一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用
阅读说明：本技术 一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用 (Candida planiformis and isolated culture method and application thereof ) 是由 李良 胡申才 杜艾明 李俊薇 董孝元 于 2021-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用；属于酿酒技术领域。它解决了现有清香型白酒中杂醇油含量高、健康功能因子含量低等技术问题。本酵母命名为扁平云假丝酵母(Candida humilis)YCT03CH菌株,保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉大学),保藏时间为2021年5月17日,保藏编号为CCTCC M 2021545,地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号。该菌株分离自黄鹤楼酒业有限公司清香酒醅,其除具有低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的优良特性外,还具有良好的同化广谱性碳、氮源能力；也发现该菌株能增加乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、愈创木酚等风味物质或健康因子的含量；因此该菌种作为强化菌使用可提高清香型白酒生产原酒的质量。(The invention provides candida planifolia and a separation culture method and application thereof; belongs to the technical field of wine brewing. The method solves the technical problems of high fusel oil content, low content of health functional factors and the like in the existing fen-flavor liquor. The yeast is named as Candida applanata (Candida humulis) YCT03CH strain, the preservation unit is China center for type culture Collection (Wuhan university), the preservation time is 2021 year, 5 months and 17 days, the preservation number is CCTCC M2021545, and the addresses are as follows: eight-way No. 299 in Wuchang area of Wuhan city, Hubei province. The strain is separated from fragrant fermented grains of Huang He Lou Ji wine industry Co., Ltd, has the excellent characteristics of low n-propanol yield and high tetramethylpyrazine yield, and also has good capability of assimilating broad-spectrum carbon and nitrogen sources; the strain is also found to increase the content of flavor substances or health factors such as ethyl acetate, ethyl lactate, ethyl benzoate, phenethyl alcohol, guaiacol and the like; therefore, the strain can be used as an enhanced strain to improve the quality of the original liquor produced by the fen-flavor liquor.)
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，涉及一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用，特别是一种低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用。
背景技术
清香型作为中国白酒三大香型之一，广受饮酒消费者喜爱。清香型白酒是以高粱为原料，中温大曲为糖化发酵剂，将蒸煮后的高粱拌入低温大曲和辅料置于地缸或槽车中发酵28天，期间发生着边糖化边发酵的缓慢生化反应而形成具有独特风格的白酒。在发酵过程中，会产生各种酸、酯、醇、醛等风味物质，也会产生一些吡嗪、愈创木酚和萜类等活性健康因子。但传统酿造工艺酿造的清香型白酒普遍也存在着杂醇油含量高、健康功能因子含量低等弊端。
杂醇油是三个碳以上的一元醇类物质的总称，属于高级醇，它们是白酒中重要的组成成分，含量过低会改变白酒风味，但白酒中如果杂醇油含量过高，不仅对人体有害，而且还给酒的风味带来邪杂味。杂醇油是中国白酒苦味或涩味的主要来源之一，同时杂醇油也是造成我国白酒出现白色浑浊的原因之一。白酒中杂醇油含量最大的是异戊醇、异丁醇、正丙醇等，含量约占总醇含量的50％以上。高级醇在人体内氧化速度较乙醇慢,停留时间长, 会引起头痛,神经系统充血等症状，杂醇油含量高是导致人醉酒上头的主要原因之一。国标规定，白酒中的杂醇油含量不得超过 0.20g/100ml(以异丁醇，异戊醇计)。酒中杂醇油的生成主要由氨基酸分解代谢和糖代谢产生，两条合成路径在发酵过程中是同时存在的。降低高级醇含量主要从抑制这两条路径入手，比如通过控制工艺条件，例如发酵温度、初始pH值、起始糖度等来降低酒中高级醇含量，亦可以通过选择适宜的菌种及接种量、合适的外源添加物，或采取一定的物理技术进行催陈处理等，均有利于降低酒中高级醇的含量。
四甲基吡嗪是中国白酒中广泛存在的微量成分，能赋予酒体以咖啡和坚果的独特香气，还能发挥抗氧化、提高免疫力和防止肝、肺纤维素化等多种生理作用。因此，四甲基吡嗪已公认为是白酒中有益于健康的一类风味活性功能物质。目前现有技术中还缺少一种针对性强的低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的优良酵母，因此，开发一种选育低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的优良酵母的方法，对提升白酒品质具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有的技术存在的上述问题，提供一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种能降低正丙醇、提高四甲基吡嗪在原酒中含量的酵母。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母，所述低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母命名为扁平云假丝酵母(Candida humilis)YCT03CH菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏时间为2021年5月17日，保藏编号为CCTCC M 2021545，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号。
本扁平云假丝酵母菌株是从清香型白酒发酵酒醅中分离筛选得到的；其在降低白酒中危害因子正丙醇含量，并提高健康因子四甲基吡嗪含量方面具有优良特性，其还具有良好的同化广谱性碳、氮源能力；还能增加乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、愈创木酚等风味物质或健康因子的含量，该菌种用于清香型白酒生产对提高原酒的品质具有重要的意义。
本发明提供一种如上所述的低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母的分离培养方法，所述分离培养方法包括如下步骤：
(1)分别称取10g不同发酵阶段酒醅于90mLYPD培养液中进行震荡富集培养；
(2)将步骤(1)富集培养后的上清液依次稀释至10-5浓度；
(3)将步骤(2)制备得到的分别吸取0.1mL稀释菌液涂布于WL固体培养基上进行培养，获得菌落；
(4)挑取步骤(3)中形态规则的菌落在孟加拉红固体培养基上进行划线分离纯化，获得单个纯种菌落，并采用26SrRNA同源性比较分析法进行菌种分类鉴定。
(5)将酵母纯菌株活化后，取菌液于高粱糖化液中，28℃培养箱静置发酵7d；
(6)采用HS–SPME–GC–MS技术对发酵液进行代谢产物分析。
优选地，所述清香型白酒发酵酒醅为黄鹤楼酒业有限公司生产的清香型白酒发酵酒醅。
优选地，步骤(1)中所述不同发酵阶段酒醅的发酵时间为 5-28天。
优选地，步骤(1)中所述培养的温度为28-30℃，例如28℃、 29℃或30℃等。
优选地，步骤(1)中所述摇床震荡转数为150-250r/min；
优选地，步骤(1)中所述培养时间为4-8h。
优选地，步骤(3)中是将步骤(2)得到的菌悬液稀释，用移液器分别吸取10-3、10-4、10-5稀释液涂布于WL固体培养基上进行培养。
优选地，步骤(4)所述分离纯化的方法为：挑取步骤(2) 中形态规则的菌落在孟加拉红固体培养基上划线分离纯化，需进行5-10次(5次、6次、7次、8次、9次或10次等)重复的操作达到分离纯化的目的。
优选地，步骤(4)所述筛选是采用26SrDNA序列同源性分析法进行筛选，其具体操作方法为：提取酵母的基因组，用酵母菌 26SrDNAD1/D2片段NL1和NL4为扩增引物，从酵母的基因组DNA 扩增其26SrDNA序列，将扩增成功的PCR产物进行测序，并在NCBI 数据库中进行BLAST序列比对。
优选地，步骤(5)所述的采用高粱发酵液对纯酵母菌株进行发酵，其具体操作方法为：将调整菌液浓度为1×108cfu/mL，取 1mL菌液于100mL高粱糖化液中，28℃培养箱静置发酵7d。
优选的，步骤(1)中所述YPD培养液按质量百分比计包括如下组分：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％,其余为无菌水。
优选的，步骤(3)中所述WL固体培养基按g/L计包括如下组分：酵母浸粉5.0，酸水解酪蛋白5.0，葡萄糖50.0，磷酸二氢钾0.55，氯化钾0.425，氯化钙0.125，硫酸镁0.125，氯化铁 0.0025，硫酸锰0.0025，溴甲酚绿0.022，琼脂17.0，其余为无菌水。
优选的，步骤(4)中所述孟加拉红固体培养基按g/L计包括如下组分：蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁 0.5，孟加拉红0.0333，氯霉素0.1，琼脂20.0，其余为无菌水。
优选的，步骤(5)中所述的高粱糖化液制备方法为：粉碎后按高粱：水＝1：4的比例混匀，煮沸后纱布过滤去除液体，固体中加入液化酶，90℃保温1h，随后冷却60℃加入糖化酶，保温糖化2h，搅拌均匀后过滤，将滤液用水稀释至最终糖浓度10 °B×(75±5g/L)，并在使用前于115℃灭菌20min；步骤(6) 中所述的检测分析方法为：将发酵液，取8mL置于20mL顶空瓶中，加入3gNaCl饱和，再加入10μL混合内标(丙酸辛酯，终浓度为 60.42μg/L；L-薄荷醇，终浓度为125.47μg/L)，密封后进行 HS–SPME–GC–MS分析。
本发明还提供一种如上所述的低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母在酿酒中的应用。其应用方案为：
(1)原料粉碎：高粱通过辊式粉碎机破碎成4～8瓣即可，其中能通过1.2mm筛孔的细粉占20～45％，粗粉占55～80％左右。整粒高粱不超过0.3％；同时要根据气候变化调节粉碎细度，冬季稍细，夏季稍粗，以利于发酵升温。
(2)润糁：高温润糁是将粉碎后的高粱加入原料质量 50％-65％的热水，夏天水温70-83℃，冬季为75-95℃，拌匀后堆积润料12-25h。
(3)蒸料：蒸料前，先煮沸底锅水，在甑篦上撒一层稻壳或谷壳，然后装甑上料，加水量为原料量的1.5～3％。整个蒸煮时间约需80min左右，初期品温在98～99℃，以后加大蒸汽，品温会逐步升高，出甑前可达105℃左右。
(4)加水、扬冷、拌曲：蒸后的红糁应趁热出甑并摊成长方形，泼入原料量30％左右的冷水，使原料颗粒分散，进一步吸水。随后翻拌，通风凉渣。然后加入占原料量一定比例的大曲和占大曲用量一定比例的酵母菌悬液。
优选地，步骤(4)中所述占原料用量一定比例的大曲是指8～ 13％；
优选地，步骤(4)中所述占大曲用量一定比例的酵母是指3～ 9％，如3％、6％和9％。
(5)发酵：入坛密封发酵，发酵温度25～30℃，发酵时间 28d。
与现有技术相比，本发明中的酵母能够降低正丙醇、提高四甲基吡嗪在原酒中的含量。其除具有低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的优良特性外，还具有良好的同化广谱性碳、氮源能力；也发现该菌株能增加乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、愈创木酚等风味物质或健康因子的含量；因此该菌种作为强化菌使用可提高清香型白酒生产原酒的质量。
附图说明
图1是本发明中的酵母在光学显微镜下单细胞形态图(放大倍数10×40)。
图2是本发明中的酵母在孟加拉红培养基上的菌落形态图。
图3是酵母YCT03CH菌株对不同碳源的利用情况。
图4是扁平云假丝酵母YCT03CH菌株对不同氮源的利用情况。
图5是扁平云假丝酵母YCT03CH菌株降解利用正丙醇的能力。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。这些实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制。
实施例一
本实施例提供一种低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母，该低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的酵母命名为扁平云假丝酵母 (Candida humilis)YCT03CH菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏时间为2021年5月17日，保藏编号为CCTCC M2021545，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299 号。该酵母是从清香型白酒发酵酒醅中分离筛选得到的。
如图1所示，本酵母在光学显微镜下单细胞形态图(放大倍数 10×40)，光学显微镜下单细胞呈椭圆形，芽殖，有假菌丝。如图 2所示，本酵母菌株(Candida humilis)YCT03CH在培养基上的菌落形态：菌落为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，呈奶油状。
实施例二
酒醅中酵母菌的分离与鉴定
本实施例主要针对清香型白酒的酒醅进行酵母菌的分离，其分离培养方法包括如下步骤：
(1)称取10g不同发酵阶段酒醅于90mLYPD培养液中进行震荡富集培养；
(2)将步骤(1)富集培养后的上清液依次稀释；
(3)将步骤(2)制备得到的分别吸取0.1mL稀释菌液涂布于WL 固体培养基上进行培养，获得菌落；
(4)挑取步骤(3)中形态规则的菌落在孟加拉红固体培养基上进行划线分离纯化，获得单个纯种菌落，并采用26SrRNA同源性比较分析法进行菌种分类鉴定。
所述酵母菌种分子鉴定的操作为：提取上述酵母基因组，用酵母菌26SrDNAD1/D2片段NL1和NL4为扩增引物，从酵母的基因组DNA扩增其26SrDNA序列，将扩增成功的PCR产物送至上海生工进行测序，并在NCBI数据库中进行BLAST序列比对。所有分离得到的146株酵母鉴定结果如表1所示。
表1 酒醅中分离得到的酵母菌种类及数量
由表1可知：从清香型白酒酿造酒醅中共分离得到146株菌，其中分离到了19株扁平云假丝酵母(Candida humilis)。其中扁平云假丝酵母(Candida humilis)YCT03CH菌株26S rDNA序列为：
CACGGGGCATGCCTCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAA TTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGGCGA CTTTGGGGCGGCTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCCGTGTAAAGCGCTCT CGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATT CCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAG TGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGT GAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGC CCCCCGCTCCTCGTGGGTGGGGGACTCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCA TCAGTTTTGGCGGCCGGACAAAACTGCAGGAACGTAGCTTGCTTCGGG AAGTGTTACAGCCTGCAGGAATACGGCCAGCCGGGACTGAGGAATGC GATTCGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTAA。
将上述分离纯化鉴定的酵母菌纯菌株活化后，取菌液于高粱糖化液中，28℃培养箱静置发酵7d后，离心取发酵上清液，再采用HS–SPME–GC–MS对上清液进行代谢产物分析。
制备高粱糖化液，其制备方法为：粉碎后按高粱：水＝1：4 的比例混匀，煮沸后纱布过滤去除液体，固体中加入液化酶，90℃保温1h，随后冷却60℃加入糖化酶，保温糖化2h，搅拌均匀后过滤，将滤液用水稀释至最终糖浓度10°B×(75±5g/L)，并在使用前于115℃灭菌20min。
代谢产物分析操作方法为：将发酵液于4℃，8000×g离心 5min，取上清备用。预先在顶空瓶(20mL)加入3gNaCl，再分别取8mL上清液加入瓶中进行萃取后采用HS-SPME-GC-MS分析，以 10μL混合内标(丙酸辛酯，终浓度为60.42μg/L；L-薄荷醇，终浓度为125.47μg/L)作为参照物。其中，a:HS-SPME萃取条件：三相萃取头(DVB/CAR/PDMS,50/30μm)，50℃预热5min，吸附萃取45min，GC解吸10min。b:GC-MS分析条件：色谱柱为DB-WAX (60m×0.25mm×0.25μm)；升温程序为初始温度50℃，保持2min，然后以6℃/min升温至230℃，保持15min；不分流进样，进样量 1μL；进样口和检测器温度均为250℃；载气为He，流速2mL/min； MS检测器采用EI电离源，离子源温度为230℃，电子轰击能量为 70eV；扫描范围：35～350amu。
表2 不同酵母菌所代谢产生的正丙醇和四甲基吡嗪的含量
由表2可知，在采用高粱糖化液对酒醅中分离的5种不同酵母菌进行发酵后，扁平云假丝酵母比酒醅中分离得到其它4种酵母代谢产生的正丙醇含量低10倍以上；扁平云假丝酵母代谢产生的四甲基吡嗪含量最高，达到了10.46mg/L。
实施例三：
扁平云假丝酵母同化碳源能力
将实施例二中的扁平云假丝酵母YCT03CH菌株活化后，接入分别含有0.5％的8种不同碳源(蔗糖、乳糖、半乳糖、甲醇、正丙醇、乳酸、柠檬酸、可溶性淀粉)的无碳源基础培养液中进行同化碳源试验。置28℃培养1～2周，并以含葡萄糖的基础培养液作对照。
所述的无碳源基础培养液成分及含量为:(NH4)2SO4 0.5g, KH2PO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，酵母膏0.02g，加蒸馏水至100 mL。
由图3可知，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、乳糖均能被扁平云假丝酵母YCT03CH菌株利用。
实施例四：
扁平云假丝酵母同化氮源能力
将实施例二中的扁平云假丝酵母YCT03CH菌株活化后，接入分别含有0.5％的8种不同碳源(蔗糖、乳糖、半乳糖、甲醇、正丙醇、乳酸、柠檬酸、可溶性淀粉)的无氮源基础培养液中进行同化碳源试验。置28℃培养1～2周，以(NH4)2SO4作对照。
所述的无氮源基础培养液成分及含量为:葡萄糖2g，KH2PO4 0.1g，19,MgSO4·7H2O0.05g，酵母膏0.02g，加蒸馏水至100 mL。
由图4可知，扁平云假丝酵母YCT03CH菌株对(NH4)2CO3利用率低，但对NH4Cl、KNO3、NH4H2PO4等无机氮源利用率高。
实施例五：
菌株扁平云假丝酵母对正丙醇的降解利用
将实施例二中的扁平云假丝酵母YCT03CH菌株按1％(体积分数)的接种比例接至100mL含终浓度为0.01g/mL正丙醇液体无机盐培养液中，并补充相同浓度的(NH4)2SO4后于28℃，200 rpm/min摇床培养。每间隔24h取样1mL测定OD600绘制生长曲线，同时取样1mL后使用孔径0.22μm过滤器过滤，留待GC检测正丙醇含量。
所述GC检测条件为：Agilent 7890A气相色谱仪，色谱柱 Agilent DB-WAX(30m×0.32mm，0.5μm)，检测器为氢火焰离子化检侧器(FID)，色谱条件为：进样口温度250℃，液体直接进样，进样量2μL，检测器温度250℃，载气为氮气，流量1.0 mL/min。程序升温：45℃保持7min，以5℃/min速率升至140 ℃，以8℃/min速率升至240℃。
由图5可知，扁平云假丝酵母YCT03CH菌株在3d内的OD600以及正丙醇的浓度几乎不变，此时处于生长迟缓期；在4-6d内，菌株生长迅速，菌液OD600接近1.32，与此同时，底物正丙醇的浓度开始明显下降，最后趋近于0.18mg/mL。与此同时，对照组的OD600时终维持在0左右，正丙醇的浓度时终维持在10mg/mL。证明YCT03CH菌株能以正丙醇为唯一碳源和能源生长。
实施例六：
扁平云假丝酵母菌在模拟白酒固态发酵中的应用
将实施例二中低产正丙醇、高产四甲基吡嗪的扁平云假丝酵母YCT03CH菌株模拟清香型白酒酿酒工艺进行了发酵应用。实施方案如下：
(1)原料粉碎：高粱通过辊式粉碎机破碎成4～8瓣即可，其中能通过1.2mm筛孔的细粉占20～45％，粗粉占55～80％左右。整粒高粱不超过0.3％。同时要根据气候变化调节粉碎细度，冬季稍细，夏季稍粗，以利于发酵升温。
(2)润糁：高温润糁是将粉碎后的高粱加入原料质量50％-65％的热水，夏天水温70-83℃，冬季为75-95℃，拌匀后堆积润料 12-25h。
(3)蒸料：蒸料前，先煮沸底锅水，在甑篦上撒一层稻壳或谷壳，然后装甑上料，加水量为原料量的1.5～3％。整个蒸煮时间约需80min左右，初期品温在98～99℃，以后加大蒸汽，品温会逐步升高，出甑前可达105℃左右。
(4)加水、扬冷、拌曲：蒸后的红糁应趁热出甑并摊成长方形，泼入原料量30％左右的冷水，使原料颗粒分散，进一步吸水。随后翻拌，通风凉渣。然后加入占原料量一定比例的大曲和占大曲用量一定比例的酵母菌悬液。
优选地，步骤(4)中所述占原料用量一定比例的大曲是指8～ 13％；
优选地，步骤(4)中所述占大曲用量一定比例的酵母是指3～ 9％，如3％、6％和9％。
(5)发酵：入坛密封发酵，发酵温度25～30℃，发酵时间28d。
表3所示实验结果表明在清香型白酒固体发酵工艺中在拌曲时将扁平云假丝酵母YCT03CH菌株作为强化菌按一定比例(如： 3％、6％和9％)加入，发酵28天后，与没加强化菌的对照组相比，正丙醇含量明显降低，四甲基吡嗪含量也得到明显增加。而且还发现既能增加乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、愈创木酚等风味物质或健康因子的含量，也能降低杂醇油中另一成分异戊醇的含量。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种天然酵母的制备方法