一种复合菌剂及其对芘-重金属复合污染环境的修复
阅读说明：本技术 一种复合菌剂及其对芘-重金属复合污染环境的修复 (Complex microbial inoculant and restoration of pyrene-heavy metal complex polluted environment by complex microbial inoculant ) 是由 刘其友 苏玉华 孙烁 赵朝成 王志伟 于 2021-04-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于环境中多环芳烃-重金属复合污染环境生物修复技术领域,具体涉及一种复合菌剂、菌剂的制备方法及其在多环芳烃芘-重金属复合污染环境领域的应用。本发明提供了2株具有重金属和多环芳烃芘修复能力的菌株,1株是假单胞菌(Pseudomonas sp.)YH-1,1株是红球菌(Rhodococcus sp.)YH-3,均从胜利油田长期受石油污染的土壤中筛选而得。本发明所述复合菌剂具有芘降解能力及耐重金属Cr的特性,通过2株菌之间的协同作用,提高多环芳烃芘的降解率的同时,可以吸附转化重金属Cr。2株菌制备成的复合菌剂在水体及土壤多环芳烃-重金属复合污染环境的生物修复方面具有应用前景。(The invention belongs to the technical field of bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon-heavy metal combined polluted environment in the environment, and particularly relates to a compound microbial inoculum, a preparation method of the microbial inoculum and application of the compound microbial inoculum in the field of polycyclic aromatic hydrocarbon pyrene-heavy metal combined polluted environment. The invention provides 2 strains with heavy metal and polycyclic aromatic hydrocarbon pyrene repairing capability, wherein 1 strain is Pseudomonas sp YH-1, 1 strain is Rhodococcus sp YH-3, and the strains are screened from soil polluted by petroleum in a Shengli oil field for a long time. The composite microbial inoculum has the characteristics of pyrene degradation capability and heavy metal Cr resistance, and can adsorb and convert heavy metal Cr while improving the degradation rate of polycyclic aromatic hydrocarbon pyrene through the synergistic effect of 2 strains of bacteria. The compound microbial inoculum prepared from 2 strains has application prospect in the aspect of bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon-heavy metal compound polluted environment of water and soil.)
技术领域
本发明属于环境中多环芳烃-重金属复合污染环境生物修复技术领域，涉及一种由假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)YH-1和红球菌属(Rhodococcus sp.)YH-3构成的复合菌剂，具体包括复合菌剂的制 备方法及其在多环芳烃芘-重金属复合污染环境生物修复领域的应用。
背景技术
随着工业化发展进程的不断加快，环境污染问题越发复杂和严重。多环芳烃和重金属是环境中两种 典型的持久性污染物，常常同时存在于环境中，相互作用形成复合污染，对生态环境造成严重影响，同时 也对人类健康构成重大危害。
火山爆发、森林火灾等自然过程和废水灌溉、石油或煤炭生产加工等人为活动造成的污染环境中， 经常能同时检测到多环芳烃和一些重金属如铅、铜、铬等。复合污染环境中多环芳烃和重金属之间的相互 作用增加了修复的难度，因此，仅针对单一污染物进行修复往往不能达到污染环境修复的要求。
多环芳烃和重金属的修复方法主要有物理法、化学法和生物法。物理和化学修复法存在其缺点，如 修复成本较高、易产生二次污染等。近些年，生物修复技术因具有环境友好、操作性强、成本低等优点而 成为环境领域研究的热点。微生物是环境中丰富可持续的资源，在环境污染修复方面具有巨大的潜力，许 多微生物能够降解多环芳烃或具有重金属抗性，然而，目前对于能够修复多环芳烃-重金属复合污染环境的 微生物报道较少，并且一种菌株通常只能降解一种污染物，且环境适应性差，降解效果不理想。所以，对 于多环芳烃-重金属复合污染环境的修复，单一菌株往往修复效果不理想或不能实现。
因此，研究一种成本低、环境友好、效率高的复合微生物菌剂对于多环芳烃-重金属复合污染环境 的修复具有重要意义。
发明内容
针对上述研究背景，本发明提供了一种复合微生物菌剂，由假单胞菌属(Pseudomonas sp.)YH-1 和红球菌属(Rhodococcus sp.)YH-3构成，所述复合菌剂具有降解芘和耐重金属铬的特性，能够很好的应 用于重金属-多环芳烃复合污染环境的修复中。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供的复合菌剂由假单胞菌YH-1(Pseudomonas sp.YH-1)和红球菌YH-3(Rhodococcus sp. YH-3)复合而成，2株菌均保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号 分别为：CCTCC NO:M 2021160；CCTCC NO:M 2021161，保藏日期为2021年1月27日。
本发明的两株菌YH-1(Pseudomonas sp.)和YH-3(Rhodococcus sp.)均从胜利油田长期受石油污 染的土壤中筛选而得，经研究发现，复配菌可有效提高多环芳烃芘的降解率，同时对重金属铬具有良好的 抗性和吸附转化效果。
复合菌剂的制备方法步骤：
将接种量为1％的YH-1、YH-3分别独立的接种到液体LB培养基中，30℃、160rpm条件下振荡培 养8～10h后，再将YH-1和YH-3按照1:1(V:V)进行混合后于30℃、160rpm条件下再培养5～8h得到 复配菌混合发酵液，将混合发酵液离心后去掉上清液，再经过磷酸盐缓冲液清洗3次后收集菌体，最后将 收集的菌体于-20℃冰箱过夜预冻后经真空冷冻干燥即得复合菌剂。
活化及发酵过程所用液体LB培养基组成成分包括：
酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000ml；
所述活化培养基使用前调pH为7.0～7.5，121℃下灭菌30min后使用。
本发明的有益效果主要包括以下几个方面：
1.所述假单胞菌株(Pseudomonas sp.)YH-1和红球菌(Rhodococcus sp.)YH-3，协同性能较好， 形成高效的代谢降解体系，较单一菌株相比，可以明显提高芘的降解效果；
2.复配菌在降解芘的同时对重金属铬具有良好的抗性和吸附转化效果；
3.本发明利用复配菌处理多环芳烃-重金属复合污染环境的方法操作简单易行，成本低，环境友好， 具有广阔的应用前景。
附图说明
图1中的(a)为筛选得到的假单胞菌(Pseudomonas sp.)YH-1在固体LB培养基上的生长状态；
图1中的(b)为筛选得到的红球菌(Rhodococcus sp.)YH-3在固体LB培养基上的生长状态；
图2为菌株YH-1和YH-3及其复配后对芘的降解效果图；
图3中的(a)和(b)为加入重金属铬时复配菌的能谱图；
图3中的(c)和(d)为加入重金属铬时复配菌细胞表面各元素的mapping图；
图4中的(a)和(b)为加入重金属铬时复配菌的TEM图；
图4中的(c)为加入重金属铬时复配菌的TEM能谱图；
图5为复配菌吸附重金属铬前后的FTIR图；
图6中的(a)是复配菌吸附重金属Cr6+后的XPS图，(b)是复配菌吸附重金属Cr6+后的XRD图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明中的技术方案，下面将结合本申请中具体的实施例，对 本申请的具体技术方案进行详细的说明。应当指出，所描述的实施例并不是本申请的全部实施例。下述实 施例中所用实验材料若无特殊说明，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1.菌株筛选
材料和方法
土壤样品：胜利油田长期受石油污染场地的土壤。
筛选培养基
无机盐培养基：(NH4)2SO41.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，无水CaCl20.01 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 8.0g，FeCl3痕量，蒸馏水1000ml，调pH为7.2～7.5，121℃灭菌30min后使用。
芘降解菌筛选培养基：在无机盐培养基的基础上加入一定量的芘-丙酮溶液。
重金属筛选培养基：LB液体培养基中加入20g/L的琼脂粉制成LB固体培养基，然后加入不同浓 度的重金属铬溶液。
菌株筛选
称取一定量的原油污染土壤加入到已灭菌的LB液体培养基中富集培养48h。取一定量的芘-丙酮溶 液加入到无机盐培养基中振荡过夜，待丙酮挥发完全后接入5mL富集培养液，振荡培养7d，然后再取5mL 培养液加入到新鲜的培养基中，采用以上方法转接培养5次，芘的浓度依次增加(20、30、50、80、100mg/L)。 取最后一次驯化培养液稀释后涂布于含有不同浓度芘的LB固体培养基上，培养2-3d后，挑取芘耐受性较 好的菌落反复划线分离直到得到单一的芘降解菌，将得到的芘降解菌在含有不同浓度重金属铬的LB固体 平板上进行划线，37℃恒温培养箱中培养2-3d，得到重金属铬耐受性较好的芘降解菌。
菌株鉴定
采用16S rRNA分子生物学鉴定技术对所筛菌株进行测定，根据测序结果确定其菌属并构建系统发 育树。
筛选结果
如表1，通过筛选共得到2株耐重金属铬的芘降解菌YH-1和YH-3。
菌株YH-1和YH-3对重金属铬的耐受性较好。
实施例2.菌株复配
材料与方法
菌株：经过筛选得到2株对芘降解率较高且具有重金属铬抗性的菌株YH-1和YH-3。
培养基
LB液体培养基、芘-无机盐培养基
测定方法：配制芘-无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中芘的浓度为50mg/L；重金属铬的含量 为30mg/L)，灭菌备用；
设置4个处理组，分别接种对应的菌株发酵液10％(v:v)，试验处理如下：
处理1：只接种菌株YH-1；
处理2：只接种菌株YH-3；
处理3：接种菌株YH-1和YH-3(1:1)；
处理4：不接种菌株的芘-无机盐培养基，为空白对照组。
所有处理在30℃，160r/min条件下振荡培养5d。
采用超声萃取-紫外分光光度法和气相色谱-质谱法测定培养后芘的剩余量，计算芘的降解率。
实验结果
处理1芘的浓度为35.19mg/L，芘的降解率为29.63％；
处理2芘的浓度为39.34mg/L，芘的降解率为21.32％；
处理3芘的浓度为28.67mg/L，芘的降解率为42.67％；
结论：
由上述结果可以看出，经过5d的降解实验，YH-1对芘的降解率为29.63％，YH-3对芘的降解率为 21.32％，YH-1和YH-3以1:1比例复配后对芘的降解率为42.67％，复配菌对芘的降解率均高于单菌，由 此可看出YH-1和YH-3在对芘的降解过程中具有协同作用，这2株菌复配后对芘的降解率有明显的提高。
实施例3.复配菌对重金属铬的吸附转化
试验设置：
配制芘-无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中重金属铬的含量为30mg/L)，灭菌备用；
在配置好的含有重金属铬的芘-无机盐培养基中接入10％(v:v)的复配菌的混合发酵液。
所有的处理在30℃，160r/min条件下培养5d。
将培养后的培养基离心后上清液透过0.45μm的滤膜，分离菌体和培养基，分别测定总铬和Cr6+的 含量。
重金属总铬的含量采用电感耦合等离子体光谱法(ICP)进行测定，Cr6+的含量采用二苯碳酰二肼 分光光度法进行测定。
实验结果：
芘的浓度为50mg/L，重金属Cr6+的浓度为30mg/L；
结果：
表1 Cr6+的吸附转化效果
结论：
由上表可知，在芘存在的条件下，复配菌对重金属铬具有吸附转化的作用。Cr6+的初始浓度为30 mg/L，30℃，160r/min，经过5d的振荡培养后，上清液中总铬的含量为9.41mg/L，Cr6+的含量为7.00mg/L， 说明复配菌可以吸附Cr6+并可以将部分高毒性的Cr6+转化为低毒性的Cr3+，复配菌对Cr6+的吸附转化率为 68.63％，由此可知，复配菌对Cr6+具有良好的修复效果。
实施例4.复配菌对重金属铬的吸附转化机理
材料和方法
菌种：复配菌
培养基
芘-无机盐培养基
方法：SEM-EDS、TEM、FTIR、XRD和XPS测定分析
配制芘-无机盐培养基，加入重金属铬(培养基中重金属铬的含量为30mg/L)，灭菌备用；
配制芘-无机盐培养基，不加重金属，灭菌备用；
在处理好的培养基中分别接入10％(v:v)的复配菌混合发酵液。
所有处理在30℃，160r/min条件下培养5d。
将培养5d的含有重金属Cr6+的芘-无机盐培养基离心后收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 次弃去上清液收集菌体，一部分用2.5％的戊二醛固定菌体并放于4℃冰箱过夜后送至指南针公司进行 SEM-EDS、TEM及能普测定，另一部分菌体真空冷冻干燥后制成菌粉送至指南针公司进行FTIR、XRD 和XPS测定分析。
结论：
SEM-EDS测定结果显示，复配菌菌体细胞吸附了重金属Cr6+；TEM及能谱测定结果显示菌株细 胞内存在少量的重金属铬，说明金属离子可以跨膜进入菌株细胞内；XRD和XPS测定结果分析复配菌可 以将Cr6+还原为Cr3+，其还原产物为Cr(OH)3。
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