一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法
阅读说明：本技术 一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法 (Method for preparing xylo-oligosaccharide by coupling acid hydrolysis and enzyme hydrolysis ) 是由 周鑫 徐勇 荆宇 许超众 埃卡拉姆·哈克 阿里·纳瓦兹 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种一种耦合高温有机酸预处理与酶法制备低聚木糖的方法；其中,一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法,其包括,将木聚糖原料和酸混合,高温加热搅拌,降温后调节pH；加入内切型糖酶,混合后中温加热搅拌,反应结束立即进行灭酶；分离,得到低聚木糖液；所述高温加热搅拌,其搅拌速率为50～120r/min,温度为130～180℃,时间为5～30min。本发明采用耦合酸水解与酶水解两步法制备低聚木糖,可直接以富含木聚糖的木质纤维为原料直接生产低聚木糖,简化了生产过程工艺；并且低聚木糖得率高且副产品木糖少。(The invention provides a method for preparing xylo-oligosaccharide by coupling high-temperature organic acid pretreatment and an enzymatic method; the method for preparing the xylo-oligosaccharide by coupling acid hydrolysis and enzyme hydrolysis comprises the steps of mixing a xylan raw material with acid, heating and stirring at high temperature, cooling and adjusting the pH value; adding endo-carbohydrase, mixing, heating at medium temperature, stirring, and immediately inactivating enzyme after reaction; separating to obtain xylo-oligosaccharide solution; the high-temperature heating and stirring are carried out, wherein the stirring speed is 50-120 r/min, the temperature is 130-180 ℃, and the time is 5-30 min. The invention adopts a two-step method of coupling acid hydrolysis and enzyme hydrolysis to prepare the xylo-oligosaccharide, can directly produce the xylo-oligosaccharide by taking the wood fiber rich in xylan as the raw material, and simplifies the production process; and the yield of xylo-oligosaccharide is high and the byproduct xylose is less.)
技术领域
本发明属于低聚木糖制备技术领域，具体涉及一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法。
背景技术
低聚木糖作为功能性食品或饲料添加剂，其具有不能被消化系统吸收(低热量)的特性，但对肠道内的双歧杆菌有高度的选择性增殖作用，能够间接的激活多种免疫细胞活性；受生态大健康、食品安全与无抗动物养殖等产业高速发展的驱动下，源于农林生物质资源的低聚木糖产品作为一种“最强双歧因子/超强益生元”可以极其显著地推动包括秸秆在内的农林废弃物的资源化、高值化与高端化加工利用产业体系的发展，进而推动我国“乡村振兴”战略的实施。而当下低聚木糖生产主要采用内切型木聚糖酶制剂催化水解碱提取的木聚糖，低聚木糖纯度高但该方法涉及的碱提取处理工艺复杂废水污染严重；另可采用酸水解法制备低聚木糖，但主要面临副产品木糖、产品品质不高的问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种耦合高温有机酸预处理与酶法制备低聚木糖的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法，其包括，将木聚糖原料和酸混合，高温加热搅拌，降温后调节pH；加入内切型糖酶，混合后中温加热搅拌，反应结束立即进行灭酶；分离，得到低聚木糖液。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述高温加热搅拌，其搅拌速率为50～120r/min，温度为130～180℃，时间为5～30min。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述中温加热搅拌，其搅拌速率为50～120r/min，温度为50～70℃，时间为3～12h。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述灭酶，其为加热酶解后混合物料至90～100℃，灭酶时间为10～30min。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述酸包括硫酸、草酸、马来酸、糠酸、木糖酸、葡萄糖酸醋酸中的一种或几种；所述木聚糖原料为含有木聚糖组分的木质纤维原料，优选为玉米芯，甘蔗渣、桦木中的一种或几种。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：按质量份数计，所述木聚糖原料为1份，所述稀酸溶液为3.5～10份；所述稀酸溶液中的酸浓度质量分数为0.1％-5.0％，所述内切型糖酶包括内切木聚糖酶，按质量份数计，相对于1份木聚糖原料，所述内切型糖酶为0.0005～0.005份。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述降温为降至室温，所述调节pH，为调节至4.0～6.0，使用的pH调节剂为碳酸钙、氢氧化钙和/或氢氧化钠中的一种或几种。
作为本发明所述的一种耦合酸水解与酶水解制备低聚木糖的方法的优选方案，其中：所述加热搅拌反应均在同一加热反应水解罐内完成；所述分离的方法为微滤或挤压过滤。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种低聚木糖：所述低聚木糖中包括木二糖(X2)、木三糖(X3)中的一种或几种；其中，所述木二糖(X2)和木三糖(X3)的得率分别为20～50％和10～30％。
作为本发明所述的一种制备低聚木糖的优选方案，其中：所述木二糖(X2)和所述木三糖(X3)的得率分别为30％～50％和15％～30％。
本发明的有益效果：
本发明采用耦合酸水解与酶水解两步法制备低聚木糖，可直接以富含木聚糖的木质纤维为原料直接生产低聚木糖，简化了生产过程工艺；并且低聚木糖得率高且副产品木糖少。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1中的生产工艺流程图。
图2为实施例1中两步水解得到的物料液的高效阴离子交换色谱分析图谱。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和2.5％(质量分数)的木糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温15min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入氢氧化钠调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应6h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。其分析图谱如图2所示，木糖(Xylose)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)、木六糖(X6)、木七糖(X7)、木八糖(X8)、木九糖(X9)及聚合度≥10(X10)的低聚木糖组分同时检测。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为40.1％和21.2％，总低聚木糖得率为61.3％；此外木糖得率8.2％。
此外，以100mmol/L氢氧化钠(NaOH)与500mmol/L的醋酸钠(NaAc)为流动相进行二元梯度淋洗的具体操作见下表：
Time(min)
100mmol/L NaOH(％)
500mmol/L NaAc(％)
0
100
0
9
100
0
26
92
8
26
50
50
40
50
50
40
100
0
50
100
0
实施例2：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温30min；反应结束后待反应体罐降至室温后将反应后的固液混合物装入真空洗浆机中，通过挤压过滤以分离未被水解的固形物与木聚糖酸水解液。所获得的木聚糖水解液样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积10μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。主要成分为木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，其得率分别为15.4％、13.2％、10.2％、7.6％、5.4％和3.3％，总低聚木糖得率为55.1％；此外木糖得率31.7％。
实施例3：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和0.25g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至60℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；反应结束后待反应体罐降至室温后将反应后的固液混合物装入真空洗浆机中，通过挤压过滤以分离未被水解的固形物与木聚糖酶水解液。所获得的木聚糖水解液样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积10μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。主要成分为木二糖和木三糖，其得率分别为11.1％和6.8％，总低聚木糖得率为17.9％；此外木糖得率4.6％。
实施例4：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g甘蔗渣粉和2.0％(质量分数)的马来酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温10min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入碳酸钙调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应6h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为39.3％和18.6％，总低聚木糖得率为57.9％；此外木糖得率9.6％。
实施例5：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g甘蔗渣粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温30min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入碳酸钙调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应6h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为28.2％和13.6％，总低聚木糖得率为41.8％；此外木糖得率39.6％。
实施例6：
为了更利于工业化生产，在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g甘蔗渣粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至160℃保温25min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入碳酸钙调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应6h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为39.1％和21.1％，总低聚木糖得率为60.2％；此外木糖得率12.6％。
实施例7：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g桦木粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温10min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入强氧化钠调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.2g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为30.1％和12.6％，总低聚木糖得率为42.7％；此外木糖得率25.1％。
实施例8：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和4.0％(质量分数)的醋酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温12min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入强氧化钠调节pH至4.5；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(80r/min)，维持60℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为38.1％和17.0％，总低聚木糖得率为55.1％；此外木糖得率12.1％。
实施例9：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至200℃保温10min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入强氧化钠调节pH至4.5；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为20.5％和12.3％，总低聚木糖得率为32.8％；此外木糖得率43.0％。
实施例10：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至120℃保温30min；反应结束后待反应体罐降至60℃后加入强氧化钠调节pH至4.5；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持60℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为20.1％和9.3％，总低聚木糖得率为29.4％；此外木糖得率6.3％。
实施例11：
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和5.0％(质量分数)的葡萄糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60r/min)，并加热至170℃保温15min；反应结束后待反应体罐降至30℃后加入强氧化钠调节pH至4.5；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60r/min)，维持30℃保温反应24h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为23.6％和14.1％，总低聚木糖得率为37.7％；此外木糖得率9.3％。
实施例12:
在1L机械搅拌式不锈钢高压反应罐中，加入50g玉米芯粉和2.5％(质量分数)的木糖酸溶液500mL，密封后开启搅拌(60rpm)，并加热至170℃保温15min；反应结束后待反应体罐降至室温后加入氢氧化钠调节pH至5.0；pH调节完成后加入0.05g内切型木聚糖酶，密封后开启搅拌(60rpm)，并加热至60℃保温反应6h；酶解反应结束后调节温度至95℃灭酶15min；通过挤压过滤以分离固形物与木聚糖水解液，得到液体为粗低聚木糖液。酸水解及酶水解样品采用高效阴离子交换色谱分析其糖组分，色谱条件：美国赛默飞ICS-5000型离子色谱，配置CarboPacTM PA200(3mm×250mm)色谱柱，PAD积分安培检测器，柱温30℃，进样体积20μL；以100mmol/L氢氧化钠与500mmol/L的醋酸钠为流动相进行二元梯度淋洗，流速0.3mL/min。其分析图谱如图2所示，木糖(Xylose)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)、木六糖(X6)、木七糖(X7)、木八糖(X8)、木九糖(X9)及聚合度≥10(X10)的低聚木糖组分同时检测。最终酶水解低聚木糖主要组成为木二糖至木三糖，得率分别为42.1％和26.2％，总低聚木糖得率为68.3％；此外木糖得率8.2％。
本发明利用高温酸水解和酶水解两步法直接以富含木聚糖组分的木质纤维为原料，生产粗低聚木糖液；此法具有技术普遍性可用于多种木质纤维原料(秸秆、玉米芯，甘蔗渣，桦木等)；本发明中稀酸浓度用量，时间以及温度需严格控制，使得木聚糖溶出的同时避免过度降解为木糖；实施方案以高温、低酸浓、短时间为最优；在稀酸作用下木质纤维原料中的木聚糖大量溶出给木聚糖酶水解反应提供了条件。采用两步水解法生产低聚木糖方法工艺更简单，低聚木糖得率更高，十分利于工业化生产。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。