具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如本申请背景技术所分析的，现有技术的根霉和酵母组合发酵酿制的米酒由于酵母的存在导致浆水浑浊、口感发酸，而单一采用根霉发酵酿制的米酒存在酒味不足、甜腻、容易产黑孢子的缺点，导致目前的米酒综合感官不佳，为了解决该问题，本申请提供了一种根霉菌株、酒曲和米酒以及该酒曲的生产方法。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种根霉菌株，该根霉菌株的拉丁学名为 Rhizopus oryzae，保藏编号为CCTCC NO:2018596M5.57(以下称为根霉菌M5.57)。

本发明对上述根霉M5.57进行生理生化特性检测，检测结果与根霉Q303 基本一致。另外，经26S rDNAD1/D2鉴定分析，根霉M5.57与Rhizopus oryzae同源性高达 99％，结合生理生化特征，鉴定为米根霉菌。该根霉M5.57已于2018年9月5号保藏于中国典型微生物保藏中心，地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2018596M5.57。

保藏号为CCTCC M 2018596M5.57的米根霉26S rDNAD1/D2基因序列如下：

TAATAAATGTAATTCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGAGGAAAGAGCTCATGGTTGGA ACCTGTTTGGCCTAGCTAAACCGGATTGTAGACTGTAGAAGTGTTTTCCAGGCAAGCCGA GTAAATAAGTCCTTTGGAACAGGGCATCATATAGGGTGAGAATCCCGTCTTTGGCTTGAG CATTTGCCTTTTGTGATACGCTTTCAAAGAGTCAGGTTGTTTGGGAATGCAGCCTAAATTG GGTGGTAAATCTCACCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAAACCGATAGCGAACAAGTACCGT GAGGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTATGTGAAATTGTTAAA AGGGAACCGTTTGGAGCCAGACTGGCTTGTCTGTAATCAATCTAGGCTTCGGCCTGGATG CACTTGCAGGCTATGCCTGCCAACGACAATTTGACTTGAGGGAAAAAACTAAGGGAAAT GTGGCCCACTTGTGGGTGTTATAGTCCCTTAAAAATACCTTGGGTTGGATTGAGGAACGC AGCGAATGCTTTTTGGCGAGTTTTCCAGGAAGGTTTTCTGAGGTACTACGGTATCAAGGT TGATCTTTTTGGTTATACTTCTATTCGCTTAGGTTGTTGGCTTAATGACTCTAAATGACCCGTCTTGAAACACAGACCAAA。

利用上述根霉菌M5.57根据制作的米酒曲酿造的米酒，表面无黑孢子、浆水清澈、米酒酒度高(明显高于本领域常见根霉Q303和根霉3.866)，同时糖度也能达到较高水平，米酒酒香浓郁、口感甘甜浑厚、甜而不腻，米酒的综合感官更优。利用上述根霉菌M5.57制作的酒曲酿造的米酒，最适酒曲接种量为0.1～0.2％，相比现有市售酒曲推荐用量0.4～0.6％，酒曲用量明显降低，发酵效率更高。

在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种酒曲，含有根霉菌株，根霉菌株为上述任一种的根霉菌株。

利用上述米酒曲酿造的米酒，表面无黑孢子、浆水清澈、米酒酒度高，同时糖度也能达到较高水平，米酒酒香浓郁、口感甘甜浑厚、甜而不腻，米酒的综合感官更优。

在本申请一种优选的实施例中，上述酒曲中根霉菌株含量为10⁵～10⁶CFU/g酒曲。

为了保持米酒曲的活性持久性，优选上述酒曲的含水量为6～12％。

上述酒曲可以尝试用于多种形式的酒曲制作，优选该酒曲为米酒曲。

在本申请又一种典型的实施方式中，提供了一种上述任一种酒曲的生产方法，该生产方法包括：步骤S1，采用液态培养法对根霉菌株进行扩大培养，得到菌液；步骤S2，当菌液湿重达到18～25％时，将菌液转接至固体培养基中进行固态发酵，得到酒曲。

现有米酒曲生产厂商大多采用麸皮瓶种子转接米粉扩大培养得到酒曲的工艺，但麸皮瓶种子接种工作量大，周期长，同时麸皮颗粒较大，制作的米酒中容易出现麸皮杂质，对消费者感官影响较大，本申请采用液态培养法提高了根霉菌株的扩大培养效率，不采用麸皮因此所得米酒中不含麸皮杂质。利用所得到的米酒曲酿造的米酒，表面无黑孢子、浆水清澈、不含麸皮杂质，米酒酒度高，同时糖度也能达到较高水平，米酒酒香浓郁、口感甘甜浑厚、甜而不腻，米酒的综合感官更优。

为了更精确地控制酒曲产品质量，优选上述菌体湿重达到20％时进入固态发酵程序。

在一种实施例中，上述步骤S1包括：以0.2～0.5％的接种量将孢子悬浊液接入发酵罐液态培养基上进行发酵培养，得到菌液，孢子悬浊液中孢子浓度为10³～10⁵CFU/ml，优选发酵培养的培养温度为30～40℃，优选在发酵培养中维持溶解氧含量为30～60％，优选发酵培养的时间为20～24h，优选以质量百分含量计，发酵罐液态培养基包括5～7％玉米粉、2～5％大豆粉、 0.1～0.4％聚2,6-二甲基-1,4-苯醚、0.05～0.3％聚硅氧烷和余量的水。

上述发酵培养过程中，通过控制培养温度、溶解氧含量以及发酵时间调整发酵程度，进而获得所需浓度的菌液。最为优选上述培养温度为33℃，通过控制液态培养基的搅拌转速为300r/min，通气量1:0.85维持溶氧量在上述范围内。

在一种实施例中，上述生产方法还包括孢子悬浊液的制备过程，该制备过程包括：将根霉菌株的斜面孢子在茄子瓶中进行一级种子扩大培养，得到含孢子培养物，优选一级种子扩大培养采用的培养基为PDA培养基；采用无菌水洗涤含孢子培养物得到孢子浓度为10³～10⁵CFU/ml的孢子悬浊液。上述一级种子扩大培养的温度同上述发酵培养的温度。上述过程中的具体操作均可参考现有技术，在此不再赘述。

在本申请另一种实施例中，上述步骤S2包括：用无菌水将菌液稀释10～20倍，得到稀释菌液；按稀释菌液和固体培养基比重为1:2～1:5的比例将稀释菌液转接至固体培养基上进行固态发酵，得到酒曲，优选固体培养基为米粉，在固态发酵过程中，优选控制发酵体系的含水量为25～55％(由于发酵体系以米粉为主，因此通常也成为米粉含水量)，优选控制发酵温度为30～42℃，优选控制发酵时间为40～48h；可选地，将酒曲干燥至含水量为6～12％。通过上述发酵条件的控制，可以进一步提高根霉的生物活性，得到根霉含量较高的酒曲。

进一步地，优选菌液用无菌水稀释倍数为15倍；稀释菌液和米粉比重为1:4；控制米粉含水量为30％；固态发酵时间为40h；干燥后的发酵培养基水分为7％。

在本申请又一种典型的实施方式中，提供了一种米酒，含有根霉菌株，该根霉菌株上述任一种的根霉菌株；或者该米酒采用酒曲酿制而成，该酒曲为上述任一种的酒曲。

本申请的米酒，表面无黑孢子、浆水清澈、不含麸皮杂质，米酒酒度高，同时糖度也能达到较高水平，米酒酒香浓郁、口感甘甜浑厚、甜而不腻，米酒的综合感官更优。

以下将结合实施例和对比例，进一步说明本申请的有益效果。

根霉菌的筛选。

将甘肃地区采集的土曲样品在干净三角瓶内碾碎，用无菌水稀释到10^-2～10^-4g/ml，涂布于含青霉素钠50u/ml的PDA平板培养基，32h待菌丝蔓延开，选取具有典型根霉特征、且菌丝粗壮的菌落，用接种铲切取菌丝边缘转接平板继续培养，多次重复纯化根霉，斜面0～4℃保藏，将斜面根霉菌丝挑取3环转接PDA液态摇瓶培养18h，得到菌液，利用无菌水将菌液吸收15倍，按稀释菌液和米粉比重为1：4将液态种子转接米粉，维持品温30～38℃培养42h，干燥得到纯种米粉根霉样品。

将米粉根霉样品按照0.4％接种量制作米酒酒酿，检测米酒产黑孢子状况、浆水浑浊情况、口感测试以及理化指标(糖度、酸度、酒度)等因素，最终筛选出一株根霉菌M5.57。

根霉菌M5.57的真菌学性质见表1。

表1

本发明的根霉具有上述真菌学性质，结果确定上述菌株属于根霉属。

酒曲的生产

实施例1

将根霉菌M5.57斜面转接1环到PDA茄子瓶培养4d，得到含孢子培养物；无菌水洗涤该含孢子培养物至孢子浓度为10³～10⁵CFU/ml的孢子悬浊液，按照0.25％接种量接入发酵罐液态培养基，培养温度33℃，转速300r/min，通气量1:0.85，维持溶氧30～60％，培养22h，菌液湿重达到20％，将菌液用无菌水稀释15倍，按稀释菌液和米粉比重为1:4转接米粉，控制米粉含水量为30％，维持品温30～42℃，固态发酵40h，最后将发酵培养基干燥至含水量为 7％左右，得到的干燥样品即为实施例1的米酒曲产品。

实施例2

将本发明所述根霉斜面转接1环到PDA茄子瓶培养3d，无菌水洗涤至孢子浓度为10³-10⁵CFU/ml制备孢子悬浊液，按照0.1％接种量接入发酵罐液态培养基，培养温度33℃，转速300r/min，通气量1:0.85，维持溶氧30～60％，培养24h，菌液湿重达到18～25％，将菌液用无菌水稀释10倍，按稀释菌液和米粉比重为1:2转接米粉，控制米粉含水量为40％，维持品温30～42℃，固态发酵42h，最后将发酵培养基干燥至含水量为6％左右，得到的干燥样品即为实施例2的米酒曲产品。

实施例3

将本发明所述根霉斜面转接1环到PDA茄子瓶培养3d，无菌水洗涤至孢子浓度为10³-10⁵CFU/ml制备孢子悬浊液，按照0.1％接种量接入发酵罐液态培养基，培养温度33℃，转速300r/min，通气量1:0.85，维持溶氧30～60％，培养22h，菌液湿重达到18～25％，将菌液用无菌水稀释12倍，按稀释菌液和米粉比重为1:5转接米粉，控制米粉含水量为25％，维持品温30～42℃，固态发酵48h，最后将发酵培养基干燥至含水量为9％左右，得到的干燥样品即为实施例3的米酒曲产品。

对比例

分别采用安琪风味型甜酒曲、根霉M101、根霉3077、根霉Q303、根霉3.866替换实施例 1的根霉菌M5.57，制作对比例1至5的米酒曲产品。

米酒的酿制

1)原料：糯米(市售优质品)，酒曲

2)工艺流程：

采用精白优质大糯米。通过泡米4h进行浸米，浸米时保持颗粒完整而米酥(即用手指捏米粒成粉状，无粒心)，米吸水量约为25％。然后对浸米后的糯米进行洗涤，沥干。接着进行蒸饭，常压(101kPa)下上汽蒸30分钟，要求蒸过的糯米内软外硬，内无白心，透而不烂，均匀一致，无不熟或过烂现象。采用无菌冷水淋饭进行摊凉。然后将冷却的糯米与酒曲搅拌均匀；酒曲的加入量为干糯米重的0.4％。最后进行糖化发酵，温度保持在30℃～32℃，发酵40小时即可。

采用不同的酒曲通过上述过程制备米酒。并对米酒的糖度、酸度和酒度进行检测，其中，糖度检测方法：参考GB/T 5009.7-2008食品中还原糖的测定；酸度检测方法：参考GB/T 12456-2008食品中总酸的测定；酒度检测方法：参考GB 5009.225-2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定。并招募30名米酒爱好者，对米酒进行感官评价。不同样品米酒检测结果见表2。

表2

由表2可知，上述酒曲制作的米酒中，仅实施例1根霉M5.57满足做米酒酒度、糖度达到较高水平，且无孢子、浆水清澈的需求，说明本发明筛选的根霉M5.57特别在提升米酒酒香味、降低米酒酸味具有较强的优势，制作的米酒，甜酸协调、醇香浓郁。

另外，将实施例1制作的米酒曲与麸皮种工艺生产的米酒曲制作米酒酒酿，对比米酒外观、口感以及酒曲最适用量，研究结果见表3。

麸皮种工艺生产的米酒曲工艺如下：

将根霉菌M5.57斜面转接1环到PDA茄子瓶培养4d，得到含菌丝、孢子培养物，挑取2-3环菌丝到已经灭菌含50％水分麸皮三角瓶中，培养5d，将麸皮按照0.1％接种量转接米粉控制米粉含水量40％，维持品温30～42℃，固态发酵48h，最后将发酵培养基干燥至含水量为 9％左右，得到的干燥样品。

表3

由表3可知，本发明工艺制作的米酒曲酿造的米酒浆水更清澈、无杂质，口感更甜，酒曲用量明显减少，同时本发明工艺对杂菌控制程度更高，制作的酒曲品质更稳定。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

利用上述根霉菌M5.57根据制作的米酒曲酿造的米酒，表面无黑孢子、浆水清澈、米酒酒度高(明显高于本领域常见根霉Q303和根霉3.866)，同时糖度也能达到较高水平，米酒酒香浓郁、口感甘甜浑厚、甜而不腻，米酒的综合感官更优。利用上述根霉菌M5.57制作的酒曲酿造的米酒，最适酒曲接种量为0.1～0.2％，相比现有市售酒曲推荐用量0.4～0.6％，酒曲用量明显降低，发酵效率更高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安琪酵母股份有限公司

<120> 根霉菌株、酒曲和米酒以及该酒曲的生产方法

<130> PN125631

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> 根霉(Rhizopus oryzae)

<400> 1

taataaatgt aattccctag taacggcgag tgaagaggaa agagctcatg gttggaacct 60

gtttggccta gctaaaccgg attgtagact gtagaagtgt tttccaggca agccgagtaa 120

ataagtcctt tggaacaggg catcatatag ggtgagaatc ccgtctttgg cttgagcatt 180

tgccttttgt gatacgcttt caaagagtca ggttgtttgg gaatgcagcc taaattgggt 240

ggtaaatctc acctaaagct aaatattggc gagaaaccga tagcgaacaa gtaccgtgag 300

ggaaagatga aaagaacttt gaaaagagag ttaaacagta tgtgaaattg ttaaaaggga 360

accgtttgga gccagactgg cttgtctgta atcaatctag gcttcggcct ggatgcactt 420

gcaggctatg cctgccaacg acaatttgac ttgagggaaa aaactaaggg aaatgtggcc 480

cacttgtggg tgttatagtc ccttaaaaat accttgggtt ggattgagga acgcagcgaa 540

tgctttttgg cgagttttcc aggaaggttt tctgaggtac tacggtatca aggttgatct 600

ttttggttat acttctattc gcttaggttg ttggcttaat gactctaaat gacccgtctt 660

gaaacacaga ccaaa 675