一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物、其制备及应用
阅读说明：本技术 一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物、其制备及应用 (Polyethylene glycol modified cysteamine derivative, preparation and application thereof ) 是由 熊瑜 徐忠瑞 阮健 盛剑勇 甘祥俊 万江陵 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物高分子材料及化学药物技术领域,更具体地,涉及一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物、其制备及应用。该衍生物具有如式(一)所示的通式：式(一)中,R-(1)和R-(2)各自独立地为通过酰胺键与胱氨酸的氨基相连接的C6～C30的单环的或多环的芳香酸或芳香杂环酸；mPEG表示聚乙二醇,所述聚乙二醇单末端采用惰性基团封端,另一端通过连接的X-(1)和X-(2)基团分别与胱氨酸的两个羧基相连接；X-(1)和X-(2)各自独立地为氨基或酰肼。本发明提供的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物作为一种新型Gemini氨基酸表面活性剂,其临界胶束浓度低、安全无毒、无刺激、生物降解性好,可作为水难溶性和脂溶性药物传递系统载体。(The invention belongs to the technical field of medicinal polymer materials and chemical medicines, and particularly relates to a polyethylene glycol modified cysteamine derivative, and preparation and application thereof. The derivative has a general formula shown as a formula (I): in the formula (I), R 1 And R 2 Each independently is a monocyclic or polycyclic aromatic or heteroaromatic acid of C6-C30 linked to the amino group of cystine through an amide bond; mPEG represents polyethylene glycol, wherein one end of the polyethylene glycol is blocked by an inert group, and the other end of the polyethylene glycol is connected with X 1 And X 2 The groups are respectively connected with two carboxyl groups of cystine; x 1 And X 2 Each independently isAmino or hydrazide. The polyethylene glycol modified cysteamine derivative provided by the invention is used as a novel Gemini amino acid surfactant, has low critical micelle concentration, is safe, nontoxic, non-irritant and good in biodegradability, and can be used as a carrier of a water-insoluble and fat-soluble drug delivery system.)
技术领域
本发明属于药物高分子材料及化学药物技术领域，更具体地，涉及一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物、其制备及应用。
背景技术
Gemini表面活性剂分子结构中含有两分子单体表面活性剂，通过化学键作用在离子头基处联结，其结构新颖，性能优异于传统的单体表面活性剂，但价格比较昂贵，目前，还未能大规模工业化生产。
氨基酸类表面活性剂是利用氨基酸或短肽等基团作为亲水基的一类表面活性剂，其不仅具有表面活性剂润湿、洗涤、发泡、增溶、乳化等基本性质，还具有低刺激性、低毒性、良好的表面活性、生物可降解性及环境相容性等优势，因此在食品、医药及化妆品行业得到广泛的关注和应用。
胱氨酸具有两个胺基和羧基，结构类似于二硫键将两个半胱氨酸相连，因此向胱氨酸的两个胺基上引入疏水基团，两个羧基上引入亲水长链即可合成Gemini表面活性剂。文献常见的季铵盐型的胱氨酸基阳离子Gemini表面活性剂和羧酸盐型的胱氨酸基阴离子Gemini表面活性剂研究较热门，而安全无毒、无刺激、生物降解性好的胱氨酸基非离子Gemini表面活性剂非常稀少。
刘兵等公开的氨基酸型Gemini表面活性剂囊泡的制备及其体外性质研究一文中，以L-胱氨酸和不同碳链长度的烷基酰氯合成长链烷基胱氨酸衍生物，该胱氨酸双子表面活性剂与胆固醇、Span80、Tween80按照一定比例，以叶绿素为模型药物，利用薄膜分散超声法制备叶绿素胱氨酸型双子表面活性剂囊泡，得到的四种胱氨酸双子表面活性剂具有较高的表面活性，且其表面活性随着双碳链的延长而有所降低；其合成的四种产物的CMC值为10- 5g/mL，CMC值较高，用于药物递送时药物包封率以及包封稳定性不佳，当其浓度超过临界胶束浓度时溶血作用明显增强，存在较高的溶血风险。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物、其制备及应用，其通过在胱氨酸的两个氨基分别通过酰胺键连接芳香酸或芳香杂环酸，同时胱氨酸的两个羧基分别被聚乙二醇修饰，合成一种Gemini表面活性剂并将其用于药物传递系统载体，旨在解决现有技术基于胱氨酸的Gemini表面活性剂应用于药物传递系统载体安全性低、CMC值较高、药物包封率低、稳定性差等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物(Ar-cys-mPEG)，其具有如式(一)所示的通式：
式(一)中，R1和R2各自独立地为通过酰胺键与胱氨酸的氨基相连接的C6～C30的单环的或多环的芳香酸或芳香杂环酸；
mPEG表示聚乙二醇，所述聚乙二醇单末端采用惰性基团封端，另一端通过连接的X1和X2基团与胱氨酸的两个羧基分别相连接；X1和X2各自独立地为氨基(-NH2)或酰肼(-NH-NH-)。
优选方案中，R1和R2各自独立地为通过酰胺键与胱氨酸的氨基连接的含苯环的氨基酸或含苯环的二肽。
优选方案中，R1和R2各自独立地为通过酰胺键与胱氨酸的氨基连接的苯丙氨酸或酪氨酸。
优选方案中，R1和R2各自独立地为通过酰胺键与胱氨酸的氨基连接的烟酸、肉桂酸、苦杏仁酸或阿魏酸。
优选方案中，所述惰性基团为甲氧基或甲基。
优选方案中，所述聚乙二醇的分子量为500～10000。
优选地，所述聚乙二醇为PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3000、PEG4000、PEG5000、PEG6000、PEG8000。
进一步优选地，所述聚乙二醇为PEG2000、PEG4000、PEG5000。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)芳香酸酰氯或芳香杂环酸酰氯与胱氨酸进行酰胺化反应，得到胱氨酰胺衍生物；
(2)将步骤(1)获得的胱氨酰胺衍生物和末端修饰氨基或酰肼基的聚乙二醇在EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)存在条件下，并在酸性条件下反应得到所述聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物。
优选方案中，所述酸性条件下其pH＝4.5～5。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物的应用，用作增溶剂、吸收促进剂、乳化剂或水难溶性/脂溶性药物传递系统载体。
按照本发明的另一个方面，提供了一种纳米胶束，其包含所述的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物。
优选地，该纳米胶束为所述的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物通过直接溶解法、熔融法、溶剂蒸发法或透析法等方法制备得到。
按照本发明的另一个方面，提供了一种水难溶性和/或脂溶性药物传递系统，包含药物和所述的纳米胶束，且以所述的纳米胶束为药物传递系统载体。
作为优选的方案，所述纳米胶束的颗粒粒径为5～1000nm。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物(缩写为Ar-cys-mPEG)，其通过在胱氨酸的两个氨基分别通过酰胺键连接芳香酸或芳香杂环酸，同时胱氨酸的两个羧基分别被聚乙二醇修饰。难溶性药物大部分都具有复杂的芳香结构，较差的水溶性限制其在临床上应用，本发明提供的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物与芳香结构难溶药物之间的π-π堆积作用进行包载，与脂肪酸相比其芳香环电子云之间π-π共轭效应极大地增强其脂溶性，同时与其它表面活性剂可显现出优异的协同效应，为临床上难溶药物的传递提供新的方案。
(2)本发明提供的一种聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物Ar-cys-mPEG，胱氨酸的两个羧基分别被聚乙二醇修饰，作为表面活性剂其溶解性和抗硬性都得到极大改善，解决了羧酸盐表面活性剂存在的弊端。
(3)本发明提供的Ar-cys-mPEG增强胱氨酸不同联接基团的疏水性和亲水性，Ar-cys-mPEG表面活性剂紧密地排列在界面上，倾向于发生聚集、形成胶束，使分子在界面处的吸附面积大大减小，导致分子吸附量不易达到饱和状态，从而显现出更高的表面活性和更低的临界胶束浓度。
(4)本发明提供的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物是一种双子星型表面活性剂，制成的纳米颗粒粒径10～300nm。该衍生物在制剂研究中可作为增溶剂、吸收促进剂、乳化剂以及水难溶性和脂溶性药物传递系统载体。本发明提供的Ar-cys-mPEG为非离子氨基酸表面活性剂，在体内经酶降解，安全无毒、无刺激、生物降解性好，可作为水难溶性和脂溶性药物传递系统载体。
附图说明
图1为本发明实施例1的苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG的合成路线图。
图2为本发明实施例2的酪氨酸-胱氨酸-mPEG的合成路线图。
图3为本发明实施例3的烟酸-胱氨酸-mPEG的合成路线图。
图4为苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG 4000包载难溶药物胶束溶液粒径图。
图5为多西他赛-Tyr-cys-mPEG2000纳米胶束电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
难溶性药物大部分都具有复杂的芳香结构，较差的水溶性限制其在临床上应用，本发明提供的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物与难溶药物之间的π-π堆积作用进行包载，为临床上难溶药物的传递的提供新的方案。本发明提供的聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物作为一种新型Gemini氨基酸表面活性剂，其结构新颖、临界胶束浓度低、表面活性高、协同作用、安全无毒、无刺激、生物降解性好，可作为水难溶性和脂溶性药物传递系统载体。
以下为具体实施例：
实施例1
苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG的合成
分别称取19.38g Fmoc-D-苯丙氨酸、20mL氯仿、6.0mL氯化亚砜加入到100mL烧瓶中，60℃反应2.0h，减压蒸出氯仿和氯化亚砜，然后石油醚重结晶，得到白色晶体Fmoc-D-苯丙氨酸酰氯。称取Fmoc-D-苯丙氨酸酰氯20.23g用25mL丙酮溶解备用，在100mL烧瓶中加入12.01g L-胱氨酸和10mL丙酮，在冰浴和磁力搅拌条件下，缓慢滴加Fmoc-D-苯丙氨酸酰氯丙酮溶液，滴加完毕后升温至室温，搅拌反应4h，减压蒸出丙酮，，有固体析出，抽滤、洗涤、干燥、得Fmoc-D-苯丙氨酸-L-胱氨酸。
分别称取Fmoc-D-苯丙氨酸-L-胱氨酸2.1g、mPEG2000-NH2 24g用300mL无水二氯甲烷溶解，加入1.5g DCC，搅拌反应48h，用过量冷乙醚沉淀，抽滤、洗涤，用200mL无水二氯甲烷溶解，加入20mL吡啶，搅拌反应1h，用过量冷乙醚沉淀，抽滤、洗涤、干燥、得D-苯丙氨酸-L-胱氨酸-mPEG2000(Phe-cys-mPEG 2000)，合成路线如图1所示。
实施例2
酪氨酸-胱氨酸-mPEG的合成
分别称取12.01g Fmoc-L-酪氨酸、20mL氯仿、6.0mL氯化亚砜加入到100mL烧瓶中，60℃反应2.0h，减压蒸出氯仿和氯化亚砜，然后石油醚重结晶，得到白色晶体Fmoc-L-酪氨酸酰氯。称取Fmoc-L-酪氨酸酰氯21.14g用25mL DMF溶解备用，在100mL烧瓶中加入12.01gL-胱氨酸、20mL浓氨水和15mL DMF，在冰浴和磁力搅拌条件下，缓慢滴加Fmoc-L-酪氨酸酰氯DMF溶液，滴加完毕后升温至室温，搅拌反应4h，减压蒸出DMF，用乙醇/水/乙酸乙酯重结晶得Fmoc-L-酪氨酸-L-胱氨酸。分别称取Fmoc-L-酪氨酸-L-胱氨酸2.4g、mPEG4000-NH2 40g用400mL无水二氯甲烷溶解，加入1.5g DCC，搅拌反应48h，用过量冷乙醚沉淀，抽滤、洗涤，用200mL无水二氯甲烷溶解，加入20mL吡啶，搅拌反应1h，用过量冷乙醚沉淀，抽滤、洗涤、干燥、得L-酪氨酸-L-胱氨酸-mPEG4000(Tyr-cys-mPEG 4000)，合成路线如图2所示。
实施例3
烟酸-胱氨酸-mPEG的合成
分别称取5.56g烟酸、20mL氯仿、6.0mL氯化亚砜加入到100mL烧瓶中，60℃反应2.0h，减压蒸出氯仿和氯化亚砜，然后石油醚重结晶，得到白色晶体烟酸酰氯。称取烟酸酰氯7.12g用25mL丙酮溶解备用，在100mL烧瓶中加入12.01g L-胱氨酸、25.0mL氢氧化钠溶液(2.5mol/L)和10mL丙酮，在冰浴和磁力搅拌条件下，缓慢滴加烟酸酰氯丙酮溶液和5.0mL氢氧化钠溶液(0.5mol/L)，滴加完毕后升温至室温，搅拌反应4h，减压蒸出丙酮，滴加稀硫酸溶液调至溶液为弱酸性，有固体析出，抽滤、洗涤、干燥、得烟酸-L-胱氨酸。分别称取烟酸-L-胱氨酸2.0g、mPEG5000-NHNH2 60g用500mL无水二氯甲烷溶解，加入2.0g EDC，搅拌反应48h，用过量冷乙醚沉淀，抽滤、洗涤、干燥、得烟酸-L-胱氨酸-mPEG5000(VPP-cys-mPEG5000)，合成路线如图3所示。
实施例4
苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG 2000临界胶束浓度的测定
采用威廉米吊片法测定25℃下各浓度苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG 1000水溶液的表面张力，方法如下：准确称取10mg Phe-cys-mPEG 2000置于100mL容量瓶中，以去离子水溶解并定容，即得到1*10-4g/mL的Phe-cys-mPEG 2000标准水溶液；静置稳定后，用移液管移取溶液50mL转移至100mL容量瓶，定容即得到5*10-5g/mL的Phe-cys-mPEG 2000水溶液，以此类推不断按照不同比例进行稀释，分别配置 1*10-5g/mL、5*10-6g/mL、1*10-6g/mL、5*10-7g/mL、1*10-7g/mL的Phe-cys-mPEG 2000水溶液；准确称取Phe-cys-mPEG 2000置于100mL容量瓶中，以去离子水溶解并定容，即得到1*10-2g/mL、1*10-3g/mL的Phe-cys-mPEG 2000标准水溶液。实验测得去离子水25℃下表面张力，待溶液稳定后分别测定25℃下每个浓度Phe-cys-mPEG2000溶液的表面张力。实验测得Phe-cys-mPEG 2000临界胶束浓度为9.32*10-7g/mL。
实施例5
多西他赛-Phe-cys-mPEG 2000纳米胶束制备
称取多西他赛20.0mg，Phe-cys-mPEG 2000 60.0mg，用2mL二氯甲烷充分溶解，旋转蒸发除去二氯甲烷形成薄膜，加入4mL去离子水溶解薄膜形成多西他赛-Phe-cys-mPEG2000纳米胶束水溶液。测定粒径和粒径分布、形貌、包封率、稳定性等指标。胶束溶液平均粒径为16nm，粒度大小均匀，载多西他赛包封率为96.4％。胶束溶液在40℃稳定性试验箱放置1个月依然澄清、无混浊，测得载多西他赛包封率为95.8％。添加5％蔗糖作为冻干保护剂，冷冻干燥制得冻干形式的制剂，其冻干粉末电镜图如图5所示，其粉末圆整度适中，大小较均一。
实施例6
紫杉醇-Tyr-cys-mPEG 4000纳米胶束制备
称取紫杉醇20.0mg，Tyr-cys-mPEG 4000 60.0mg，用2mL无水乙醇充分溶解，混合溶液倒入透析袋中，用1L去离子水透析24h，透析后过滤，形成紫杉醇-Tyr-cys-mPEG4000纳米胶束水溶液。测定粒径和粒径分布、形貌、包封率、稳定性等指标。载药纳米胶束平粒径为24nm，粒度大小均匀，分布较窄，胶束成形良好。载紫杉醇包封率为94.3％。胶束溶液在40℃稳定性试验箱放置1个月依然澄清、无混浊，测得载紫杉醇包封率为94.0％。
实施例7
伏立康唑-VPP-cys-mPEG 5000纳米胶束制备
称取伏立康唑20.0mg，VPP-cys-mPEG 5000 80.0mg，用4mL去离子水室温搅拌4h，过滤，形成伏立康唑-VPP-cys-mPEG 5000纳米胶束水溶液。测定粒径和粒径分布、形貌、包封率、稳定性等指标。胶束溶液平均粒径为20nm，粒度大小均匀，载多西他赛包封率为93.3％。胶束溶液在40℃稳定性试验箱放置1个月依然澄清、无混浊，测得载多西他赛包封率为92.6％。
测定聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物临界胶束浓度(CMC)值，如表1所示，其CMC值均小于10-5g/mL，表明其具有良好的表面活性。
表1聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物临界胶束浓度
胱氨酰胺衍生物
临界胶束浓度(g/mL)
Phe-cys-mPEG 2000
9.32*10<sup>-7</sup>
Phe-cys-mPEG 4000
2.06*10<sup>-6</sup>
Phe-cys-mPEG 5000
2.41*10<sup>-6</sup>
Tyr-cys-mPEG 2000
1.85*10<sup>-6</sup>
Tyr-cys-mPEG 4000
3.17*10<sup>-6</sup>
Tyr-cys-mPEG 5000
3.76*10<sup>-6</sup>
VPP-cys-mPEG 2000
6.02*10<sup>-6</sup>
VPP-cys-mPEG 4000
7.63*10<sup>-6</sup>
VPP-cys-mPEG 5000
8.54*10<sup>-6</sup>
将制备得到的不同胱氨酰胺衍生物作为不同药物的传递系统载体，按照上述实施例的方法测试其性能，测试结果如表2所示。
图4为苯丙氨酸-胱氨酸-mPEG 4000包载不同难溶药物胶束溶液粒径图。从图4和表2可以看出，本发明实施例制备的不同的基于聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物可以作为药物传递系统载体，包封率均大于93％，载药量大于20％，载药胶束分散系数小，粒度分布较窄，胶束成形良好。
表2聚乙二醇修饰的胱氨酰胺衍生物性能测定
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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