杀叶螨蛋白bvp8及其应用
阅读说明：本技术 杀叶螨蛋白bvp8及其应用 (Tetranychus-killing protein BVP8 and application thereof ) 是由 刘晓艳 闵勇 陈凌 朱镭 邱一敏 饶犇 周荣华 龚艳 廖先清 陈伟 邱春富 石 于 2021-07-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于农业微生物学技术领域,具体涉及杀叶螨蛋白BVP8及其应用。所述蛋白为SEQ ID NO.2所示。BVP8蛋白对二斑叶螨半致死浓度为12.98μg/mL,对柑橘全爪螨的半致死浓度为33.45μg/mL,对朱砂叶螨的半致死浓度为26.32μg/mL,对二斑叶螨的卵具有抑制孵化及裂解的作用,72 h的卵裂解率为75.86%。该蛋白为新型的杀螨剂制备提供了新的选择性。(The invention belongs to the technical field of agricultural microbiology, and particularly relates to a tetranychidae killing protein BVP8 and application thereof. The protein is shown in SEQ ID NO. 2. The semi-lethal concentration of the BVP8 protein to Tetranychus urticae is 12.98 mug/mL, the semi-lethal concentration to Panonychus citri is 33.45 mug/mL, the semi-lethal concentration to Tetranychus cinnabarinus is 26.32 mug/mL, the incubation and cracking inhibiting effects are achieved on eggs of the Tetranychus urticae, and the egg cracking rate is 75.86% after 72 hours. The protein provides new selectivity for the preparation of novel acaricides.)
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及杀叶螨蛋白BVP8及其应用。
背景技术
叶螨是农业生产中的重要害螨。为害棉花、粮食、果树、林木和观赏植物。棉叶螨(棉红蜘蛛)是中国十大害虫之一。二斑叶螨每分钟可以刺穿18～22个植物细胞。柑橘全爪螨是柑橘树的重要害螨，苹果全爪螨和山楂叶螨是中国北方果树的重要害螨，严重危害时可使果实产量减少1/3～2/3。麦岩螨遍及全国的小麦产区，为害严重时可使小麦颗粒无收。有多种棉花叶螨为害棉田，可造成减产30％以上，甚至使棉株完全枯焦。
温度是影响叶螨种群数量消长的一个重要因素。叶螨活动的温度范围和适宜温度常随种类而不同。高温活动型的种类，如苹果爪螨，适生温度为25～28℃；低温活动型，如果苔螨，为21～24℃。多数叶螨喜好干燥的气候，相对湿度以40～70％为宜。因此，干燥而炎热的天气往往导致叶螨的猖獗。叶螨的繁殖方式主要是两性生殖，也可孤雌生殖。果苔螨等种类仅见雌螨，是产雌孤雌生殖。叶螨属等种类具雌雄二性，不但可进行有性生殖，还可进行产雄孤雌生殖，即未受精的雌螨仅产生雄性后代。
叶螨的防治方法主要分为农业防治、生物防治和化学防治。农业防治包括冬季清园，清理病叶并集中烧毁，降低害螨越冬数量；加强肥水管理，改善果园小气候等。生物防治包括利用天敌、生物杀螨剂等绿色安全的手段加以防控。化学防治主要采用化学杀螨剂等药剂来进行防治。近年来由于杀螨剂品种缺乏替代，造成杀螨剂的大量反复使用，加快了害螨抗性的产生，导致螨害越来越重，给种植户造成了极大的经济损失。
目前国际上对于杀螨剂开发的多数是难溶于水的化学物质或大分子抗生素，对于小分子蛋白类物质报道较少，基于以上背景，有必要开发防治叶螨的蛋白类制剂，用于叶螨生物防治领域，具有重要的生产实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杀叶螨蛋白，所述蛋白为SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的在于提供了杀叶螨蛋白在制备叶螨杀灭剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种杀叶螨蛋白，所述蛋白为SEQ ID NO.2所示；编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因，也属于本发明的保护范围，优选的基因为SEQ ID NO.1所示。
利用本领域的常规方式，例如，原核，真核表达，或是直接合成的上述蛋白，均为本发明的保护范围
杀叶螨蛋白在制备叶螨杀灭剂中的应用，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白为有效成分之一，或者唯一有效成分，制备成叶螨杀灭剂；本发明的杀叶螨蛋白还可用于叶螨卵的孵化抑制剂。
以上所述的应用中，优选的，所述的叶螨为二斑叶螨、柑橘全爪螨或朱砂叶螨。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
本发明首次报道了一种杀叶螨的新蛋白及其杀螨活性，为新型的杀螨剂制备提供了新的选择性。
包含BVP8蛋白的杀螨剂具有高效、低毒、对环境友好的优点。
附图说明
图1为BVP8蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳分析图。
图2为BVP8蛋白对二斑叶螨卵的作用效果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所述试剂或材料，如未特别说明均为本领域的常规方案。
本发明涉及到的BVP8蛋白，可用本领域的常规方式，例如原核表达，商业合成等方式得到。本发明以原核表达BVP8蛋白为例，对其抑螨功能进行说明，其他方式获得的该蛋白也能行使相同的功能。
实施例1：
杀螨BVP8蛋白的获得：
1)按照SEQ ID NO.1所示序列(编码SEQ ID NO.2所示蛋白)，人工合成BVP8蛋白基因片段(生工生物工程(上海)股份有限公司)，并连接在大肠杆菌表达载体pet28a质粒上，构建完成重组表达质粒pet28a-BVP8。
2)杀螨BVP8蛋白基因在大肠杆菌BL21中的表达和纯化
为了大量表达杀螨BVP8蛋白，将上述携带有编码序列的重组表达质粒pet28a-BVP8转化到大肠杆菌BL21中，得到了重组菌BL21/pet28a-BVP8。将该重组菌接种于5mL LB液体培养基中，置于37℃摇床培养至OD600为0.6以后，加入1.0mmol/L的异丙基-B-D硫代半乳糖苷(即IPTG，购自Sigma公司)于30℃诱导培养3h。将上述50mL重组菌BL21/pet28a-BVP8的3h诱导培养物经过12000rpm离心30s收集菌体，利用超声波(技术参数：300W，破碎30s，间歇30s)，将细胞破碎后12000rpm离心15min取上清，然后用0.4μm孔径的滤膜过滤除杂，用GST融合蛋白的亲和层析法纯化各种蛋白质。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，提纯的蛋白与蛋白分子量标准比对，估算分子量为9kDa，与预计的蛋白BVP8分子量大小8.34kDa基本吻合，证明本发明的BVP8蛋白在大肠杆菌BL21中得到了成功的表达。
实施例2：
1)BVP8蛋白在杀灭二斑叶螨(Tetranychus urticae)：
参照FAO(联合国粮农组织)推荐的测定害螨的标准方法-玻片浸渍法。将双面胶带剪成2-3cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每片粘4行，每行粘10头。在温度25℃，相对湿度85％左右的生化培养箱中放置4h后，用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。药剂在预试的基础上用水稀释5-7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜检查结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每一浓度重复3次，另以浸渍清水作为对照。按照上述实验步骤，BVP8蛋白悬液对二斑叶螨的生测结果见下表1所示，为12.98μg/mL。LC50值的计算利用SPASS19.0数据处理软件计算获得。
表1 BVP8蛋白对二斑叶螨的杀螨活性
2)BVP10蛋白杀灭柑橘全爪螨(Panonychus citri)：
参照FAO(联合国粮农组织)推荐的测定害螨的标准方法-玻片浸渍法。将双面胶带剪成2-3cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每片粘4行，每行粘10头。在温度25℃，相对湿度85％左右的生化培养箱中放置4h后，用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。药剂在预试的基础上用水稀释5-7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜检查结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每一浓度重复3次，另以浸渍清水作为对照。按照上述实验步骤，BVP8蛋白悬液对柑橘全爪螨的生测结果见下表2所示，为33.45μg/mL。LC50值的计算利用SPASS19.0数据处理软件计算获得。
表2 BVP8蛋白对柑橘全爪螨的杀螨活性
3)按照上述实验步骤，BVP8蛋白悬液对朱砂叶螨的生测结果见下表3所示，为26.32μg/mL。LC50值的计算利用SPASS 19.0数据处理软件计算获得。
表3 BVP8蛋白对朱砂叶螨的杀螨活性
4)BVP8蛋白对二斑叶螨卵的抑制作用
取二斑叶螨盛卵期叶片，流水下冲走成螨和若螨。吸水纸吸干叶片水分。用粘有双面胶的载玻片轻轻将卵粘下来，显微镜下观察并计数，将计数后的卵浸入待测样品三秒取出。然后放入25度恒温培养箱，并分别24h、48h、72h后显微镜下观察BVP8蛋白对二斑叶螨卵的作用效果，将不同形态的卵计数，拍照。
结果显示，BVP8蛋白对二斑叶螨卵具有抑制作用，能够抑制卵的孵化，24h后卵开始萎缩并逐步裂解，48h和72h卵的裂解率分别是22.41％和75.86％(表4、图2)。
表4 BVP8蛋白对二斑叶螨卵的抑制作用
备注：+，卵饱满，色微黄，待孵化；++，正常卵，部分孵化；+++，卵孵化；++++，卵萎缩，未孵化；+++++，卵裂解。
序列表
<110> 湖北省生物农药工程研究中心
<120> 杀叶螨蛋白BVP8及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgttcggac caattttaaa agcattaaaa gctcttgtat ctaaagtacc gtggggtaag 60
gtcgcatcat tcttaaaatg ggcaggtaac ttagctgctg cagccgctaa atattcatat 120
acaagtggaa agaaaatcct tgcgtatatc caaaaacacc caggaaaaat cgttgattgg 180
ttcctaaaag gatattctgt atacgacgtt attaaaatga ttcttggcta a 231
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Gly Pro Ile Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu Val Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Trp Gly Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Trp Ala Gly Asn Leu Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Lys Tyr Ser Tyr Thr Ser Gly Lys Lys Ile Leu Ala
35 40 45
Tyr Ile Gln Lys His Pro Gly Lys Ile Val Asp Trp Phe Leu Lys Gly
50 55 60
Tyr Ser Val Tyr Asp Val Ile Lys Met Ile Leu Gly
65 70 75