阅读说明：本技术 一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物的用途 (Application of symbiotic fermentation product of hydrolyzed candida and saccharomyces cerevisiae ) 是由 沈琳 陶侃 杨宇阁 郭莉莉 朱蕙林 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物可用于制备促进胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸合成的护肤品制剂的用途,该发酵产物能显著促进CollagenⅠ、CollagenⅢ和CollagenⅣ基因的表达,显著促进Elastin和Fibrillin-1基因的表达,显著促进Has-1基因的表达。所述发酵产物能促进肌肤胶原蛋白和胶原纤维生成,改善人体胶原蛋白的更新,促进肌肤弹力蛋白和纤维蛋白的合成,并促进肌肤透明质酸的合成,提高皮肤保湿能力,且发酵产物中也含有很多酶类和微量元素,有补充增效作用,可用于制备抗衰老护肤品制剂从而达到良好的抗衰老效果,同时符合消费者对于“天然、绿色、健康”护肤品的期待。本发明还提供了水解假丝酵母和日本清酒酵母的共生培养方法。(The invention discloses an application of a symbiotic fermentation product of hydrolyzed candida and saccharomyces cerevisiae in preparing a skin care product preparation for promoting synthesis of Collagen, Elastin, fibrin and hyaluronic acid, wherein the fermentation product can obviously promote expression of Collagen I, Collagen III and Collagen IV genes, obviously promote expression of Elastin and Fibrillin-1 genes and obviously promote expression of Has-1 genes. The fermentation product can promote the generation of skin collagen and collagen fibers, improve the renewal of human collagen, promote the synthesis of skin elastin and fibrin, promote the synthesis of skin hyaluronic acid, improve the skin moisturizing capability, has a supplementary and synergistic effect due to the fact that the fermentation product also contains a plurality of enzymes and trace elements, can be used for preparing an anti-aging skin care product preparation so as to achieve a good anti-aging effect, and simultaneously meets the expectations of consumers on natural, green and healthy skin care products. The invention also provides a symbiotic culture method of the hydrolytic candida and the Japanese sake yeast.)

一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物的用途

技术领域

本发明涉及护肤品技术领域，具体而言，涉及护肤品的发酵原料领域，尤其涉及一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵的方法和用途。

背景技术

衰老是生物随着时间的推移自发的必然过程。大多数人的皮肤衰老基本从25岁就开始了，主要表现在皱纹增多，色素沉着和皮肤松垂等，而皮肤老化的决定因素在于内外环境对真皮层内胶原蛋、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸的破坏以及皮肤水分的流失等。人真皮层80％是胶原蛋白，它的三维螺旋结构，如弹簧般支撑着皮肤，使皮肤富有弹性、光泽和平滑。胶原蛋白由皮肤中的成纤维细胞生成，存在于细胞外基质中，为皮肤提供结构稳定性，为结缔组织提供耐久性及粘结组织以支持细胞连接、细胞增生和诱导未分化细胞分化等作用。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，弹力蛋白在肌肤中仅含5％，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力，而弹性纤维的90％是由弹力蛋白组成。纤维蛋白可增加皮肤和粘模的紧致度和弹性。透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织中，是细胞外基质的主要成分之一。因此，促进肌肤的胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白和透明质酸的合成，能达到一定的抗衰老效果。

近年来研究表明，促进胶原蛋白生成和给皮肤补充胶原蛋白就能减轻皱纹、增加皮肤弹性和强度的作用，从而达到抗衰老的作用。目前市面已开发出的一些含胶原蛋白的护肤品涂抹于皮肤表面之上，由于高分子量的胶原蛋白，难以透皮吸收，抗衰老效果却不理想，并不能改善皮肤的外观，且安全性、功效性也被消费者质疑。据《己使用化妆品原料名称目录(2015版)》，目前可在化妆品中添加的酵母类相关原料名称已经很多，由此可见，在化妆品中添加酵母提取物是潮流趋势，同时，发酵产物是纯生物的过程，没有任何化工成分的添加，符合消费者对于“天然、绿色、健康”护肤品的期待，这一点在护肤品市场上也得到了充分证实。

日本清酒酵母由日本酿造协会保存，协会7号酵母(701 or K701)，长野学名Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen，是在清酒制造中最被广泛使用的协会酵母，具有很醇的芳香，广泛地被用于呤酿和普通酿造。由昭和21年(1946年)的长野县被分离出来。日本清酒酵母提取物具有天然、安全、强效的保湿功效，其酵母细胞中含有丰富的天然保湿因子，它与肌肤细胞所需的养分非常相近，能够加快肌肤新陈代谢，它含有丰富的维他命、矿物质、氨基酸及有机酸等百分百天然物质，所以极易被人体细胞所吸收。

水解假丝酵母(Candida saitoana)是日本生物学家大隅良典在研究细胞自噬机制中发现的活性物。在随着年龄增长，皮肤细胞更新能力不断减弱的情况下，水解假丝酵母中的活性成分，可以让病变受损的细胞，通过自噬作用消除，以此来达到细胞更新修护。

现有传统技术中，都是单菌种进行分别完成发酵后，再进行两种发酵液进行勾兑。不同的菌群和酶类，溶解到一起发生的抵消反应，对损伤大量的菌群和酶活性，往往实际效果不理想。多菌共生发酵即将多种菌进行可控性发酵，不仅可以发酵出种类更多的有益酶，还能使酶产出的数量是普通单菌种发酵数量的多倍，酶越多，对人体的催化保健功能越强。CN108553403B公开了酵母菌和嗜热菌共同培养，经过特殊的培养方法，可显著提升发酵产物中的活性物质含量，发酵产物并可用于制作消炎、皮肤保湿或皮肤祛黄试剂。但是目前还没有利用水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵来制备抗衰老护肤品的相关报道。

发明内容

针对现有的抗衰老护肤品，普遍为含胶原蛋白的护肤品，难以更好的透皮吸收，使用周期长，且安全性、功效性得不到保证等问题，本发明提供一种具有促进自身胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白和透明质酸合成等功效的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵组合物，可用于制备抗衰老护肤品制剂，符合消费者对于“天然、绿色、健康”护肤品的期待，拥有较好的抗衰老效果。

虽然水解假丝酵母和日本清酒酵母单独培养可以产生一些有益的活性物质，但活性物质含量并不高，活性也不高。如果让水解假丝酵母和日本清酒酵母共生培养，经过特殊的培养方法，可以显著提升活性物质。

一方面，本发明提供了一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在制备促进胶原蛋白合成的护肤品制剂方面的用途。本发明人发现，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物能够促进CollagenⅠ、CollagenⅢ和CollagenⅣ基因的表达，从而促进胶原蛋白合成。

皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ)是构成皮肤真皮细胞外基质最主要的蛋白成分，具有保持皮肤水分、支撑皮肤正常结构及维持皮肤韧性的功能，主要分布于真皮层，仅由成纤维细胞合成和分泌。皮肤Ⅳ型胶原蛋白(CollagenⅣ)是皮肤基底膜带的主要结构成分之一。促进CollagenⅠ、CollagenⅢ和CollagenⅣ基因的表达，能促进肌肤胶原蛋白和胶原纤维生成，达到肌肤抗衰老。

为实现该用途，本发明所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵方法包括如下步骤：

(1)对日本清酒酵母进行低温25℃、pH值为4.0-5.0的酸性条件下的一次或多次的增菌发酵，让其处于指数生长期；

(2)添加水解假丝酵母，在pH值为7.0-8.5的碱性条件下进行二次发酵，发酵液离心除菌；

其中，日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母；水解假丝酵母菌种保藏号为CICC 31239，购于中国科学院微生物研究所。

日本清酒酵母为协会7号酵母(701 or K701)，长野学名Saccharomycescerevisiae Meyen ex E.C.Hansen。

进一步地，在步骤(1)中，对日本清酒酵母进行至少两次以上的增菌培养，从而让酵母处于指数生长期；在步骤(2)中，向日本清酒酵母培养液中接种水解假丝酵母前，对水解假丝酵母进行一次或多次增菌培养。

另一方面，本发明提供了一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在制备促进弹力蛋白合成的护肤品制剂方面的用途，本发明人发现，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物能够促进弹力蛋白(Elastin)基因的表达，从而促进弹力蛋白合成。

弹力蛋白是弹性纤维的主要成分。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，弹力蛋白在肌肤中仅含5％，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，占肌肤70％的胶原蛋白决定肌肤的柔润饱满，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力，而弹性纤维的90％是由弹力蛋白组成。肌肤的弹性取决于我们肌肤里层的弹性纤维，它相当于无数条橡皮筋，支撑起肌肤组织的弹性纤维网。弹力蛋白减少，是肌肤衰老的重要原因。促进Elastin基因的表达，能促进弹力纤维的形成，还能激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成，从而实现肌肤抗衰老。

为实现该用途，本发明所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵包括如下步骤：

(1)对日本清酒酵母进行低温25℃、pH值为4.0-5.0的酸性条件下的一次或多次的增菌发酵，让其处于指数生长期；

(2)添加水解假丝酵母，在pH值为7.0-8.5的碱性条件下进行二次发酵，发酵液离心除菌；

其中，日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母；水解假丝酵母菌种保藏号为CICC 31239，购于中国科学院微生物研究所。

进一步地，在步骤(1)中，对日本清酒酵母进行至少两次以上的增菌培养，从而让酵母处于指数生长期；在步骤(2)中，向日本清酒酵母培养液中接种水解假丝酵母前，对水解假丝酵母进行一次或多次增菌培养。

另一方面，本发明提供了一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在制备促进纤维蛋白合成的护肤品制剂方面的用途。本发明人发现，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物能够促进纤维蛋白(Fibrillin-1)基因的表达，从而促进纤维蛋白合成。

纤维蛋白和弹力蛋白都是弹性纤维的主要成分。纤维蛋白可增加皮肤和粘模的紧致度和弹性。促进Fibrillin-1基因的表达，也能促进弹力纤维的形成，从而实现肌肤抗衰老。

为实现该用途，本发明所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵包括如下步骤：

(1)对日本清酒酵母进行低温25℃、pH值为4.0-5.0的酸性条件下的一次或多次的增菌发酵，让其处于指数生长期；

(2)添加水解假丝酵母，在pH值为7.0-8.5的碱性条件下进行二次发酵，发酵液离心除菌；

其中，日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母；水解假丝酵母菌种保藏号为CICC 31239，购于中国科学院微生物研究所。

进一步地，在步骤(1)中，对日本清酒酵母进行至少两次以上的增菌培养，从而让酵母处于指数生长期；在步骤(2)中，向日本清酒酵母培养液中接种水解假丝酵母前，对水解假丝酵母进行一次或多次增菌培养。

再一方面，本发明提供了一种水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在制备促进透明质酸合成的护肤品制剂方面的用途。本发明人发现，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物能够促进透明质酸合成酶(HAS1)基因的表达，从而促进纤维蛋白合成。

透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织中，是细胞外基质的主要成分之一，可以由膜蛋白透明质酸合成酶(HAS1)合成的。透明质酸合成酶可通过交替反复加入其底物尿苷二磷酸-a-N-乙酰葡糖胺及尿苷二磷酸-a-D-葡萄糖醛酸而延长透明质酸链，新产生的多糖透过细胞膜进入细胞外间质，从而促进透明质酸的合成。促进HAS1基因的表达，能促进透明质酸的合成，提升肌肤保湿功能，帮助肌肤抵抗衰老。

为实现该用途，本发明所述的所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵包括如下步骤：

(1)对日本清酒酵母进行低温25℃、pH值为4.0-5.0的酸性条件下的一次或多次的增菌发酵，让其处于指数生长期；

(2)添加水解假丝酵母，在pH值为7.0-8.5的碱性条件下进行二次发酵，发酵液离心除菌；

其中，日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母；水解假丝酵母菌种保藏号为CICC 31239，购于中国科学院微生物研究所。

进一步地，在步骤(1)中，对日本清酒酵母进行至少两次以上的增菌培养，从而让酵母处于指数生长期；在步骤(2)中，向日本清酒酵母培养液中接种水解假丝酵母前，对水解假丝酵母进行一次或多次增菌培养。

进一步地，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵包括：

步骤1：分别对日本清酒酵母和水解假丝酵母进行增菌培养；

其中，日本清酒酵母增菌方法如下：

在超净工作台上取试管斜面上的日本清酒酵母ATCC26422一环，接入装有pH为4.8±0.2的培养液的三角瓶中，200rpm，25℃培养48h，菌体处于指数生长期；将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，按照3-10％的接种量接种于二级种子罐，在25℃，pH为4.8±0.2培养48h。

其中，水解假丝酵母增菌方法如下：

在超净工作台上取水解假丝酵母CICC31239冻存液接入装有pH为7.8±0.2的培养液的三角瓶中，150rpm，25℃培养16h，菌体处于指数生长期后，将菌液接种到二级种子罐中。

步骤2：日本清酒酵母的一次发酵

将日本清酒酵母二级种子液转接至装pH为4.8±0.2的发酵罐中，通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

步骤3：添加水解假丝酵母进行二次发酵

将水解假丝酵母增菌液转移到发酵罐中，150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，25℃培养24h。

其中，所述的发酵基本培养液配方为：培养液中含有牛肉浸膏10g/L、胰蛋白胨5g/L，酪蛋白3g/L，葡萄糖5g/L，水溶性淀粉1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，无水醋酸钠3g/L，pH值用酸或碱进行调节控制，其余为水；种子液按3-10％的接种量接种至培养基液。

其中，步骤3的二次发酵后，还包括进行分离纯化步骤，其中所述的分离纯化包括离心除菌步骤。

进一步地，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液在制备促进胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸合成的护肤品制剂为溶液、悬浮液、面膜、乳液、霜剂、膏状、凝胶、干粉、湿粉、喷剂中的一种。

进一步地，所述的护肤品制剂为水剂。

进一步地，所述的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液在制备促进胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸合成的护肤品制剂时的最佳添加浓度为0.625％。

本发明所述的抗衰老护肤品制剂除了包括发酵产物外，在不损本发明效果的范围内，可以根据需要而适宜配合在护肤品品、准药品领域中通常配合的各种成分，例如粉末成分、保湿剂、乳化剂、光稳定剂、增稠剂、增溶剂、金属离子掩蔽剂、色素、pH调节剂、皮肤营养剂、维生素、防腐剂、抗氧化剂、防晒剂、促渗剂、脂质体、皮肤营养组分、抗氧化助剂、香精、香料、色素等中的任意一种或几种的混合。

本发明的发酵产物相对单独的日本清酒酵母发酵产物和水解假丝酵母发酵产物，以及发酵液混合后的试剂，都具有显著的改善作用，可见两种菌共同培养具有相互促进作用，活性物质的活性含量或活性都大大提高。

本发明开发了对一种具有抗衰老功效的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物，能显著促进进CollagenⅠ、CollagenⅢ和CollagenⅣ基因的表达，同时显著促进Elastin、Fibrillin-1和Has-1基因的表达，能促进肌肤胶原蛋白和胶原纤维生成，改善人体胶原蛋白的更新，促进肌肤弹力蛋白和纤维蛋白的合成，并促进肌肤透明质酸的合成，提高皮肤保湿能力，且发酵产物中也含有很多酶类和微量元素，有补充增效作用，从而达到更好的抗衰老效果，可用于制备抗衰老护肤品制剂，符合消费者对于“天然、绿色、健康”护肤品的期待。本发明还提供了水解假丝酵母和日本清酒酵母共生培养方法，通过共生培养，可显著提升发酵产物的活性物质。

附图说明

图1为实施例5成纤维细胞的细胞毒性检测的样品细胞活力曲线

图2为实施例6成纤维细胞的细胞毒性形态学检测所得的样品细胞形态学检测结果电子显微镜照片

图3为实施例7基于成纤维细胞的荧光定量PCR的溶剂对照组和阳性对照组基因表达量变化曲线

图4为实施例7基于成纤维细胞的荧光定量PCR的溶剂对照组和样品组1基因表达量变化曲线

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

实施例1水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵

发酵基本培养液配方为：培养液中含有牛肉浸膏10g/L、胰蛋白胨5g/L，酪蛋白3g/L，葡萄糖5g/L，水溶性淀粉1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，无水醋酸钠3g/L，pH值用酸或碱进行调节控制，其余为水。不同量的培养液按照成分比例进行缩小和放大。

本发明所有实施例都采用以上配比的培养基配方作为菌种发酵的培养液。当然，在实际工业生产中，可以根据不同的要求进行配比，这些配方都是培养日本清酒酵母和/或水解假丝酵母的普通配方。

日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母；水解假丝酵母菌种保藏号为CICC 31239，购于中国科学院微生物研究所。

步骤1：分别对日本清酒酵母和水解假丝酵母进行增菌培养

日本清酒酵母增菌：

(1)在超净工作台上取试管斜面上的日本清酒酵母ATCC26422一环，接入装有50ml的pH为4.8±0.2的培养液的250ml三角瓶中，共接2瓶，200rpm，25℃培养48h，菌体处于指数生长期。

(2)将处于指数生长期的菌体80ml接种到装有2L，pH为4.8±0.2的培养液的2.5L三角瓶中，接种量为体积百分数的10％，200rpm，25℃培养48h。

(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L，pH为4.8±0.2的培养液的50L一级种子罐中，通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

(4)将30L菌液转移到装有300L培养液的500L二级种子罐中；通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

水解假丝酵母增菌：

在超净工作台上取水解假丝酵母CICC31239冻存液2ml接入装有2L，pH为7.8±0.2的培养液的2.5L三角瓶中，150rpm，25℃培养16h，菌体处于指数生长期后，将30L菌液接种到装有300L培养液的500L二级种子罐中。

步骤2：日本清酒酵母的一次发酵

将步骤(4)的300L菌液转接至装有2400L，pH为4.8±0.2的培养液的5000L发酵罐中，通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

步骤3：添加水解假丝酵母进行二次发酵

将300L水解假丝酵母增菌液转移到上述5000L发酵罐中，通气量维持在5m³/h/50L，150rpm搅拌，用碱液将pH值调节到7.8±0.2，25℃培养24h。

步骤4：分离纯化

经过二次发酵后的培养液进行离心除菌，保留上清液，即为水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物。

实施例2日本清酒酵母单独发酵

发酵基本培养液配方为：培养液中含有牛肉浸膏10g/L、胰蛋白胨5g/L，酪蛋白3g/L，葡萄糖5g/L，水溶性淀粉1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，无水醋酸钠3g/L，pH值用酸或碱进行调节控制，其余为水。不同量的培养液按照成分比例进行缩小和放大。

日本清酒酵母的菌种保藏号为ATCC26422，购于日本酿造协会的7号酵母。

步骤1：日本清酒酵母增菌培养

(1)在超净工作台上取试管斜面上的日本清酒酵母ATCC26422一环，接入装有50ml的pH为4.8±0.2的培养液的250ml三角瓶中，共接2瓶，200rpm，25℃培养48h，菌体处于指数生长期。

(2)将处于指数生长期的80ml菌体接种到装有2L，pH为4.8±0.2的培养液的2.5L三角瓶中，接种量为体积百分数的10％，200rpm，25℃培养48h。

(3)将步骤(2)培养后的3L菌种接种到装有30L，pH为4.8±0.2的培养液的50L一级种子罐中，通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

(4)将30L菌液转移到装有300L培养液的500L二级种子罐中；通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

步骤2：日本清酒酵母发酵培养

将300L二级种子罐中的日本清酒酵母培养液转接至装有2700L，pH为4.8±0.2的培养液的5000L发酵罐中，通气量维持在5m³/h/50L，200rpm，25℃培养48h。

步骤3：分离纯化

取步骤2的发酵培养液，进行离心除菌，保留上清液，即为日本清酒酵母发酵产物。

实施例3水解假丝酵母单独发酵

发酵基本培养液配方为：培养液中含有牛肉浸膏10g/L、胰蛋白胨5g/L，酪蛋白3g/L，葡萄糖5g/L，水溶性淀粉1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，无水醋酸钠3g/L，pH值用酸或碱进行调节控制，其余为水。不同量的培养液按照成分比例进行缩小和放大。

水解假丝酵母菌种编号为CICC 31239，购于上海市工业微生物研究所。

步骤1：水解假丝酵母增菌培养

在超净工作台上取水解假丝酵母CICC31239冻存液2ml接入装有2L，pH为7.8±0.2的培养液的2.5L三角瓶中，150rpm，25℃培养16h，菌体处于指数生长期后，将30L菌液接种到装有300L培养液的500L二级种子罐中。

步骤2：水解假丝酵母发酵培养

将300L水解假丝酵母增菌液转移转接至装有2700L，pH为7.8±0.2的培养液的5000L发酵罐中，150rpm搅拌，25℃培养24h。

步骤3：分离纯化

取步骤2的发酵培养液，进行离心除菌，保留上清液，即为水解假丝酵母发酵产物。实施例4实施例2和3的发酵产物混合获得的试剂

取实施例2和3的发酵产物，按照重量进行1:1比例混合而成的复合试剂。

实施例5成纤维细胞的细胞毒性检测(MTT检测法)

采用成纤维细胞MTT检测法进行细胞毒性检测。收集处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞，消化后接种至96孔板。取实施例1获得的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物，按照表1配置成不同浓度的受试物，并采用8％DMSO作为阳性对照。待细胞铺板率达到40％时，加入水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物，然后将培养板放置在37℃、5％的CO₂培养箱中培养。细胞孵育培养24h，弃掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加150μL二甲基亚砜，酶标仪490nm读取OD值。

表1测试浓度设定表

序号

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

⑧

浓度(v/v)

0.078％

0.156％

0.313％

0.625％

1.25％

2.5％

5％

10％

根据读取的OD值，代入计算公式：(给药孔OD-调零孔OD)/(对照孔OD-调零孔OD)×100％＝细胞活力，得到细胞活力检测结果见表2，细胞活力变化趋势如图1所示的细胞活力曲线。

表2样品细胞毒性检测结果

根据表2和图1所示，当水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在成纤维细胞上的添加浓度由1.25％增大至2.5％时，成纤维细胞的细胞活力明显下降，由84.5％骤降至41.19％；当共生发酵产物的浓度继续增大，细胞活力不断下降。

标准偏差分析：经过多次重复试验，对实验数据进行方差分析，发现水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在成纤维细胞上的添加浓度由0.078％-10％范围内变化时，标准偏差≤5.19％，实验结果精确度较高。

方差分析：经过多次重复试验，对实验数据进行方差分析，发现水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在成纤维细胞上的添加浓度由0.313％-10％范围内变化时，体现的成纤维细胞的细胞活力达到极显著差异(P值小于0.01)(具体数据略)。

实施例6成纤维细胞的细胞毒性形态学检测

根据实施例5的成纤维细胞的细胞毒性检测(MTT检测法)实验结果，选择如表3所示的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在成纤维细胞上添加的五个浓度进行形态学检测。

表3样品细胞毒性检测结果

设立样品组与溶剂对照组，每组设两个复孔。按相应的接种密度接种处于指数生长期的人成纤维细胞至24孔板中，37℃、5％的CO₂培养箱中孵育培养过夜。待24孔板细胞铺板率达到40％时，进行给药，样品组加入不同浓度共生发酵产物，溶剂对照组加入新鲜培养液，37℃、5％的CO₂培养箱中孵育培养24h。孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照，结果如图2所示。根据图2的形态学结果和毒性检测结果，水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物的添加浓度达到1.25％时，细胞形态开始发生变化，出现部分纤维细胞破坏的现象，因此共生发酵产物在成纤维细胞上的最大安全浓度为0.625％。由此可见水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液在制备促进胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸合成等护肤品制剂时的最佳添加浓度为0.625％。

实施例7基于成纤维细胞的荧光定量PCR检测

以1.8*10⁵/孔的接种密度，接种细胞至6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜；配制0.625％的发酵产物，以转化生长因子-β(TGF-β1)作为阳性对照。待6孔板中细胞铺板率达到50％左右时，进行给药。

实验设立4个样品组，1个溶剂对照组及1个阳性对照组，每组设4个复孔。4个样品组分别加入含有0.625％的实施例1的共生发酵产物的培养液、实施例2的日本清酒酵母单独发酵培养液、实施例3的水解假丝酵母单独发酵培养液和实施例4的发酵产物混合液，溶剂对照组加入新鲜培养液，阳性对照组加入含TGF-β1的培养液，37℃，5％CO₂培养箱分别孵育培养24h。孵育培养结束后，弃掉培养液，每孔加入1mL总RNA抽提试剂Trizol，吹打裂解细胞后，收样。

提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测。采用2^-△△CT方法进行结果计算，T-Test方法进行统计分析。

阳性对照组TGF-β1荧光定量PCR检测结果如表4和图3所示，样品组荧光定量PCR检测结果如表5和图4所示。

表4溶剂对照组和阳性对照组基因检测结果

表5溶剂对照组和样品组1基因检测结果

表6溶剂对照组和样品组2基因检测结果

表7溶剂对照组和样品组3基因检测结果

表8溶剂对照组和样品组4基因检测结果

由表4和图3可以看出，与溶剂对照相比，阳性对照组加入TGF-β1后，在50ng/mL的暴露剂量下，对CollagenⅠ、CollagenⅢ及CollagenⅣ的表达有显著促进作用，扩增倍数分别达到1.674、1.714和3.147倍；对Elastin基因和Fibrillin1基因的表达有显著促进作用，扩增倍数都分别达到2.1倍；对Has-1基因的表达有显著促进作用，扩增倍数达到7.627倍。经过多次反复试验，溶剂对照组和阳性对照组所得结果的标准偏差≤0.664％，实验结果精确度很高。对实验数据进行方差分析，发现溶剂对照相比和阳性对照组对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin和Fibrillin1基因的表达，体现扩增倍数到极显著差异(P值小于0.001)(具体数据略)。

与文献报道中，TGF-β1促进基质的形成与重建，说明本次检测有效。

由表5和图4可以看出，与溶剂对照相比，样品组1在0.625％水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物的添加剂量下，对CollagenⅠ、CollagenⅢ及CollagenⅣ的表达有显著促进作用，扩增倍数分别达到1.512、2.564、2.428倍；对Elastin基因和Fibrillin-1基因的表达有显著促进作用，扩增倍数分别达到2.152和1.833倍；对Has-1基因的表达有显著促进作用，扩增倍数高达11.024倍。经过多次反复试验，溶剂对照组和样品组所得结果的标准偏差≤1.787％，实验结果精确度很高。对实验数据进行方差分析，发现溶剂对照相比和样品组1对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin、Fibrillin1和Has-1基因的表达，体现扩增倍数到极显著差异(P值小于0.002)(具体数据略)。说明在0.625％的添加剂量下，水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵产物在肌肤抗衰老方面有比较优越的功效。

同时，由表6可以看出，与溶剂对照相比，样品组2在0.625％日本清酒酵母单独发酵产物的添加剂量下，对CollagenⅠ、CollagenⅢ及CollagenⅣ表达的促进作用不明显，对Elastin基因、Fibrillin-1基因和Has-1基因的表达也无明显促进作用。经过多次反复试验，溶剂对照组和样品组所得结果的标准偏差≤0.159％，实验结果精确度很高。对实验数据进行方差分析，发现溶剂对照相比和样品组2对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin、Fibrillin1和Has-1基因的表达，体现扩增倍数到极显著差异(P值小于0.002)(具体数据略)。说明添加0.625％日本清酒酵母单独发酵产物，在肌肤抗衰老方面功效并不明显。

由表7可以看出，与溶剂对照相比，样品组3在0.625％水解假丝酵母单独发酵产物的添加剂量下，对CollagenⅠ、CollagenⅢ及CollagenⅣ表达具有明显促进作用，扩增倍数分别达到1.305、1.882和1.989倍；对Elastin基因、Fibrillin-1基因和Has-1基因的表达也有明显促进作用，扩增倍数分别达到1.905、1.692和6.003倍。经过多次反复试验，溶剂对照组和样品组所得结果的标准偏差≤0.754％，实验结果精确度很高。对实验数据进行方差分析，发现溶剂对照相比和样品组3对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin、Fibrillin1和Has-1基因的表达，体现扩增倍数到极显著差异(P值小于0.002)(具体数据略)。说明添加0.625％水解假丝酵母单独发酵产物，在肌肤抗衰老方面有一定的功效，但其功效明显不如0.625％水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液。

由表8可以看出，与溶剂对照相比，样品组4在0.625％水解假丝酵母和日本清酒酵母的发酵产物混合液，对CollagenⅠ、CollagenⅢ及CollagenⅣ表达具有明显促进作用，扩增倍数分别达到1.313、1.841和1.953倍；对Elastin基因、Fibrillin-1基因和Has-1基因的表达也有明显促进作用，扩增倍数分别达到1.847、1.635和5.083倍。经过多次反复试验，溶剂对照组和样品组所得结果的标准偏差≤0.802％，实验结果精确度很高。对实验数据进行方差分析，发现溶剂对照相比和样品组4对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin、Fibrillin1和Has-1基因的表达，体现扩增倍数到极显著差异(P值小于0.001)(具体数据略)。说明添加0.625％水解假丝酵母和日本清酒酵母的发酵产物混合液，在肌肤抗衰老方面有一定的功效，但其功效明显不如0.625％水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液。

综上所述，本发明的水解假丝酵母和日本清酒酵母共生发酵液相对单独的日本清酒酵母发酵产物和水解假丝酵母发酵产物，以及发酵液混合后的试剂，对CollagenⅠ、CollagenⅢ、CollagenⅣ、Elastin、Fibrillin1和Has-1基因表达的促进作用，都具有显著的改善作用，可见两种菌共同培养具有相互促进和明显增效作用，活性物质的活性含量或活性都大大提高。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。