一类抑制肠道炎症反应的活性化合物

文档序号：127049 发布日期：2021-10-22 浏览：46次 >En<

阅读说明：本技术 一类抑制肠道炎症反应的活性化合物 (Active compound for inhibiting intestinal inflammatory reaction ) 是由蒋华良沈晓燕郑明月侯辉鲍维廉刘小红张素林杨瑞瑞于 2020-04-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制肠道炎症反应的活性化合物,结构如式I所示,式中,各取代基的定义如说明书和权利要求书中所述。本发明的化合物可以促进肠黏膜修复和屏障稳态的维护,从而抑制过度激活的肠道炎症反应和免疫应答,明显减轻IBD小鼠结肠炎症,从而用于炎症性肠道疾病的治疗。(The invention discloses an active compound for inhibiting intestinal inflammatory reaction, which has a structure shown in a formula I, wherein the definition of each substituent group is described in the specification and the claims. The compound of the invention can promote intestinal mucosa repair and barrier homeostasis maintenance, thereby inhibiting over-activated intestinal inflammatory reaction and immune response, and obviously reducing colon inflammation of IBD mice, thereby being used for treating inflammatory intestinal diseases.)

一类抑制肠道炎症反应的活性化合物

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一类抑制肠道炎症反应的活性化合物、其制备方法及其应用。

背景技术

炎症性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，以消化道反复发作的炎症为特征。近几年来，全球发病率呈现大幅上升。IBD的发病机制至今尚未清楚，研究表明与遗传、免疫、感染和精神活动等因素相关。疾病的反复发作可引起DNA损伤和黏膜细胞的微卫星不稳定，进而导致结肠癌的发生。已有研究证实，IBD患者发生结肠癌的风险显著高于正常人群。免疫抑制剂和抗细胞因子的应用改善了IBD患者的复发率，然而至今仍缺乏能够治愈IBD的药物。因此，寻找在IBD发病机制和/或病情进展中的关键分子，并在此基础上开发治疗IBD的新方法具有重要意义。

在生理情况下，肠上皮细胞及其分泌形成的黏液层，结合各种特定和非特定的保护机制，共同建立了一个有效的肠黏膜屏障，在肠道内稳态维护中至关重要，提供了机体防御的第一道防线。然而，黏蛋白分泌障碍、上皮完整性受损、以及病原微生物的免疫反应故障，可以单独或共同导致炎症性肠病的发生。在涉及IBD发病机制的炎性细胞因子中，IL-12家族成员，尤其是IL-23受到广泛的重视，被认为是实验性肠炎模型和人类IBD发病中的核心因素。IL-23能激活CD4⁺记忆细胞、CD8⁺细胞、NK细胞和少数单核巨噬细胞/树突状细胞。通过与IL-23受体(IL-23R)相结合，诱导IL-10、IL-17和INF-γ等的分泌，从而促进炎症的发展。最近人类遗传学研究确定IL-23R变异与小肠(回肠CD)和大肠(UC)的炎症反应相关。研究发现，IL-23能维持和扩大Th17细胞功能，加剧肠道炎症性反应。敲除小鼠IL-23的P19基因可明显缓解小鼠T细胞依赖性结肠炎的病情。因此，IL-23被认为是治疗IBD极具前景的新靶标。

近年来，生物疗法(如抗-TNF治疗)的出现极大地改善IBD的治疗。然而，仍有大量患者存在难治性溃疡或难以治愈的上皮异构，使得这些患者难以达到“黏膜愈合”。黏膜愈合表明IBD患者肠上皮结构和功能恢复，同时也揭示长期缓解或手术低风险预后。目前，恢复肠上皮结构和功能的重要性在IBD治疗中已经被确认；黏膜愈合作为治疗的标准目标在临床医生和研究人员中也已达成共识。然而，目前尚缺乏合适的治疗手段。研究发现位于肠隐窝底部的肠干细胞在维持肠上皮细胞自我更新、结构和物理屏障功能方面至关重要。动物实验表明移植肠道干细胞可显著改善DSS诱导的IBD小鼠模型的黏膜损伤，提示增强肠道干细胞活性具有修复IBD难治性溃疡的潜力，从而改善IBD患者的预后。

因此，寻找在IBD发病机制和/或病情进展中的关键分子，并在此基础上开发治疗IBD的新方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制肠道炎症反应的活性化合物。

本发明的第一方面，提供一种通式(I)所示的化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐，

式中，

X为CH、O或N；

Y为CH、O或N；

m为0或1；

R₁、R₂各自独立地为H、-NHCOO(C1-C4烷基)、-NHCONH(C1-C4烷基)、-NHCO(C1-C4烷基)、-COO(C1-C4烷基)、-NHCON(C1-C4烷基)(C1-C4烷基)、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、CN、卤素、C6-C10芳基、C1-C4烷氧基、羟基或羧基；或者R₁、R₂与相连的碳共同形成取代或未取代的5-6元杂环基；取代是指被选自下组的一个或多个取代基取代：氧代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-NHCOO(C1-C4烷基)、CN、卤素、C1-C4烷氧基、羟基、羧基；

W₁为-SO₂NH-、-CONH-、-SO₂-、-NH-或-4～6元杂芳基-NH-；

W₂为不存在、C₁-C₄亚烷基或-NH-；

表示双键或单键，为单键时，R₃为H、卤素、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；为双键时，R₃为O；

W₃为不存在、C₁-C₄亚烷基、苯基、苯基(C1-C4亚烷基)、C3-C6环烷基或3-6元杂环烷基；

R₄为H、-OH、C1-C4烷基、-O(C1-C4烷基)、-NH(C3-C6环烷基)、-NH(C1-C4烷基)、-NHSO₂(C1-C4烷基)或-NH(3-6元杂环烷基)；

n为0或1。

在另一优选例中，所述杂环基包含饱和或部分不饱和环状烃基，杂芳基也包含在内。

在另一优选例中，所述化合物具有下式II所示的结构：

R₁、R₂、R₃、R₄、W₁、W₂、W₃、n的定义如前所述。

在另一优选例中，所述化合物具有下式III所示的结构：

R₁、R₂、R₃、R₄、W₁、W₂、W₃的定义如前所述。

在另一优选例中，R₁、R₂各自独立地为CN、卤素、-NHCOO(C1-C4烷基)、-NHCONH(C1-C4烷基)、-NHCO(C1-C4烷基)、-COO(C1-C4烷基)、-NHCON(C1-C4烷基)(C1-C4烷基)、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C6-C10芳基、C1-C4烷氧基、羟基、羧基或氢。

在另一优选例中，W₁为-SO₂NH-、-CONH-、-SO₂-、-NH-或-4～6元杂芳基-NH-；

W₂为C₁-C₄亚烷基或-NH-；

W₃为不存在、C₁-C₄亚烷基、苯基、苯基(C1-C4亚烷基)、C3-C6环烷基或3-6元杂环烷基。

在另一优选例中，R₃为H、卤素、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基。

在另一优选例中，R₄为-OH、-O(C1-C4烷基)、-NH(C3-C6环烷基)、-NH(C1-C4烷基)或-NHSO₂(C1-C4烷基)。

在另一优选例中，所述化合物具有下式IV，

其中，

X’、Y’各自独立地为碳、氮或氧；

R₁’选自-Z-T，其中，Z选自-NHC(＝O)-、-OC(＝O)-、-NHS(＝O)-、-OS(＝O)-、-NHSO₂-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-S(＝O)NH-、-S(＝O)O-、-SO₂NH-、-HNC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-、-NHS(＝O)NH-、-OS(＝O)NH-、-NHSO₂NH-、-NHC(＝O)O-、-NHS(＝O)O-、-NHC(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-NHS(＝O)O-、-OS(＝O)O-、-NHSO₂O-、-OC(＝O)NH-、-OS(＝O)NH-、-OSO₂NH-；T选自氢、C₂-C₄烷基、C₃-C₈环烷基或被E取代的C₁-C₄烷基、C₃-C₈环烷基，苯基或被E取代的苯基、萘基或被E取代的萘基、四氢萘基或被E取代的四氢萘基、稠合杂环或被E取代的稠合杂环、吡啶基或被E取代的吡啶基、嘧啶基或被E取代的嘧啶基、或含1个或2个N原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含1个或2个S原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含1个或2个O原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含1个N原子和1个S原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含1个N原子和1个O原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含2个N原子和1个S原子的被E取代的五元或六元杂芳基、含1个N原子和1个O原子的被E取代的五元或六元杂芳基；或

R₁’，R₂’独立选自氢、卤素、羟基、氨基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷氨基、羟甲基、C₁-C₄卤代烷基；

W’选自-C(＝O)O-、-C(＝O)NHL₁-、-S(＝O)O-、-S(＝O)NL₁-、-(O＝)S(＝O)O-、-(O＝)S(＝O)NL₁-；

R₃’选自氢、卤素、羟基、氨基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷氨基、羟甲基、C₁-C₄卤代烷基；

n’选自0-5之间的整数；

R₄’选自-COOL₁、-CONL₁L₂、-S(＝O)OL₁-、-S(＝O)NL₁L₂-、-(O＝)S(＝O)OL₁-、-(O＝)S(＝O)NL₁L₂-；

L₁、L₂独立选自氢、C₁-C₄烷基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、C₆-C₁₀芳基及4-8元杂芳基；

E选自卤素、硝基、氰基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆卤代烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷氧基、C₁-C₆烷氨基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆卤代烯基、C₃-C₆环烯基、C₂-C₆炔基、C₂-C₆卤代炔基、C₃-C₆环炔基、苯基、或3-8元杂环(其中苯基和杂环可以被卤素、硝基、氰基、烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、烷氧基、烷氨基取代)中的一个或多个。

在另一优选例中，所述化合物为：

本发明的第二方面，提供一种药物组合物，包含：

第一方面所述的通式(I)所示的化合物，或其对映异构体、非对映异构体、外消旋体及其混合物，或其药学上可接受的盐；和

药学上可接受的载体。

本发明的第三方面，提供第一方面所述的通式(I)所示的化合物或第二方面所述的药物组合物用途，用于制备治疗炎症性肠道疾病的药物。

本发明还提供一种治疗炎症性肠道疾病的方法，向有此需要的对象施用第一方面所述的通式(I)所示的化合物或第二方面所述的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1示出化合物A1对小鼠结肠炎模型的治疗作用结果图。

图2示出化合物A1对小鼠来源的肠类器官的生长的促进作用结果图。

图3示出化合物A1对慢性自发性IL-10敲除小鼠IBD模型的治疗作用结果图。

具体实施方式

本发明的发明人经过广泛而深入的研究，通过虚拟筛选与实验验证相结合的方式，发现了一类通式为I的化合物。该类化合物可以促进肠黏膜修复和屏障稳态的维护，从而抑制过度激活的肠道炎症反应和免疫应答，明显减轻IBD小鼠结肠炎症，从而可能用于炎症性肠道疾病的治疗，在此基础上完成了本发明。

术语

本发明中，卤素是氟、氯、溴或碘；

所述烷基、烯基、炔基为直链或支链烷基；烷基本身或作为其它取代基的部分选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基及其异构体；其异构体选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基或叔戊基；

上述所述的卤代烷基选自包含一个或多个相同或不同的卤素原子，所述的卤代烷基选自-CH₂Cl、-CHCl₂、-CCl₃、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CH₂Br、-CHBr₂、-CBr₃、-CH₂I、-CHI₂、-CI₃、CF₃CH₂、CCl₃CH₂、CBr₃CH₂、CI₃CH₂、。

所述的环烷基本身或者作为其它取代基的部分选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基；

所述的烯基本身或作为其它取代基的部分选自乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、丁烯-1-基、丁烯-3-基、戊烯-1-基、戊烯-3-基、己烯-1-基或4-甲基-3-戊烯基；

所述的炔基本身或作为其它取代基的部分选自乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、1-甲基-2-丁炔基、己炔-1-基或1-乙基-2-丁烯基；

所述的芳基选自单环芳烃或多环芳烃，其中，多环芳烃包括多苯代脂烃、联苯型多环芳烃和稠环芳烃；

所述的杂芳基选自被取代的呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、三嗪基、吲哚基、吲唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁唑基、异构化的喹啉基、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基或萘啶基。

本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的代谢产物，以及可以在体内转变为本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药，也包含在本申请的权利要求中。

本发明提供上述化合物的合成方法，具体实例如下：

例如本发明中所示化合物IV可按此路线制备，本发明目标产物的合成，具体步骤如下：将商业可得或制备的酰氯、磺酰氯或亚磺酰氯化合物1与氨基酸类化合物2反应得目标产物3，化合物3再与胺类、醇类或碘化物反应制得通式IV的化合物4。

所述通式I化合物的药学上可接受的盐可由一般的化学方法合成：

一般情况下，盐的制备可通过游离碱或酸与化学等量或过量的酸(无机酸或有机酸)或碱(无机碱或有机碱)，在合适的溶剂或溶剂组合物中反应制得。

为进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实例完全是例证性的，仅以此对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1

化合物A₁及A₂的合成：

第一步：将1.2g化合物a₂加入瓶中，在搅拌中缓慢加入500mg化合物a₁，加热至50℃反应2h。反应完毕后，在剧烈搅拌下将反应混合物倒入冰水中，保持体系温度小于20℃。滤出沉淀，用冷水洗沉淀至滤液为中性。将固体于60℃真空干燥过夜，得425mg化合物a₂，产率52％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.99(d,J＝8.8Hz,2H),7.64(d,J＝8.8Hz,2H),7.00(s,1H),3.84(s,3H)。

将5.0g化合物a₄溶于150mLCH₃CH₂OH中，加入500mg钯碳后，通H₂反应24h。反应完毕后，使用硅藻土过滤，将滤液旋干得4.5g化合物a₅。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ3.52(m,1H),3.38(m,1H),2.55(m,2H),2.41(m,1H),2.13(m,1H),1.90(m,1H)。接着，用140mLH₂O将9.0mL浓HCl稀释后，加入装有4.5g化合物a₅的瓶中，回流反应过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，用DCM洗水相3次，将水旋干得4.5g化合物a₆，两步产率72％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ8.31(s,2H),3.02(m,2H),2.82(m,1H),2.40(m,2H),1.80(m,2H)。

第二步：将371mg化合物a₆溶于10mL THF中搅拌，加入2.0mL NaOH(2M)水溶液。将体系温度降至0℃后，加入500mL化合物a₂，保持0℃反应30min。反应完毕后，加水淬灭反应，用DCM洗3次水相后，缓慢滴加2M HCl水溶液调水相pH＝3-4。加DCM萃取3次，加无水硫酸钠干燥，旋干得480mg化合物A₁，产率60％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.23(s,1H),10.13(s,1H),7.75(t,J＝6.5Hz,1H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),7.64(d,J＝8.8Hz,2H),3.70(s,3H),2.86(m,2H),2.44(m,1H),2.32(m,2H),1.75(m,2H)；¹³CNMR(125MHz,DMSO-d6):δ173.59,153.82,142.99,133.00,127.80,117.76,51.98,41.56,30.32,20.55；LRMS(ESI):421.0(M+Na)⁺,396.7(M-H)^-；HRMS(ESI):calcd for C14H16F3N2O6S(M-H)-:397.0687,found:397.0683。

第三步：将100mg化合物A₁溶于5mL CH₃OH中，温度降至0℃。在搅拌中缓慢向反应瓶中滴加35μLSOCl₂，滴加完毕后，将体系温度升至室温反应过夜。反应完毕后，旋去CH₃OH和SOCl₂后用Et₂O洗剩余固体，并于60℃真空干燥过夜，得95mg化合物A₂，产率92％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ7.80(d,J＝8.8Hz,2H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),6.90(s,1H),4.91(t,J＝6.4Hz,1H),3.82(s,3H),3.69(s,3H),3.20(m,1H),3.05(m,1H),2.46(t,J＝7.2Hz,2H),2.38(m,1H),1.90(m,2H)。

A3-A41的合成方法参照上述化合物A1的合成路线。

化合物A42的合成：

将135mg化合物a₇溶于8mL吡啶中，加入化合物a₆后加热至60℃反应3h。反应完毕后，减压浓度，向浓缩液中加入DCM稀释，用稀HCl水溶液洗有机相3次，加无水硫酸钠干燥后浓缩，得135mg化合物A₄₂，产率60％。

化合物A₄₃-A₄₅的合成方法参考A₄₂的合成路线。

实施例2

动物与细胞实验

一、实验材料

细胞及动物

HCT116细胞和Raw264.7细胞由中国科学院院细胞库提供；肠道类器官来源于Lgr5-EGFP小鼠分离的肠隐窝培养；Lgr5-EGFP小鼠由复旦放射医学研究所华国强课题组赠予，遗传背景为C57/BL6，小鼠饲养于复旦大学药学院实验动物中心二楼SPF级动物房。

主要仪器和器材

主要试剂及抗体

二、实验方法

A.细胞实验

化合物活性筛选：

1.IL-23mRNA的检测：

用DMSO将所有化合物配成浓度为50mM的贮存液，置于-20度冰箱保存。将Raw264.7细胞接种于12孔板，24小时后细胞密度约为70-80％，加入不同稀释比例的化合物，于加药1h后每孔加入20μl(即0.5μg/ml)的脂多糖(LPS)，轻摇培养板混匀。空白组不加。6小时后弃去培养基，冰冷PBS缓冲液洗3遍，加入1ml Trizol，静置10min，收集裂解液，离心取得上清，加入1/5体积三氯甲烷振摇1min，静置3min，4℃离心12000g。取上清，加入等体积异丙醇混匀，静置10min，离心12000xg，10min。去上清，沉淀用70％乙醇洗涤，7500g离心5min，干燥沉淀，加入20μL DEPC水。检测样品RNA浓度，并调至100～1000ng/μL，使用翊圣生物的逆转录试剂盒以及SYBR-qPCR试剂盒检测IL-23mRNA水平的变化。

(1)逆转录合成cDNA

根据逆转录试剂盒的操作说明进行，在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。逆转录反应程序如下:阶段1:25℃,5min；阶段2:42℃,30min；阶段3:85℃,5min；阶段4:4℃,保持，产物-20℃保存，或直接用于RT-qPCR。

(2)RT-PCR扩增

Real-Time PCR涉及到的引物用primer premier 5.0软件设计，引物序列如下：

采用两步法进行程序反应，具体程序如下：

Stage1:95℃，5min

Stage2:95℃，5s

60℃，30s

采用方法来分析数据，计算的数值即为实验组的目的基因表达相对于对照组的倍数。

2.CyclinD1 mRNA的检测：

结直肠癌HCT 116细胞株进行化合物筛选，所用培养基为含10％FBS的McCOY's 5A培养基。接种细胞于12孔板中，使第二天贴壁细胞的密度为70％～80％。取1μL储存液(50mM)于1ml培养基中，配制成50μM的含药培养基(对照组为0.1％DMSO培养基)。弃去原培养基，加入含药培养基，37℃培养6h。弃去培养基，冰冷PBS缓冲液洗3遍，加入1ml Trizol，静置10min，收集裂解液，离心取得上清，加入1/5体积三氯甲烷振摇1min，静置3min，4℃离心12000xg。取上清，加入等体积异丙醇混匀，静置10min，离心12000xg，10min。去上清，沉淀用70％乙醇洗涤，7500xg离心5min，干燥沉淀，加入20μL DEPC水。检测样品RNA浓度，并调至100～1000ng/μL，使用翊圣生物的逆转录试剂盒以及SYBR-qPCR试剂盒检测cyclinD1的mRNA水平的变化。

(1)逆转录合成cDNA

(2)RT-PCR扩增

Real-Time PCR涉及到的引物用primer premier 5.0软件设计，引物序列如下：

用Bio-Rad的CFX100荧光定量PCR仪器对cDNA的目的片段进行扩增，程序如下:

收集仪器数据，采用方法来分析数据，计算的数值即为实验组的目的基因表达相对于对照组的倍数。

B.动物实验

动物饲养繁殖与基因鉴定

Lgr5-EGFP小鼠的繁殖

小鼠基因型鉴定

Lgr5-EGFP小鼠基因型鉴定

基因鉴定序列

引物	序列	SEQ ID NO.:
			8060	5’-CTGCTCTCTGCTCCCAGTCT-3’	9
8061	5’-ATACCCCATCCCTTTTGAGC-3’	10
			olMR9402	5’-GAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3’	11

按如下反应体系进行PCR:

反应程序按说明进行设置。

反应程序如下：

1.小鼠急性IBD模型和慢性自发性IL-10敲除IBD模型的建立及化合物A1体内药效实验

实验分组设为对照组、模型组、美沙拉嗪给药组，A1-1mg/kg给药组和化合物A1-2mg/kg给药组，共五组，每组10只8周龄雄性C57/BL6小鼠，除对照组都给以2.5％硫酸葡聚糖钠盐(DSS)水自由饮用，隔天重新配制并更换，持续7天。化合物A₁用DMSO溶解配成母液，再分别溶于超纯水，配制成终浓度分别0.1mg/ml和0.2mg/ml的4％DMSO水溶液，美沙拉嗪采用0.5％CMC-Na配制成5mg/ml的混悬液，在造模同时开始灌胃，采取灌胃剂量为10ml/kg(对应给药剂量1mg/kg、2mg/kg和50mg/kg)，持续10天。每天记录小鼠体重变化，10天后对小鼠处死进行取样。

IL-10^-/-小鼠(美国Jackson实验室，C57BL/6背景)。取8周龄小鼠，分为对照组(WT)，模型组(IL-10KO)，美沙拉嗪组(IL-10KO+美沙拉嗪50mg/kg)，化合物A1低剂量组(IL-10KO+化合物A10.5mg/kg)，化合物A1中剂量组(IL-10KO+化合物A1 1mg/kg)，化合物A1高剂量组(IL-10KO+化合物A1 2mg/kg)，每组小鼠各6只，灌胃给药12周。

2.血清炎症因子的测定

上述给药10天后，对小鼠采取摘眼球取血，收集全血后，让血液在室温下不受干扰地凝固15-30分钟。通过在离心机中以1,000×g 4℃离心10min获得血清。对血清样品采用达科为公司的IL-1β和IL-23ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-23的血清水平。

3.小鼠结肠长度测量

上述眼球取血后，处死小鼠，取整段结肠进行拍照和长度测量。

4.小鼠体内肠道通透性检测

使用异硫氰酸荧光素(FITC-dextran)检测肠道通透性。用FITC-dextran(0.6mg/g小鼠体重，浓度为125mg/mL)灌胃，4小时后，眼球取血，利用多功能酶标仪(其中激发波长设定在490nm，发射波长设定在525nm)测定吸光度并计算血清中FITC-dextran含量。

5.检测结肠组织的相关蛋白mRNA水平

对结肠组织使用PBS反复冲洗，刮去粘液，分离小鼠的结肠粘膜和固有层，分别加入Trizol进行组织匀浆，静置10min离心取得上清，加入1/5体积三氯甲烷振摇1min，静置3min，4℃离心12000xg。取上清，加入等体积异丙醇混匀，静置10min，离心12000xg，10min。去上清，沉淀用70％乙醇洗涤，7500xg离心5min，干燥沉淀，加入适量DEPC水。检测样品RNA浓度，并调至100～1000ng/μL，使用翊圣生物的逆转录试剂盒以及SYBR-qPCR试剂盒检测相应炎症因子和干细胞标记蛋白的mRNA水平。

6.RT-qPCR

根据逆转录试剂盒的操作说明，进行如下操作：

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。

逆转录反应体系配制(20μL体系)

逆转录反应程序如下

得到cDNA按照下述表格，配制工作液体系：

qPCR引物如下表

用Bio-Rad的CFX100荧光定量PCR仪器对cDNA的目的片段进行扩增，程序如下

收集仪器数据，采用2-ΔΔCt方法来分析数据，计算2-ΔΔCt的数值即为实验组的目的基因表达相对于对照组的倍数。

7.Lgr-EGFP体内实验

在Lgr5-EGFP转基因小鼠上重复体内药效学实验，收集结肠组织(N＝5)。

8.组织标本制作及染色

取小鼠中段约0.5cm结肠，4℃多聚甲醛固定16h，委托武汉赛维尔生物公司进行石蜡/OCT包埋，切片，石蜡切片进行苏木精-伊红(H&E)/β-catenin抗体/Ki67抗体染色，扫描切片；OCT包埋的冰冻切片直接在激光共聚焦显微镜下488nm处进行观察。

9.结肠类器官的分离和培养

取6到8周大的小鼠全部结肠，从中间剪开，用预冷的PBS洗干净，将小肠分成5-8厘米长的若干段，用载玻片小心的将结肠表面的粘液刮去，将刮好的结肠放入50mL离心管中，置于冰上。将离心管转移至安全柜中，用含双抗的PBS清洗3-4次，将结肠转移至25ml2mM的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化25分钟。将消化好的结肠转移至50ml离心管中，加25ml含双抗的PBS，适当摇晃50下，悬浮液用70um的细胞过滤筛过滤，将结肠转移至新的含25ml含双抗的PBS的离心管中，继续合适摇晃50下，悬浮液用70um的细胞过滤筛过滤，将两次过滤后的悬液转移至同一个50ml离心管中，室温下900rpm离心5分钟。弃上清，用2mL的Advanced-DMEM/F12重悬沉淀，取适量的悬液计数。隐窝的数量为5-10个/μl为最好。取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中，室温下900rpm离心5分钟。用事先在冰上预冷的基质胶重悬沉淀。将96孔板事先在培养箱中预热，然后每个孔接5μl的重悬液。将接种好的板于培养箱中放置10-15分钟。每孔加100μl培养基，然后每隔2-3天换一次培养基。WNER培养基组成为：

10.检测化合物对类器官生长的影响

根据化合物A1的Mw配制50μM的的DMSO溶液，加入类器官培养基，拍照观察形态，第7天吸去培养基，冰上冷却10min融化基质胶，用PBS离心收集类器官。按上述操作提取mRNA检测干细胞相关基因表达。

11.数据分析

使用SPSS 13.0对数据进行分析，两组间的比较采用配对t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05视为检验结果有差异。数据表示为均数±标准差(mean±SD)。GraphPad Prism 7.0软件做柱状图和线图；Photoshop CC2015进行图片合并及文字添加。

三、实验结果

1、细胞实验化合物活性表

抑制率计算公式为：

如上表所示，经筛选发现，对cyclinD1 mRNA上调作用超过1.5的化合物有38个化合物，对IL-23mRNA抑制率超过50％的化合物有12个，而兼具这两个作用的化合物10个，而阳性对照药美沙拉嗪只能抑制IL-23mRNA表达，对cyclinD1 mRNA没有明显的上调作用。

2、动物实验结果

图1示出化合物A1对小鼠结肠炎模型的治疗作用。其A是C57小鼠在葡聚糖硫酸钠(DSS)造模7天及同步口服给药(1mg/kg和2mg/kg的化合物A1以及50mg/kg美沙拉嗪)期间的生存曲线图(N＝10)，结果表明化合物A1高剂量组能显著降低急性IBD小鼠的死亡率。B是小鼠体重的百分比变化(N＝5-8)，结果显示化合物A1能剂量依赖性地改善急性IBD小鼠的体重减轻，且药效优于阳性药美沙拉嗪。C是DSS造模7天同步给药10天后，小鼠结肠的照片以及结肠长度统计(N＝5-8)，结果表明化合物A1可剂量依赖性地显著改善炎症引起的结肠挛缩，且药效优于阳性药美沙拉嗪。D是小鼠血清炎性因子水平ELISA检测，结果表明化合物A1可剂量依赖性地显著降低血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-12/23、IL-6和TNFα的水平，且药效优于阳性药美沙拉嗪。E是对小鼠结肠组织进行分离后，荧光定量PCR检测肠干细胞相关因子及促炎细胞因子mRNA表达检测，结果表明化合物A1可剂量依赖性地显著上调肠干细胞相关因子cyclin D1、Lgr5和Axin2 mRNA表达，同进下调L-1β、IL-23、IL-6和TNFαmRNA的表达，且药效优于阳性药美沙拉嗪。F是小鼠结肠标本LGR5-EGFP免疫荧光照片，显示化合物A1可剂量依赖性地显著促进肠干细胞标志性蛋白LGR5的表达，而阳性药美沙拉嗪对LGR5无明显影响。G是小鼠结肠标本H&E染色结果，显示结果表明化合物A1可剂量依赖性地显著改善隐窝破坏和炎症浸润，且药效优于阳性药美沙拉嗪。H和I分别是结肠标本β-catenin和Ki67免疫组化染色，结果显示合物A1可剂量依赖性地显著增强小鼠结肠上皮细胞的增殖能力(*，#p<0.05；**，##p<0.01；***，###p<0.001)。

图2示出化合物A1对小鼠来源的肠类器官的生长的促进作用。其中A为小鼠结肠隐窝分离并在覆有类器官(WNER)培养基的基质胶(Matrigel)中的生长情况，化合物A1的浓度为50μM，使用Zeiss 710活细胞成像仪拍摄。B为类器官的出芽率，C为类器官表面积，使用Image J软件进行图像分析得到(N＝5)。D为第7天(168h)收集类器官后，提取RNA进行肠道干细胞标记基因检测(N＝5)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。结果显示，化合物A1对小鼠来源的肠类器官的生长有明显的促进作用。

图3示出化合物A1对慢性自发性IL-10敲除小鼠IBD模型的治疗作用。其中A为体重变化；给药12周，化合物A1低、中、高剂量组以及阳性对照美沙拉嗪组小鼠体重与模型组相比均显著上升。B为结肠长度变化；给药12周，化合物A1低、中、高剂量组以及阳性对照美沙拉嗪组小鼠结肠长度与模型组相比均显著上升。C为HE染色结果；和对照组相比，模型组小鼠结肠粘膜有轻微的炎性细胞浸润，轻微的杯状细胞丢失以及少许增生。化合物A1低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组小鼠结肠粘膜中，炎性细胞浸润减少。同时，化合物A1中，高剂量组以及美沙拉嗪组小鼠结肠粘膜中杯状细胞增多，增生减少。D是小鼠肠道通透性检测；化合物A1低、中、高剂量组以及美沙拉嗪组小鼠肠道通透性与模型组相比均显著下降(***p<0.001vs正常组；##p<0.01,###p<0.001vs模型组)。

综上结果显示化合物A1可以剂量依赖地改善DSS诱导的急性IBD和慢性自发性IL-10敲除小鼠IBD模型肠粘膜破坏和炎性浸润，促进小鼠的体重和结肠长度恢复，降低外周血TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的水平和肠道这些炎症细胞因子mRNA表达量，提高cyclin D1、Lgr5和Axin2等干细胞相关基因的mRNA表达量，提高IBD小鼠的结肠干细胞数量和上皮细胞增殖能力。以上数据表明化合物A1对小鼠急慢性IBD的病情有显著的改善作用。

序列表

<110> 中国科学院上海药物研究所

复旦大学

<120> 一类抑制肠道炎症反应的活性化合物

<130> P2020-0591

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA