具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

在本实施例中，请参阅图1，图1为本发明实施例提供的碳化聚合物点材料的制备方法的方法流程图。如图所示，本发明实施例提供了一种碳化聚合物点材料的制备方法，包括步骤S110～S140。

S110、将芳香胺化合物溶解或分散于溶剂中得到浓度为1～10mmol/L的分散液。

具体的，所述芳香胺化合物为2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯、2,4-二氨基苯磺酸或3,5-二氨基苯甲酸。所述溶剂为盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、甲酸、乙酸、柠檬酸中的一种或多种，若溶剂为单一种化合物，则该溶剂为纯溶剂，若溶剂由两种以上化合物配比组成，则该溶剂为混合溶剂。

S120、在所述分散液中加入酸催化剂以得到氢离子的最终浓度为0.01～10mmol/L的前驱体溶液。

具体的，酸催化剂为盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸、甲酸、乙酸、柠檬酸中的一种或多种。其中，盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸均为无机酸，甲酸、乙酸、柠檬酸均为有机酸。

更具体的，所述前驱体溶液中还添加有表面修饰剂和/或电荷调节剂。所述前驱体溶液中所述表面修饰剂的最终浓度为0.01～5mmol/L；所述前驱体溶液中所述电荷调节剂的最终浓度为0.01～5mmol/L。其中，所述表面修饰剂为B族维生素及其衍生物，包括但不限于维生素B1(硫铵)、B2(核黄素)、B3(烟酸)、B5(泛酸)、B7(生物素)、维生素B9(叶酸)；所述电荷调节剂为季铵盐化合物，包括但不限于甜菜碱、胆碱、氯化苄基三乙基铵、四丁基硫酸氢铵。

S130、将所述前驱体溶液盛装于烧杯中在常压及100～240℃下加热反应0.5～24h，或将所述前驱体溶液封装于反应釜中在压强大于101kPa及100～240℃下加热反应0.5～24h，得到粗产物溶液。

具体的，反应釜中压强为1.2～40个大气压。

S140、对所述粗产物溶液进行柱层析提纯和真空干燥得到所述碳化聚合物点材料成品。

具体的，所合成的碳化聚合物点材料具有典型纳米点形貌(粒径为1～10nm)和位于可见光范围(400～800nm)的光致发光，并在溶解于一定浓度核酸大分子(DNA/RNA)的水溶液中发生光致发光的显著增强(≥200％)的特性。

使用碳化聚合物点材料对活细胞进行颜色后，可使用配备脉冲光源和单光子计数器(Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC)的共聚焦设备对染色细胞进行荧光寿命显微成像(Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM)，基于荧光寿命的差异信息，得到包含不同核酸结构的活细胞成像图像；还可使用环形连续或脉冲激光作为受激发射损耗(Stimulated Emission Depletion，STED)光源，基于受激发射损耗原理对所述细胞培养基中的染色细胞进行超分辨成像，得到细胞超分辨成像图像。

采用上述制备方法所制备得到的碳化聚合物点材料具有以下有益技术效果：(1)实现碳化聚合物点材料对活细胞中核酸分子的刺激响应性荧光和主动靶向，整合材料的低生物毒性和抗光漂白性，实现对活细胞中核酸结构的长效动态跟踪。(2)合成方法便捷、可靠、可控性高，通过调整反应条件(温度，时间，引发剂，催化剂)可以对得到的碳化聚合物点的光谱和寿命进行微调。(3)所合成的碳化聚合物点材料具有较小尺寸(<10nm)和较高的跨膜运输效率，可在短时间(≤2小时)内完成对细胞内核酸结构的着色。(4)所合成的碳化聚合物点材料具有较低的饱和受激损耗功率，在STED成像模式下只需要较低的损耗光功率(<10mW)就可实现对细胞内核酸结构的超分辨成像(≤100nm)。(5)所合成的碳化聚合物点材料与核酸结合、富集后根据具体化学环境及富集程度的不同可表现出荧光寿命的差异，基于这一差异在FLIM成像模式下可以有效区分细胞质RNA、细胞核染色质及核仁等不同结构。

实施例1

称取200μmol(24.4mg)2,4-二氨基甲苯、25μmol(11mg)维生素B9(叶酸)和20μmol(2.3mg)甜菜碱分散于25mL去离子水中，超声分散均匀。向此溶液中加入25μL 10mol/L盐酸，充分搅拌混匀后封装于50mL水热反应釜中，反应釜压强为9个大气压，升温至180℃反应20h得到粗产品溶液。收集粗产品溶液旋转蒸发除去溶剂后透析24小时(截留分子量2000Da)，并使用硅胶柱层析进一步提纯(展开剂为1：9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的组分，旋转蒸发除去溶剂后分散于去离子水，过滤后冻干得到目标产物固体粉末。图2为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的透射电镜形貌及粒径统计图，采用实施例1中的制备方法制备得到的碳化聚合物点材料的外观特性如图2所示，其中图2(a)为碳化聚合物点材料的透射电镜形貌图，图2(b)为碳化聚合物点材料的粒径统计图，由图中信息可知碳化聚合物点材料的粒径为2至4.4nm之间，粒径绝大部分分布于2～4nm之间，其平均粒径约为3nm。

实施例2

称取500μmol(61mg)2,6-二氨基甲苯分散于5mL甘油中，搅拌下加热至100摄氏度至完全溶解。加入50μL 1mol/L盐酸后进一步升温至220℃，常压下搅拌反应90min后冷却至室温，加入20mL甲醇超声分散后离心除去不溶物，取上清液旋干、透析24小时(截留分子量2000Da)，并进一步通过硅胶柱层析提纯(展开剂为1：9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的荧光组分，旋转蒸发除去溶剂后目标产物固体粉末。

实施例3

称取500μmol(61mg)2,4-二氨基甲苯和50μmol(22mg)维生素B3(烟酸)分散于5mL甘油中，搅拌下加热至100℃至完全溶解。加入50μL浓磷酸后进一步升温至220℃，常压下搅拌反应30min后冷却至室温，加入20mL甲醇超声分散后离心除去不溶物，取上清液旋干、透析24h(截留分子量2000Da)，并进一步通过硅胶柱层析提纯(展开剂为1：9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的荧光组分，旋转蒸发除去溶剂后目标产物固体粉末。

实施例4

称取200μmol(24.4mg)2,4-二氨基甲苯、25μmol(11mg)维生素B9(叶酸)分散于25mL去离子水中，超声分散均匀。向此溶液中加入25μL 10mol/L盐酸，充分搅拌混匀后封装于50mL水热反应釜中，升温至180℃反应20h得到粗产品。收集粗产品旋转蒸发除去溶剂后透析24h(截留分子量2000Da)，并使用硅胶柱层析进一步提纯(展开剂为1：9的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的组分，旋转蒸发除去溶剂后分散于去离子水，过滤后冻干得到目标产物固体粉末。

实施例5

称取1mmol(188.2mg)2,4-二氨基苯磺酸、200μmol(48.8mg)维生素B7(生物素)和80μmol(8.3mg)胆碱分散于125mL乙醇中，超声分散均匀。向此溶液中加入100μL 10mol/L硫酸，充分搅拌混匀后封装于200mL水热反应釜中，升温至80℃反应24h得到粗产品。收集粗产品旋转蒸发除去溶剂后使用硅胶柱层析进一步提纯(展开剂为1：5的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的组分，旋转蒸发除去溶剂后分散于去离子水，过滤后冻干得到目标产物固体粉末。

实施例6

称取250μmol(38.3mg)3,5-二氨基苯甲酸、50μmol(18.8mg)维生素B2(核黄素)和50μmol(16.9mg)四丁基硫酸氢铵分散于125mL乙醇中，超声分散均匀。向此溶液中加入100μL 10mol/L硫酸，充分搅拌混匀后封装于200mL水热反应釜中，升温至160摄氏度反应4小时得到粗产品。收集粗产品旋转蒸发除去溶剂后使用硅胶柱层析进一步提纯(展开剂为1：4的甲醇/二氯甲烷混合溶剂)。收集提纯后的组分，旋转蒸发除去溶剂后重新分散于去离子水中，过滤后冻干得到目标产物固体粉末。

图3为本发明实施例1～6的碳化聚合物点材料的效果示意图，如图3所示，其中呈现了对实施例1～6所得固体粉末材料进行3D荧光光谱等高线分析所得到的分析结果。

实施例7

将实施例1～4中制备得到的固体粉末材料分别溶解于pH为7.0～7.4的PBS缓冲液中配制成10μg/mL的溶液，向其中分别加入DNA(提取自鲑鱼精)和RNA(提取自酵母菌)分子至1mg/mL终浓度。图4为本发明实施例1～4的碳化聚合物点材料的效果示意图，图4为各材料对核酸分子的响应性荧光增强系数对比图，分别测试实施例1～4中各材料在DNA、RNA环境中的荧光增强系数，所得测试结果如图4所示。

图5为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，具体的，图5为对不同浓度核酸分子的响应性荧光增强系数进行分析的分析结果，可进一步对实施例1中所得到的材料进行响应性荧光增强系数分析，测量其在不同浓度DNA/RNA溶液中荧光强度随核酸分子浓度的变化，结果如图5所示。

图6为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，具体的，图6为材料在不同浓度下与DNA分子结合后的荧光寿命分布图，对实施例1中所得到的材料进行荧光寿命分析，测量其在不同浓度下与DNA分子结合后荧光寿命分布的变化，所得结果如图6所示。

实施例8

图7为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，具体的，图7为材料单点分辨率随损耗光功率提高的变化图，将实施例1中所得的碳化聚合物点材料溶于乙醇中并旋涂至玻片表面，选取488nm激发波长和592nm损耗波长，测量分析不同损耗光功率下发光点分辨率的提升(以半峰宽计)，结果如图7所示。

可根据公式(1)对图7所示的分析结果进行拟合计算，公式(1)如下所示：

计算得实施例1中所得到的材料的受激损耗饱和功率为0.68mW(0.23MW/cm²)，显著低于现有的小分子STED激发材料，其中，δ_STED为STED模式下的成像分辨率，λ为荧光探针(实施例1中所得到的碳化聚合物点材料)发射波长，NA为数值孔径，I_STED为损耗激光功率，I_sat为材料的受激损耗饱和功率。

将该碳化聚合物点材料分散于去离子水中得到浓度为1mg/mL的溶液。量取不同体积的上述水溶液，与含有10％FBS的RPMI1640培养基混合配制成浓度为0～50μg/mL的溶液，加入贴壁生长有KYSE-150细胞(每孔约10⁴细胞)的标准96孔板中，在37℃，5％CO₂条件下孵育24h，通过标准CCK-8法评估其细胞毒性。图8为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，具体的，图8为KYSE-150细胞存活率随着材料浓度增加的变化。如图8所示，在0～50μg/mL浓度下，细胞存活率超过90％，显示材料具有较低的毒性，适宜对活细胞进行长实现成像的应用。

量取20μL含有1mg/mL材料的溶液加入2mL含有10％FBS的RPMI1640培养基，在贴壁生长有KYSE-150细胞(浓度大约3x10⁵/L)的35mm共聚焦培养皿中染色120min后对染色质部位进行共聚焦/STED成像，图9为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，使用实施例1中的材料对KYSE-150细胞染色后在共聚焦和STED成像条件下的成像效果及分辨率对比，所得图像如图9所示。其中，共聚焦成像的成像条件为：激发波长488nm，功率0.72μW；STED成像的成像条件为：激发波长488nm，功率0.72μW；损耗光波长592nm，功率(连续光)4.1mW；由图9可见，STED成像模式下对染色质成像的分辨率(以半峰宽计)提高至100nm附近，显著优于共聚焦成像(>200nm)的分辨率。

图10为本发明实施例1的碳化聚合物点材料的效果示意图，在图9的成像条件下，图10为材料的荧光强度在共聚焦/STED成像条件下随连续成像帧数增长的衰减情况。如图10所示，在共聚焦成像模式下，荧光强度在前200帧内几乎不发生衰减；而在STED成像模式下，荧光强度在前200帧内维持在初始强度的70％以上，显示该材料在实际应用中有较优的抗光漂白性质。

实施例9

将实施例4中得到的碳化聚合物点材料分散于去离子水中得到浓度为1mg/mL的溶液。量取20μL该溶液加入2mL含有10％FBS的RPMI1640培养基，在贴壁生长有KYSE-150细胞(浓度大约3x10⁵/L)的35mm共聚焦培养皿中染色120min后对染色质部位进行共聚焦(Confocal)/STED成像，图11为本发明实施例4的碳化聚合物点材料的效果示意图，使用实施例4中的材料对KYSE-150活细胞染色后对细胞内核算结构进行荧光寿命成像，所得到的荧光寿命分布图及相量分析结果如图11所示。其中，成像条件(FLIM)为：激发波长：488nm，40MHz，滤光片：495LP。其中，图11(a)为荧光寿命分布图，图11(b)为相量分析图，由图11中荧光寿命分布图和相量分析图可见，在荧光寿命成像模式下经碳化聚合物点染色的活细胞核仁、染色质及细胞质具有明显的寿命差异。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。