阅读说明：本技术 一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片及使用方法 (Micro-fluidic chip for quantitatively detecting bacteria in biological sample and use method ) 是由 颜菁 申炳阳 刘文佳 王磊 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片,包括用于加入所述的生物样本的加样区、与所述的加样区相连通且设置有第一滤膜的第一过滤区、与所述的第一过滤区相连通且设置有第二滤膜的第二过滤区、与所述的第二过滤区相连通的检测区、与所述的第二过滤区相连通且用于加入用于将所述的细菌自所述的第二滤膜上洗脱下来的试剂的第一试剂区、与所述的检测区相连通的第二试剂区。本发明的微流控芯片,试剂消耗量低、分析速度快,同时还具有操作过程简单、便于集成化等优点,生物样本在芯片上的流动可控,且封闭的环境证芯片内部不受污染,特别适合于病原微生物的快速检测。(The invention relates to a micro-fluidic chip for quantitatively detecting bacteria in a biological sample, which comprises a sample adding area for adding the biological sample, a first filtering area communicated with the sample adding area and provided with a first filtering membrane, a second filtering area communicated with the first filtering area and provided with a second filtering membrane, a detection area communicated with the second filtering area, a first reagent area communicated with the second filtering area and used for adding a reagent for eluting the bacteria from the second filtering membrane, and a second reagent area communicated with the detection area. The micro-fluidic chip has the advantages of low reagent consumption, high analysis speed, simple operation process, convenient integration and the like, the flow of a biological sample on the chip is controllable, the inside of the closed environmental card chip is not polluted, and the micro-fluidic chip is particularly suitable for the rapid detection of pathogenic microorganisms.)

一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片及使用方法

技术领域

本发明具体涉及一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片及使用方法。

背景技术

传统检测生物样本中细菌的方法存在步骤繁琐、检测时间长、需要专业人员操作等问题，难以满足对添加物进行现场、快速、微量化、便携化的检测需要。微流控芯片以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征，芯片系统内可集成样品生化反应、分离、检测等基本操作单元，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，从而实现常规实验室的各种功能。

将微流控芯片技术与病原微生物检测技术结合起来，开发可用于生物样本中细菌快速定量检测的微流控芯片，为快速确诊病原微生物提供一种简单、快速、有效的解决方案，对于疾病的治疗和预后具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种试剂消耗量低、分析速度快、操作过程简单、便于集成化、生物样本在芯片上的流动可控，特别适合生物样本中细菌快速定量检测的的微流控芯片。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明一方面提供一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片，其包括用于加入所述的生物样本的加样区、与所述的加样区相连通且设置有第一滤膜的第一过滤区、与所述的第一过滤区相连通且设置有第二滤膜的第二过滤区、与所述的第二过滤区相连通的检测区、与所述的第二过滤区相连通且用于加入用于将所述的细菌自所述的第二滤膜上洗脱下来的试剂的第一试剂区、与所述的第二过滤区和/或所述的检测区相连通的第二试剂区；其中，所述的第一滤膜的孔径设置为允许细菌通过且能够截留体积大于细菌的生物样本中的杂质，所述的第二滤膜的孔径设置为能够截留所述的细菌。

优选地，所述的第一滤膜的孔径为1～100μm，优选为1～50μm，更优选为1～10μm；所述的第二滤膜的孔径为0.01～1μm，优选为0.01～0.5μm，更优选为0.1～0.3μm。使用第一滤膜对生物样本进行粗滤，阻挡生物样本中体积大于细菌的细胞以及结晶体等杂质进入流道，防止流道堵塞，使用第二滤膜对生物样本进行精滤，将生物样本中的细菌截留在第二滤膜上，从而使得细菌可以在检测区富集，保证检测结果的准确度。

优选地，所述的第一过滤区的数量为两个及以上，且两个及以上的第一过滤区串联设置，每个所述的第一过滤区设置有所述的第一滤膜；或者，所述的第一滤膜为沿着所述的生物样本经过所述的第一过滤区的流向设置在一个所述的第一过滤区中的两个及以上，两个及以上的所述的第一滤膜相互平行设置。设置两个及以上的第一滤膜，对生物样本进行两次粗滤，尽可能多的截留生物样本中体积大于细菌的杂质，进一步有效防止流道堵塞并提高第二滤膜上截留的细菌的纯度，避免第二滤膜上杂质过多而影响检测结果的准确性。

进一步优选地，两个及两个以上的所述的第一过滤区中的第一滤膜的孔径或者一个所述的第一过滤区中的两个及以上的所述的第一滤膜的孔径不同，且位于所述的生物样本流向的下游的所述的第一滤膜的孔径小于位于所述的生物样本流向的上游的所述的第一滤膜的孔径。

由于生物样本，例如尿液的成分复杂，细胞、结晶体等杂质较多，并且尿液的粘度相对于水来说更大，因此，采用微流控芯片检测尿液等生物样本时，容易发生堵塞等问题，而本发明通过设置含有第一滤膜的第一过滤区，很好的避免了流道的堵塞，进一步地，本发明通过设置两个第一滤膜，可以进一步提高粗滤的效果且更好的避免流道堵塞。

进一步优选地，位于所述的生物样本流向的上游的所述的第一滤膜的孔径为2～100μm；位于所述的生物样本流向的下游的所述的第一滤膜的孔径为1～2μm，从而使得生物样本中的体积较大的杂质经过第一个孔径较大的第一滤膜先去除，体积较小的杂质在经过孔径较小的第二滤膜去除，从而一方面可以进一步提高粗滤的效果，另一方面也能够更好的避免流道被堵塞。

优选地，所述的第一过滤区的内径与所述的第二过滤区的内径的比值为1.5～2.5:1，从而可以更好的实现细菌的富集，并且可以节约空间，从而使得芯片的体积可以缩小，进而降低芯片的成本。

优选地，所述的第二过滤区与所述的检测区重合；或者，所述的第二过滤区与所述的检测区分离设置。检测区为加入缓冲液、反应液后用于检测溶液中化学发光强度的腔室。如果将第二过滤区和检测区重合设置，可以减少部分流道和检测池的设置，降低芯片内部结构复杂程度，但检测结果会收到滤膜等的干扰。如果将第二过滤区和检测区分开设置，则可以避免检测时，由于第二过滤区存在滤膜等其他杂物导致的背景干扰，提高检测的准确性，并且，由于分开设置，可以使得芯片做得较薄，从而降低成本。

优选地，所述的微流控芯片的厚度为8～12mm，所述的微流控芯片上的流道的内径为1～2mm。

优选地，所述的加样区与所述的第一过滤区重合；或者，所述的加样区与所述的第一过滤区分离设置。

优选地，所述的微流控芯片还包括与所述的第二过滤区和所述的检测区相连通的第三试剂区。通过第三试剂区的设置，可将清洗液、缓冲液或者反应液分开储存。

根据一种实施方式，所述的试剂区为加样口，该种实施方式下，试剂需要通过加样口加入。

根据另一种实施方式，所述的试剂区包括储存有试剂的试剂仓，从而使得试剂无需现配现用，只需在需要加入该试剂时，将试剂仓中预先储存的试剂加入相应的腔室即可，使用更为方便。

本发明中试剂仓为预先在芯片上储存测试过程所需试剂的区域，如清洗液、缓冲液以及反应液等。

优选地，所述的微流控芯片还包括用于加样或加试剂的注射器，从而使得芯片可以和注射器成套使用，而无需使用者额外配注射器。

优选地，所述的微流控芯片还包括与所述的第二过滤区和/或所述的检测区相连通的废液区。

进一步优选地，所述的废液区为出样口，或者，所述的废液区包括用于储存废液的废液仓、用于将所述的废液仓与外界连通的通气孔。

优选地，所述的微流控芯片包括层叠设置的至少一层硬膜层和至少一层软膜层。

本发明中，硬膜层使用的材质为不与生物样本及试剂发生反应的材料即可，优选采用亚克力(PMMA)或聚苯乙烯(PA)等；软膜层使用的材质为不与生物样本及试剂发生反应且可以发生形变的材质即可，优选采用橡胶或硅胶。

根据一种实施方式，所述的微流控芯片包括依次层叠设置且通过粘合剂固定连接的第一硬膜层、第二硬膜层、第一软膜层和第二软膜层；所述的第一硬膜层、所述的第二硬膜层的厚度独立地为3～5mm，所述的第一软膜层、所述的第二软膜层的厚度独立地为0.5～1.5mm；此种方式下，微流控芯片无法重复使用。

根据另一种实施方式，所述的微流控芯片包括依次层叠设置且通过连接件固定连接的第一硬膜层、第一软膜层、第二硬膜层、第二软膜层和第三硬膜层；所述的第一硬膜层、所述的第三硬膜层的厚度独立地为1～3mm，所述的第二硬膜层的厚度为2～4mm，所述的第一软膜层、所述的第二软膜层的厚度独立地为0.5～1.5mm；从而在微流控芯片使用过后，可以将各层拆解清洗后，重新组装成微流控芯片，从而达到重复利用的目的，进而可以节约成本。

进一步优选地，所述的加样区、所述的第一过滤区、所述的第二过滤区、所述的检测区、所述的第一试剂区、所述的第二试剂区、以及连通各区的流道开设在所述的硬膜层上，所述的流道上设置有能够控制所述的流道打开和关闭的挤压阀。

根据一种具体且优选实施方式，所述的流道包括分别与所述的加样区和第一个所述的第一过滤区的底部相连通的第一流道、分别与第一个所述的第一过滤区和第二个所述的第一过滤区的顶部相连通的第二流道、分别与第二个所述的第一过滤区和所述的第二过滤区的底部相连通的第三流道、分别与所述的第二过滤区和所述的检测区的底部相连通的第四流道、分别与所述的第一试剂区的底部和所述的第二过滤区的顶部相连通的第五流道、分别与所述的第二试剂区和所述的检测区的底部相连通的第六流道、分别与所述的第二过滤区的顶部和废液区的顶部相连通的第七流道，所述的废液区开设在所述的第二硬膜层、所述的第一软膜层和所述的第二软膜层上。

根据一种具体且优选的实施方式，所述的微流控芯片包括依次层叠设置且通过连接件固定连接的第一硬膜层、第一软膜层、第二硬膜层、第二软膜层和第三硬膜层；所述的第一硬膜层、所述的第三硬膜层的厚度独立地为1～3mm，所述的第二硬膜层的厚度为2～4mm，所述的第一软膜层、所述的第二软膜层的厚度独立地为0.5～1.5mm。

优选地，当所述的微流控芯片不加样或者不添加试剂时，所述的第一软膜层和所述的第二软膜层分别挡设在流道上使所述的流道关闭；当所述的微流控芯片加样或者添加试剂时，所述的第一软膜层和所述的第二软膜层在压力的作用下发生形变使所述的流道打开。控制流道在芯片常态及使用后均保持关闭状态，可以防止试剂或反应后的反应液挥发到空气中，并且可以保证芯片内部处于封闭的环境中，从而可以保证芯片不易被污染。

进一步优选地，所述的加样区为开设在所述的第一硬膜层上的第一通孔，所述的第一过滤区为开设在所述的第二硬膜层上的第二通孔，所述的第一通孔位于所述的第二通孔的上方且所述的第一通孔的直径小于所述的第二通孔的直径，位于所述的第一通孔和所述的第二通孔之间的所述的第一软膜层上开设有多个第三通孔，所述的第三通孔与所述的第一通孔错开设置；所述的流道包括开设在所述的第二硬膜层上和/或所述的第三硬膜层上且一端与所述的第一过滤区的底部相连通的第一流道、开设在所述的第二硬膜层上且下端与所述的第一流道的另一端相连通的第二流道、开设在所述的第一硬膜层和/或所述的第二硬膜层上且一端与所述的第二流道的上端相连通的第三流道，所述的第二过滤区为开设在所述的第二硬膜层上的第四通孔，所述的第三流道的另一端与所述的第四通孔的顶部连通，所述的流道还包括开设在所述的第二硬膜层和/或所述的第三硬膜层上且一端与所述的第四通孔的底部相连通的第四流道、开设在所述的第二硬膜层上且下端与所述的第四流道的另一端相连通的第五流道，所述的微流控芯片还包括废液区，所述的废液区为开设在所述的第一硬膜层上的第五通孔，所述的第五通孔与所述的第五流道相连通，位于所述的第五通孔和所述的第五流道之间的第一软膜层上开设有多个第六通孔，所述的第六通孔与所述的第五流道错开设置；所述的流道还包括开设在所述的第二硬膜层上且上端与所述的第一试剂区相连通的第六流道、开设在所述的第二硬膜层和/或所述的第三硬膜层上且一端与所述的第六流道的下端相连通的第七流道，所述的第七流道的另一端与所述的第四通孔的底部相连通；所述的流道还包括开设在所述的第二硬膜层上且上端与所述的第二试剂区相连通的第八流道、开设在所述的第二硬膜层上且一端与所述的第八流道的下端相连通的第九流道、开设在所述的第三硬膜层上且一端与所述的第九流道的另一端相连通的第十流道、开设在所述的第二硬膜层上且一端与所述的第十流道的另一端相连通的第十一流道，所述的第十一流道的另一端与所述的第四通孔的底部相连通，所述的微流控芯片还包括开设在所述的第二硬膜层上且用于储存试剂的第三试剂区，当所述的第二试剂区不添加试剂时，所述的第二软膜层部分位于所述的第三试剂区和所述的第十流道之间阻止所述的第三试剂区的试剂进入所述的第十流道，当所述的第二试剂区添加试剂时，所述的第二软膜层发生形变使所述的第九流道、所述的第十流道、所述的第十一流道以及所述的第三试剂区相连通。

更进一步优选地，所述的第一试剂区为开设在所述的第二硬膜层上的第七通孔、储存在所述的第七通孔内的第一试剂、与所述的第七通孔相滑动连接的第一活塞；所述的第二试剂区为开设在所述的第二硬膜层上的第八通孔、储存在所述的第八通孔内的第二试剂、与所述的第八通孔相滑动连接的第二活塞。

本发明另一方面提供一种采用微流控芯片定量检测生物样本中细菌含量的方法，包括如下步骤：

(1)将所述的生物样本自所述的微流控芯片的加样区加入，并使所述的生物样本流过第一过滤区以除去所述的生物样本中的杂质，然后再流过第二过滤区以截留所述的生物样本中的细菌；

(2)使试剂与所述的细菌反应并产生检测信号。

优选地，步骤(2)的具体步骤为：

(a)采用清洗液或缓冲液流过所述的第二过滤区并使所述的第二过滤区中截留的细菌随同所述的清洗液或缓冲液一同流入检测区；

(b)若步骤(a)采用的是清洗液，则向所述的检测区加入缓冲液和反应液；若步骤(a)采用的是缓冲液，则向所述的检测区加入反应液；经孵育后进行化学发光信号的检测。

优选地，所述的方法还包括位于步骤(1)和步骤(2)之间的清洗步骤，所述的清洗步骤具体为：采用清洗液依次流经所述的第一过滤区和所述的第二过滤区，从而可以使流道或者第一过滤区残留的细菌更好的被第二过滤区富集，以及第二过滤区上残留的杂质被更好的去除，进而进一步提高检测的准确性。

优选地，所述的生物样本为尿液。

优选地，所述的清洗液为PBS缓冲液、MES缓冲液、LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基中的一种或多种。

优选地，所述的缓冲液为具有可以表达荧光蛋白的基因的噬菌体溶液，将特定基因导入噬菌体中的方法为本领域的常规方法，其中特定基因可以表达特定的荧光蛋白，与特定的发光底物反应，从而实现催化反应液发光；例如，lux基因会表达lux蛋白，催化癸醛发生氧化还原反应，进而产生光信号；而nanoluc基因则与底物Furimazine反应发光。对于噬菌体的选择，根据所需检测的细菌种类进行确定，例如，K1F噬菌体专一寄宿大肠杆菌，因此，需要检测大肠杆菌时，采用K1F噬菌体；而Felix O1噬菌体专一寄宿沙门氏菌，因而可以用于检测沙门氏菌。

优选地，所述的反应液为发光底物与所述的清洗液的混合物。

本发明中，所述的噬菌体包括K1F噬菌体、Felix O1噬菌体等，具体的噬菌体根据所需检测的细菌进行确定；所述的荧光蛋白包括Lux蛋白、GFP蛋白、NanoLuc蛋白等；所述的发光底物包括癸醛、芳香醛等醛类、咪唑并吡嗪酮类(如Furimazine)等。

进一步优选地，所述的反应液中，所述的发光底物和所述的清洗液的体积比为1:1～50。

优选地，所述的生物样本的加入量为8～15mL，所述的缓冲液的加入量为10～200μL，所述的反应液的加入量为60～2000μL。

优选地，所述的缓冲液和所述的细菌的孵育时间为10～60min。

使用本发明的微流控芯片对生物样本中的细菌进行定量检测的流程见图15至图22，其中，图15至图18是采用清洗液流过所述的第二过滤区并使所述的第二过滤区中截留的细菌随同所述的清洗液一同流入检测区的方法对应的流程图；图19至图22是采用缓冲液流过所述的第二过滤区并使所述的第二过滤区中截留的细菌随同所述的缓冲液一同流入检测区的方法对应的流程图。其中，图15和图19为进样流程，在加样区加入生物样本后，驱动生物样本依次流经第一过滤区、第二过滤区后，流入废液区，第一过滤区会截留样本中尺寸较大的细胞、结晶等物质，第二过滤区将生物样本中的细菌截留、富集。图16和图20为清洗流程，清洗液依次流经第一过滤区、第二过滤区后，流入废液区。图17和图21为冲洗和/或孵育流程，其中，图17采用清洗液将第二过滤区的第二滤膜上截留的细菌冲洗至检测区，此时，需要将缓冲液和反应液再加入检测区，流程见图18；图21是采用缓冲液将第二过滤区的第二滤膜上截留的细菌冲洗至检测区，此时，只需要将反应液再加入检测区，流程见图22。

本发明中可以通过正压、负压或者挤压阀等方式驱动样本和试剂通过流道。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明的微流控芯片，试剂消耗量低、分析速度快，同时还具有操作过程简单、便于集成化等优点，生物样本在芯片上的流动可控，特别适合于病原微生物的快速检测，且可以同时检测多种病原微生物。

附图说明

附图1为本发明的实施例1的微流控芯片的立体透视图；

附图2为本发明的实施例1的微流控芯片的仰视图；

附图3为本发明的实施例1的微流控芯片沿附图2中A-A的剖面图；

附图4为本发明的实施例1的微流控芯片沿附图2中B-B的剖面图；

附图5为本发明的实施例1的微流控芯片沿附图2中C-C的剖面图；

附图6为本发明的实施例1的微流控芯片沿附图2中D-D的剖面图；

附图7为本发明的实施例2的微流控芯片的结构示意图；

附图8为本发明的实施例3的微流控芯片的立体透视图；

附图9为本发明的实施例3的微流控芯片的俯视图；

附图10为本发明的实施例3的微流控芯片的仰视图；

附图11为本发明的实施例3的微流控芯片的主视图；

附图12为本发明的实施例3的微流控芯片的后视图；

附图13为本发明的实施例3的微流控芯片的右视图；

附图14为本发明的实施例3的微流控芯片的左视图；

附图15为一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的进样流程图；

附图16为一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的清洗流程图；

附图17为一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时使用清洗液的洗脱流程图；

附图18为一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的反应流程图；

附图19为另一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的进样流程图；

附图20为另一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的清洗流程图；

附图21为另一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时使用缓冲液的洗脱流程图；

附图22为另一种实施方式的微流控芯片定量检测细菌含量时的反应流程图。

具体实施方式

下面结合附图所示的实施例对本发明作进一步描述，除非文中明确给出不可结合的描述，否则各特征可以根据需要进行结合。

实施例1

本实施例以图1的方位进行定义，其中加样区的开口朝上，废液区的开口朝下。

如图1和2所示，一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片，其包括用于加入生物样本的加样区111、与加样区111通过第一流道112相连通且设置有第一滤膜114的第一过滤区113、与第一过滤区113通过第二流道115相连通且设置有第一滤膜116的第一过滤区117、与第一过滤区117通过第三流道118相连通且设置有第二滤膜123的第二过滤区124、与第二过滤区124通过第四流道129相连通的检测区130、与第二过滤区124通过第五流道126相连通且用于加入用于将细菌自第二滤膜123上洗脱下来的试剂的第一试剂区127、与检测区130通过第六流道131相连通的第二试剂区133、与第二过滤区124通过第七流道121相连通的废液区120。

如图1、图3至图6所示，微流控芯片包括从上至下依次层叠设置且通过粘合剂固定连接的第一硬膜层134、第二硬膜层135、第一软膜层136和第二软膜层137。微流控芯片的厚度优选为8～12mm，其中，硬膜层和软膜层的厚度可以根据需要进行设置，优选地，第一硬膜层134和第二硬膜层135的厚度独立地为3～5mm，本实施例大约为4mm，第一软膜层136和第二软膜层137的厚度独立地为0.5～1.5mm，本实施例大约为1mm。本实施例中的厚度设置是根据微流控芯片内部结构的设置得到的最优选厚度，使微流控芯片达到最佳检测效果的同时，拥有最小的体积，节约了成本。本实施例中，硬膜层采用的材质为亚克力；软膜层采用的材质为橡胶。

加样区111开设在第一硬膜层134和第二硬膜层135上且第一硬膜层134上的开口与外界连通，加样区111为加样口，可以通过注射器插入加样口进行加样，加样区开口朝上；第一过滤区113、117同时开设在第一硬膜层134和第二硬膜层135上且大部分位于第二硬膜层135上；如图3所示，第一过滤区113、117位于第一硬膜层134上的部分呈圆柱体，位于第二硬膜层135上的部分呈圆台形，第一滤膜114、116的直径大于第一过滤区113、117的圆柱体的直径且压设在第一硬膜层134和第二硬膜层135之间。第二过滤区124同时开设在第一硬膜层134和第二硬膜层135上且大部分位于第二硬膜层135上；如图3所示，第二过滤区124位于第一硬膜层134上的部分呈圆柱体，位于第二硬膜层135上的部分呈圆台形，第二滤膜123的直径大于第二过滤区124的圆柱体的直径且压设在第一硬膜层134和第二硬膜层135之间。检测区130同时开设在第一硬膜层134和第二硬膜层135上。第一试剂区127开设在第一硬膜层134上且第一试剂区127为与外界连通的加样口，可以通过注射器插入加样口进行加样。第二试剂区133同时开设在第一硬膜层134和第二硬膜层135上且第二试剂区133为与外界连通的加样口，可以通过注射器插入加样口进行加样，位于第一硬膜层134上的第二试剂区133的部分的口径大于位于第二硬膜层135上的第二试剂区133的部分的口径。废液区120同时开设在第二硬膜层135、第一软膜层136和第二软膜层137上且废液区120为出样口，废液可以通过出样口直接流出芯片，出样口开口朝下。

如图6所示，第一流道112开设在第二硬膜层135的下部，且两端分别与加样区111的底部以及第一过滤区113的底部相连通。如图3所示，第二流道115开设在第一硬膜层134的下部，且两端分别与第一过滤区113的顶部以及第一过滤区117的顶部相连通。如图5所示，第三流道118开设在第二硬膜层135的下部，且两端分别与第一过滤区117的底部以及第二过滤区124的底部相连通，第三流道118的中间位置设有第一挤压阀119。如图4所示，第四流道129开设在第二硬膜层135的下部，且两端分别与第二过滤区124的底部以及检测区130的底部相连通，第四流道129的中间位置设置有第三挤压阀128。如图5所示，第五流道126开设在第一硬膜层134的下部，且两端分别与第二过滤区124的顶部以及第一试剂区127的底部相连通，第五流道126的中间位置处设有第二挤压阀125。如图6所示，第六流道131开设在第二硬膜层135的下部，且两端分别与检测区130的底部以及第二试剂区133的底部相连通，第六流道131的中间设有第五挤压阀132。如图4所示，第七流道121开设在第一硬膜层134的下部，且两端分别与第二过滤区124的顶部以及废液区120的顶部相连通，第七流道121的中间设有第四挤压阀122。

上述各流道的内径为1～2mm，流道上设置的挤压阀可以控制流道打开和关闭，挤压阀的下端设置在第一软膜层136和第二软膜层137上，这样设置可以通过挤压软膜层即可使流道打开和关闭。

第一滤膜114、116的孔径设置为允许细菌通过且能够截留体积大于细菌的生物样本中的杂质，第二滤膜123的孔径设置为能够截留所述的细菌。其中，第一滤膜114、116的孔径独立地为1～100μm，第一滤膜114和第二滤膜116的孔径可以相同，也可以不同，为了进一步提高粗滤效果，第一滤膜114的孔径优选为2～100μm，本实施例为2～5μm，第一滤膜116的孔径优选为1～2μm，本实施例为1μm；第二滤膜123的孔径优选为0.01～1μm，本实施例为0.22μm。

为了使第二滤膜116能够更好的富集细菌，第一过滤区113、117的直径为第二过滤区124直径的1.5～2.5倍，其中，第一过滤区113、117以及第二过滤区124的直径指的是各过滤区呈圆柱体部分的内径，本实施例中，第一过滤区113、117的直径为20mm，第二过滤区124的直径为10mm。

实施例2

本实施例以图7的方位进行定义，其中图7的正面为上。

如图7所示的用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片，其结构基本上与实施例1的结构相同，不同之处下面将详细描述。

加样区包括样品仓212以及与样品仓212相连通的加样口211，通过这样的设置，可以防止加样速度过快导致样品溢出。

第一过滤区214仅为一个，第一过滤区214中设置有沿上下方向分布且平行设置的两个第一滤膜，其中，位于生物样本流向上游的第一滤膜的孔径大于位于下游的第二滤膜的孔径。由于第一过滤区214仅为一个，因此，实施例1中的两个第一过滤区之间的流道相应省略。

第一试剂区221为预先储存有第一试剂的试剂仓，第二试剂区223为预先储存有第二试剂的试剂仓，第三试剂区225为预先储存有第三试剂的试剂仓，其中，第一试剂可以是清洗液，第二试剂和第三试剂中的一个是缓冲液、另一个是反应液。

废液区包括废液仓217以及与废液仓217相连通的通气孔218，从而保证内外压力平衡。

如图7所示，样品仓212和第一过滤区214通过第一流道213相连通；第一过滤区214和第二过滤区216通过第二流道215相连通，第二流道215上设置一个挤压阀，第二过滤区216和检测区227通过第三流道222相连通，第三流道222上设置一个挤压阀；第二过滤区216和第一试剂区221通过第四流道220相连通，第四流道220上设置一个挤压阀；检测区227和第二试剂区223通过第五流道224相连通，第五流道224上设置一个挤压阀；检测区227和第三试剂区225通过第六流道226相连通，第六流道226上设置一个挤压阀；第二过滤区216和废液仓217通过第七流道219相连通，第七流道219上设置一个挤压阀。其中，各流道与各区的顶部还是底部流通，可以与实施例1相同，也可以根据样本的流向设置。

实施例3

本实施例以图8的方位进行定义，其中加样区的开口朝上。

本实施例的结构基本上与实施例1的结构相同，不同之处下面将详细描述。

如图8至图14所示，一种用于生物样本中细菌定量检测的微流控芯片，其包括用于加入生物样本的加样区、与加样区通过流道相连通且设置有第一滤膜的第一过滤区、与第一过滤区通过流道相连通且设置有第二滤膜的第二过滤区、与第二过滤区相连通的检测区、与第二过滤区通过流道相连通且用于加入用于将细菌自第二滤膜上洗脱下来的试剂的第一试剂区、与第二过滤区通过流道相连通的第二试剂区、与第二过滤区通过流道相连通的第三试剂区317。

本实施例中，如图8所示，微流控芯片包括自上而下依次层叠设置且通过多个连接件334固定连接的第一硬膜层329、第一软膜层330、第二硬膜层331、第二软膜层332和第三硬膜层333，硬膜层和软膜层使用的材料同实施例1。通过连接件334的设置，使微流控芯片可拆卸清洗及再次添加试剂，从而实现重复利用。本实施例中，第一硬膜层329和第三硬膜层333的厚度为2mm，第二硬膜层331的厚度均为3mm，第一软膜层330、第二软膜层332的厚度均为1mm。

本实施例中，加样区、第一过滤区、第二过滤区、检测区、第一试剂区、第二试剂区、第三试剂区317以及连通各区的流道开设在硬膜层上，当微流控芯片不加样或者不添加试剂时，第一软膜层330和第二软膜层332分别挡设在流道上使流道关闭；当微流控芯片加样或者添加试剂时，第一软膜层330和第二软膜层332在压力的作用下发生形变使所述的流道打开。通过这样的设置，可以使芯片在常态和使用过后，保持常闭状态，防止反应液挥发至空气中。本实施例的具体结构如下：

如图8至图10所示，加样区为开设在第一硬膜层329上的第一通孔311，第一过滤区为开设在第二硬膜层331上的第二通孔313，第一通孔311位于第二通孔313的上方且第一通孔311的直径小于第二通孔313的直径，位于第一通孔311和第二通孔313之间的第一软膜层330上开设有四个第三通孔312，四个第三通孔312均匀分布在第一通孔311的外围，可以使芯片在未使用前和使用过后，第三通孔312被第一硬膜层329的下表面遮挡，从而将第一通孔311封闭，从而使得加样区保持常闭状态，防止液体挥发至空气中。进样时，在加样区的施加的正压或者废液区施加的负压的作用下，第一软膜层330向下变形，从而使得第一软膜层330的上表面与第一硬膜层329的下表面分离，第一通孔311通过第一软膜层330与第一硬膜层329之间的间隙以及第三通孔312与第二通孔313相连通，从而使得生物样本进入第一过滤区，进样结束后，施加在第一软膜层330上的压力消失，第一软膜层330恢复到原先的状态，第三通孔312关闭。当然其他实施例中，也可以根据情况设置第三通孔312的数量并将第三通孔312与第一通孔311错开设置，采用本实施例的方式，可以使生物样本获得最短的通过第一滤膜的时间，同时使样品均匀、分散的进入第一过滤区，防止第一滤膜堵塞。第一过滤区中第一滤膜的设置方式与实施例2相同。

第二硬膜层331上开设有第四通孔326，其中，第二滤膜设置在第四通孔326的下部位置，第四通孔326可以作为第二过滤区，且第四通孔326被第二滤膜划分成的上部空间的体积大于下部空间的体积，上部空间可以作为检测区使用，即第二过滤区和检测区重合，这样设置可以减少部分通道，并节约空间，减小芯片的体积，节约制作成本。

废液区包括开设在第一硬膜层329上的第五通孔327、开设在第五通孔327和第五流道339之间的第一软膜层330上四个第六通孔328，四个第六通孔328均匀分布在第五通孔327的外围，第一硬膜层329的下表面还开设有直径大于四个第六通孔328围成的圆的直径的凹槽，第五流道339的内径小于四个第六通孔328围成的圆的直径，这样设置可以保证芯片在未使用前和使用过后，第六通孔328被第二硬膜层331的上表面堵住，从而使得第五通孔327保持常闭，防止液体挥发至空气中；在有液体需要从第五通孔327流出时，第一软膜层330在压力的作用下发生形变，第一软膜层330与第二硬膜层331之间产生缝隙，凹槽可以用于允许第一软膜层330进入，从而使得第五流道339通过第六通孔328与第五通孔327连通。当然其他实施例中，也可以根据情况设置第六通孔328的数量并将第六通孔328与第五通孔327错开设置。

第二硬膜层331上开设有一端与第一过滤区的底部相连通的第一流道314、下端与第一流道314的另一端相连通的第二流道315，第二硬膜层331以及第一硬膜层329上分别开设有一端与第二流道315的上端相连通的第三流道316，其中，第三流道316包括开设在第一硬膜层329的下表面上的第一部分以及开设在第二硬膜层331的上表面上的第二部分，第一部分和第二部分的部分重合，或者位于该重合部位的第一软膜层330上还可以开设有通孔，第二流道315与第一软膜层330上的该通孔错开设置，在芯片在未使用前和使用过后，第一软膜层330将第二流道315封闭，当第一软膜层330受到压力变形时，第一软膜层330进入第一部分从而使得第二流道315和第三流道316连通。第三流道316的另一端与第四通孔326的顶部相连通，第二硬膜层331上开设有一端与第四通孔326的底部相连通的第四流道338、下端与第四流道338的另一端相连通的第五流道339。

第二硬膜层331上开设有上端与第一试剂区相连通的第六流道336，第二硬膜层331和第三硬膜层333上开设有分别与第六流道336的下端以及第四通孔326的底端相连通的第七流道337，其中第七流道337包括开设在第二硬膜层331的下表面上且一端与第六流道336的下端相连通的第一部分、开设在第三硬膜层333的上表面上的第二部分、开设在第二硬膜层331的下表面上的第三部分，其中，第二部分的两端分别与第一部分和第三部分部分重叠，当芯片在未使用前和使用过后，第二软膜层332挡设在第二部分的上部并将第二部分与第一部分和第三部分重叠的部分遮挡，当第二软膜层332受到压力时，第二软膜层332进入第二部分，从而使得第一部分、第二部分和第三部分连通。

第一试剂区为开设在第二硬膜层331内部的第七通孔325、储存在第七通孔325内的第一试剂、与第七通孔325相滑动连接的第一活塞324，第七通孔325的一端与第六流道336的上端连通，需要向芯片中加入第一试剂时，通过推动第一活塞324使第一试剂进入到第二过滤区的底部并将富集在第二滤膜上的细菌洗脱至第四通孔326的上部分腔室，其中，第一试剂为缓冲液。

第二硬膜层331上开设有上端与第二试剂区相连通的第八流道320，第二硬膜层331上开设有一端与第八流道320的下端相连通的第九流道319以及与第四通孔326的底部相连通的第十一流道335，第三硬膜层333上开设有第十流道318，第十流道318的两端分别与第九流道319以及第十一流道335的部分重合，第二硬膜层331上开设有储存有第三试剂的第三试剂区317，第三试剂区317位于第十流道318的上方，当芯片在未使用前和使用过后，第二软膜层332挡设在第三试剂区317以及第十流道318之间，并使第二试剂区和第四通孔326之间的流道关闭，当第二软膜层332受到压力时，第二软膜层332进入第十流道318中，第三试剂区317中的试剂由于第二软膜层332的打开而与第二试剂区的试剂一同进入第四通孔326中。

第二试剂区为开设在第二硬膜层331内部的第八通孔321、储存在第八通孔321内的第二试剂、与第八通孔321相滑动连接的第二活塞322，第八通孔321与第八流道320的上端相连通，当需要向芯片中加入反应液时，通过推动第二活塞322使储存在第二试剂区的清洗液进入第八流道320并带动储存在第三试剂区317中的发光底物一同进入第四通孔326中。

本实施例中，如图8至图10所示，微流控芯片还包括质控区，质控区为开设在第二硬膜层331上的第九孔323。

本实施例中，如图8至图14所示，微流控芯片短边的中线上从左至右依次设置质控区、第二过滤区、第一过滤区，第一试剂区和第二试剂区位于质控区的两侧，在其他实施例中，可根据实际情况设置各个区在芯片上的分布，使用本实施例的方式，可以获得最短的流道，缩短检测的时间，同时获得最小芯片体积，降低制作成本。

实施例4

采用微流控芯片定量检测尿液样本中大肠杆菌含量，包括如下步骤：

1、在加样区加入10mL尿液样本后，驱动样本流过第一过滤区和第二过滤区，之后流入废液区，进样流程见图15；

2、用500μL LB培养基清洗芯片内部管路，去除其它非细菌杂质，清洗流程见图16，在采用上述实施例1至2所示结构的芯片时，该LB培养基从加样区加入；

3、用500μL LB培养基通过二次清洗把细菌从第二滤膜上洗脱下来，并流入信号检测区，洗脱流程见图17，其中，实施例1的方案将LB培养基从第一试剂区127加入，实施例2的方案为将LB培养基预存在第一试剂区221中；

4、在检测区加入40μL K1F噬菌体(导入Lux基因)缓冲液和1000μL反应液进行反应，反应液为980μL LB培养基中加入20μL癸醛混匀而成，15min后通过酶标仪读取荧光强度，实现对样本中大肠杆菌的定量检测，反应流程见图18，其中，实施例1的方案将缓冲液和反应液均从第二试剂区133加入，实施例2的方案为将缓冲液和反应液分别预存在第二试剂区223和第三试剂区225中。

实施例5

与实施例4基本相同，不同之处在于检测的细菌为检测尿液样本中沙门氏菌含量，包括如下步骤：

1、在加样区加入10mL尿液样本后，驱动样本流过第一过滤区和第二过滤区，之后流入废液区，进样流程见图15；

2、用500μL PBS缓冲液清洗芯片内部管路，去除其它非细菌杂质，清洗流程见图16；

3、用500μL PBS缓冲液通过二次清洗把细菌从精滤膜上洗脱下来，并流入信号检测区，洗脱流程见图17。

4、在信号检测区加入50μL Felix O1噬菌体(导入Lux基因)缓冲液和1000μL反应液进行反应，反应液为950μL PBS缓冲液中加入50μL癸醛混匀而成，10min后通过酶标仪读取荧光强度，实现对样本中沙门氏菌的定量检测，反应流程见图18。

实施例6

与实施例4基本相同，不同之处在于检测的细菌为检测尿液样本中大肠杆菌、沙门氏菌含量，包括如下步骤：

1、在加样区加入12mL尿液样本后，驱动样本流过第一过滤区和第二过滤区，之后流入废液区，进样流程见图15；

2、用800μL LB培养基清洗芯片内部管路，去除其它非细菌杂质；清洗流程见图16

3、用800μL LB培养基通过二次清洗把细菌从精滤膜上洗脱下来，并流入信号检测区，洗脱流程见图17。

4、在信号检测区加入40μL K1F噬菌体(导入Lux基因)缓冲液、50μL Felix O1(导入NanoLuc基因)噬菌体缓冲液和1500μL反应液进行反应，反应液为1200μL LB培养基中加入150μL癸醛、150μL Furimazine混匀而成，15min后通过酶标仪读取荧光强度，实现对样本中大肠杆菌、沙门氏菌的定量检测，反应流程见图18。

实施例7：采用实施例3的微流控芯片进行检测

1、在加样区加入10～15mL尿液样本后，驱动样本流过第一过滤区和第二过滤区，之后流入废液区，进样流程见图19；

2、用清洗液自实施例3的加样区加入清洗液3～5mL清洗芯片内部管路，尽可能多的在第二滤膜上富集尿液中的细菌，同时应减少液体在管路中的残留；清洗流程见图20；

3、用储存在第一试剂区的缓冲液把细菌从精滤膜上洗脱下来，并流入信号检测区，常温孵育15min，流程见图21。

4、将储存在第二试剂区和第三试剂区的清洗液和发光底物混合成大于67uL发光反应液(其中清洗液65.3uL、发光底物1.7uL)加入检测区，使其与待检区的样本混匀后检测化学发光信号，反应流程见图22。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。