
(3)病毒灭活：先用纯化水清洗真皮组织30min，再用70％的酒精按照1g:4ml比例浸泡真皮组织2h，去离子水冲洗30min。
(4)脱细胞：将真皮组织浸泡于0.5mol/L氢氧化钠溶液中，料液比为1g:4mL，浸泡时间为6h；再将真皮组织浸泡于0.05％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中，料液比为1g:8ml，并放入摇床中震荡24h，温度设定为36℃，震荡速度为170r/min，得到真皮基质。
(5)细化：所得真皮基质用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，再将真皮基质放入液氮中，在超低温粉碎机中粉碎10min，得到真皮基质纤维。
(6)交联：将真皮基质纤维置入去离子水中，料液比1g:40ml，混合均匀后倒入圆形的平皿中，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h；然后置于交联剂中交联4h，真皮基质纤维与交联剂的料液比为1g:15ml，交联剂为含有0.6％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的酒精溶液(酒精浓度为90％)；最后用去离子水冲洗，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h，即得脱细胞真皮基质组织工程支架，该支架的孔隙率达到90％。
实施例3
(1)取皮：用刀片刮去猪皮毛发，用鼓式取皮机取皮，切取真皮基质(含表皮)的厚度为1mm。
(2)去表皮：将异种或异体皮裁剪成1cm×3cm的尺寸，按照1g:6ml的比例浸于2mol/L氯化钠溶液中，摇床震荡12h后，用镊子轻轻揭去表皮，得到真皮组织。
(3)病毒灭活：先用纯化水清洗真皮组织30min，再用80％的酒精按照1g:6ml比例浸泡真皮组织2h，去离子水冲洗30min。
(4)脱细胞：将真皮组织浸泡于2mol/L氢氧化钠溶液中，料液比为1g:6mL，浸泡时间为18h；再将真皮组织浸泡于0.15％的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液中，料液比为1g:12ml，并放入摇床中震荡24h，温度设定为38℃，震荡速度为190r/min，得到真皮基质。
(5)细化：所得真皮基质用去离子水冲洗后进行冷冻干燥，再将真皮基质放入液氮中，在超低温粉碎机中粉碎10min，得到真皮基质纤维。
(6)交联：将真皮基质纤维置入去离子水中，料液比1g:60ml，混合均匀后倒入圆形的平皿中，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h；然后置于交联剂中交联8h，真皮基质纤维与交联剂的料液比为1g:25ml，交联剂为含有0.6％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的酒精溶液(酒精浓度为90％)；最后用去离子水冲洗，冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥12h，即得脱细胞真皮基质组织工程支架，该支架的孔隙率达到95％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种脱细胞真皮基质组织工程支架及其制备方法，本发明在制备过程中无需蛋白酶(胃蛋白酶、胰酶等)进行消化处理，无需添加辅助材料，不破坏真皮基质原有的成分组成，保持了脱细胞真皮基质优异的生物相容性。
传统的脱细胞真皮基质为片状结构，厚度有限，由图2所示的SEM图可以看出，片状的脱细胞真皮基质内部结构致密，孔径小，不利于细胞的长入；而本发明的脱细胞真皮基质经粉碎后呈现棉絮状，而不是粉末状，脱细胞真皮基质组织工程支架为三维多孔结构，孔隙率高，有利于细胞的长入和营养物质的渗透，促进组织修复，且脱细胞真皮基质组织工程支架具有很强的形状可塑性，可以将真皮基质制备成复杂形状的支架，满足复杂形状缺损的修复。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。