一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用
阅读说明：本技术 一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用 (Cell-dissolving strain, sludge reduction treatment agent and application thereof ) 是由 黄瑛 张中玉 迟宝岩 段欣欣 于 2021-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用,所述溶胞菌株为土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4,保藏编号为CCTCC M 2021512。是从高温驯化成熟的污泥中分离筛选得到,所述溶胞菌株和包含所述溶胞菌株的污泥减量处理剂能够应用于污泥的减量处理中,本发明分离筛选溶胞菌株为土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4能够利用污泥中的有机质生长繁殖,菌株的代谢过程中产生的酶能够加速胞外聚合物的水解和污泥细胞的裂解,达到污泥溶胞的目的。(The invention relates to a cell dissolving strain, a sludge reduction treatment agent and application thereof, wherein the cell dissolving strain is Geobacillus (Geobacillus) ((Bacillus subtilis)) and the sludge reduction treatment agent is prepared from Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) Geobacillus sp. ) THE preservation number of THE THE-4 is CCTCC M2021512. The cell lysing strain is separated and screened from sludge matured by high-temperature acclimation, the cell lysing strain and a sludge reduction treatment agent containing the cell lysing strain can be applied to sludge reduction treatment, and the cell lysing strain is Geobacillus: ( Geobacillus sp. ) THE THE-4 can utilize organic matters in THE sludge to grow and reproduce, and THE enzyme generated in THE metabolic process of THE strain can accelerate THE hydrolysis of extracellular polymers and THE cracking of sludge cells, thereby achieving THE purpose of sludge cell lysis.)
技术领域
本发明属于污泥生物处理领域，具体涉及一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用。
背景技术
生物废水处理厂(WWTP)已在世界范围内用于处理市政废水。尽管可以有效去除废水中的有机物，但会产生大量的剩余污泥。随着污水处理厂的日益普及，人口的不断增加，新污水处理厂的建设以及更严格的污水处理要求，使得污泥的产量将持续增加。因此，污泥的处理和处置已然成为环境工程领域一个日益重大的挑战。
在传统的污水处理厂中，主要有两种减少污泥剩余量的方法，即废水线和污泥线。其中，污泥的原位减量技术是从源头处置污泥的一个重要手段，它的常用方法是将溶胞后的回流污泥再循环至主流生物反应器进行进一步生物降解，利用物理、化学及生物学的手段，使得整个污水处理系统向外排放的污泥量达到最少，具有良好的应用前景。物理和化学方法会导致额外的能源消耗、成本高、二次污染和其他经济成本。相比之下，生物预处理在加速污泥水解过程方面显示出绝对优势。
胞外聚合物(EPS)是污泥絮体基质的重要组成部分，由多种有机物质组成，比如多糖、蛋白质、腐殖酸、糖醛酸、脂类化合物等有机大分子。而采用生物预处理法进行污泥的减量是通过向污泥中加入水解酶，在水解酶的催化下加速胞外聚合物的水解，破坏微生物细胞结构，溶解污泥中的不溶性物质。然而直接添加水解酶，存在成本较高，反应条件较为苛刻的问题，实际大规模应用难度较大。因此，为了提高生物预处理法的工业化应用程度，有必要分离筛选出一种能够对污泥进行减量处理的菌株，通过菌株在污泥的代谢过程中产生的酶加速胞外聚合物的水解，达到污泥减量的目的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用，该溶胞菌株能够能够利用污泥中的有机质生长繁殖，菌株的代谢过程中产生的酶能够加速胞外聚合物的水解和污泥细胞的裂解，达到污泥溶胞的目的。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
技术方案一：
一种溶胞菌株，为土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4，属于土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏时间2021年5月 11日，保藏号为CCTCC M 2021512。
进一步的，所述土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4的16S rDNA序列如SEQ ID：1所示。
进一步的，所述溶胞菌株从高温驯化成熟的污泥中分离筛选得到。
进一步的，所述高温驯化成熟的污泥是由污水污泥于55-80℃进行驯化而得。
进一步的，所述溶胞菌株的活化方法，包括如下步骤：
将溶胞菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4接种于液体培养基，恒温振荡培养进行活化，获得OD600在1.0-1.2的种子液，然后离心，收集菌体。
进一步的，液体培养基中土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4的接种量为1-5％；振荡培养的温度为50-85℃，震荡速率为40-200rpm，恒温振荡培养的次数为2-3次，每次振荡培养的时间是6-20h。
技术方案二：
一种的污泥减量处理剂，包括所述溶胞菌株。
技术方案三：
一种所述污泥减量处理剂在污泥减量处理中的应用。
技术方案四：
一种利用所述溶胞菌株进行污泥减量处理的方法，包括如下步骤：
步骤一、将溶胞菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4的菌体用无菌水吹打均匀，得菌液；
步骤二、向待处理的有机污泥中投入菌液，调pH6-10，于曝气条件和搅拌条件下进行溶胞反应。
进一步的，步骤一中，所述菌液的OD600值为0.4-0.8，步骤二中，所述菌液的投加量为待处理有机污泥体积的10-15％，溶胞反应的温度为50-85℃，曝气速率为0.1-1.0vvm，搅拌速率为50-200rpm，溶胞反应的时间为1-36h。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
1、本发明采用55℃-80℃的条件下进行驯化成熟的污泥进行溶胞菌株的分离筛选，采用该方法分离出的溶胞菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4，能够在待处理的污泥中进行隐形生长，分泌胞外酶，促进污泥中大分子有机物水解，使得污泥固相中的有机质得以释放到液相中，以便后继利用，本发明分离筛选获得的溶胞菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.) THE-4，相较于其他溶胞菌而言，胞外酶的分泌量更大，溶胞效果更佳。
2、采用本发明提供的溶胞菌株及污泥处理方法进行污泥的溶胞，其与传统的物理化学减量技术相比，具有经济高效、耗能较底，溶胞效率高，反应条件易控制的特点，在污水的处理过程中，溶胞后的污泥可以继续回流至生化池，为污水的脱氮过程提供碳源，同时，溶胞后释放的大量溶解性有机物可以用于污泥的厌氧消化，提高资源利用率，本发明不会产生二次污染，具有良好的环境效益，应用前景广泛。
附图说明
图1是溶胞菌株的系统进化树；
图2是实施例2中土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4蛋白酶活性变化图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。
本发明分离筛选所用污水污泥来源于：南京市桥北处理厂A2/O工艺回流污泥泵房的污泥；污水污泥的指标：TSS:13285±146mg/L；VSS:6003±30mg/L；TCOD:4350±88mg/L；SCOD:65±5mg/L；pH:6.8±0.2；
本发明溶胞试验所用污水污泥来源于：A2/O工艺运行污水厂的剩余污泥，污水污泥性质如下：总悬浮固体(TSS)为14685±146mg/L，挥发性悬浮固体(VSS)为6021±25mg/L，总化学需氧量(TCOD)为4350±88mg/L，溶解性化学性需氧量为65±5mg/L，pH为7.0-7.3。将污泥过筛去除粒径超过1mm的颗粒物后放入4℃冰箱中保存，保存周期不超过1周。
对照菌株YL-1，属于土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间2021年5月8号；保藏号为：CCTCC AB2021109；对照菌株YL-1为公众可获得的菌株。
液体培养基：大量元素：次氮基三乙酸100mg，NaCl 8mg，KH2PO4 111mg，MgSO4·7H2O 100mg，蛋白胨1g，酵母提取物1g；微量元素：Na2MoO4·2H2O 0.025mg，FeCl3 0.28mg，CuSO4 0.16mg，MnSO4·H2O 2.2mg，H3BO3 0.5mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CoCl2·6H2O 0.046mg，CaSO4 60mg。加1L去离子水，调节pH在7-7.5，放置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌20min。
实施例1优势溶胞菌的分离、筛选、鉴定及应用
本发明主要包括以下几部分，一、从驯化后的污泥中分离、筛选获得优势菌株，二、对优势菌株进行鉴定；确定优势菌株的种属关系；三、通过工艺优化，获得利用所筛选的优势菌株进行污泥的减量处理的最佳工艺。
一、从驯化后的污泥中分离、筛选获得优势菌株，具体包括如下步骤：
步骤1、污泥驯化：将污水污泥于0.1-1.0vvm的曝气条件下，且在55-80℃的温度下进行驯化，驯化时间:5-60天；
步骤2、将驯化成熟的污泥，进行梯度稀释后，采用稀释倾注法及三区划线法进行分离纯化，得到单菌落的菌株，并对菌株分别进行命名编号；
步骤2.1、倒平板：固体培养基：大量元素：次氮基三乙酸100mg，NaCl 8mg,，KH2PO4111mg，MgSO4·7H2O 100mg，蛋白胨1g，酵母提取物1g；琼脂20g微量元素：Na2MoO4·2H2O0.025mg，FeCl3 0.28mg，CuSO4 0.16mg，MnSO4·H2O 2.2mg，H3BO3 0.5mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CoCl2·6H2O 0.046mg，CaSO4 60mg。加1L去离子水，调节pH在7-7.5，放置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌20min。待冷却至50℃-55℃，依次倒入无菌培养皿中，保证铺满皿底 2/3左右，待琼脂凝固将平板倒扣于无菌台。
步骤2.2、分离：取若干个已灭菌的EP管，分别加入0.9ml的无菌水，取0.1ml在65℃下驯化成熟的污泥，加入第一管无菌水中，充分混合摇匀，自第一管取0.1ml稀释液至下一个灭菌EP管中，混合摇匀，如此稀释到第四管、第五管，稀释倍数从第一管分别为：10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5；滴加10-4和10-5两管稀释液各0.1ml，接入相应的平板中，用灭菌后的涂布棒将稀释液涂布均匀。将涂抹后的平板放置于无菌台上20min-25min，待菌液渗入培养基中，将平板倒置于培养箱中12h，培养温度为50-85℃。用灭菌后的接种环挑选单菌落，采用三区划线法在平板上划线，重复3-4次，得到纯化菌落，本实施例共分离出菌株15株；
步骤3、对分离出的单菌落的菌株通过水解圈试验进行初筛，保留水解圈较大的菌株采用污泥溶胞试验和胞外酶活性试验进行进一步筛选，保留污泥VSS降解率较高、胞外酶活性较高的菌株，即为优势菌株；本实施例筛选获得的优势菌株为THE-4；
水解圈试验：将从驯化成熟的污泥中分离出的溶胞菌株接种至脱脂奶粉固体培养基中，放置恒温培养箱中，观察各菌株12h后水解圈的变化情况。
脱脂奶粉固体培养基成分：大量元素：次氮基三乙酸100mg,NaCl 8mg,KH2PO4111mg, MgSO4·7H2O 100mg，蛋白胨1g，酵母提取物1g，琼脂20g，脱脂奶粉20g,蒸馏水1L；微量元素：Na2MoO4·2H2O 0.025mg，FeCl3 0.28mg，CuSO4 0.16mg，MnSO4·H2O 2.2mg，H3BO30.5mg，ZnSO4·7H2O 0.5mg，CoCl2·6H2O 0.046mg，CaSO4 60mg。调节pH为7.0-7.5。
污泥初步溶解试验：取若干锥形瓶分别加入含固率为1.2-1.5％的污泥；将初筛后的菌株分别培养12-15h后，用无菌水吹打均匀，然后分别接种至相对应的锥形瓶中，于50-85℃温度、100rpm的振荡速率下恒温摇床培养，同时进行以超纯水做空白对照，测量24h后各个锥形瓶中污泥的挥发性悬浮固体(VSS)含量,计算污泥的VSS的减少率。
胞外酶活性试验：将初筛后的菌株按照1％的接种量分别接种至液体培养基中，采用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性。
二、对优势菌株进行鉴定，确定优势菌株的种属关系；具体包括生理生化鉴定和16S rDNA 鉴定：
1)革兰氏染色镜检：对优势菌株为THE-4进行革兰氏染色镜检，先后进行草酸结晶紫染液浸染1min，碘液浸染1min，95％的乙醇脱色30s，番红液浸染2min-3min，盖上盖玻片置于显微镜下观察，观察结果为：THE-4的菌体呈现红色，杆状，为革兰氏阴性。
2)16S rDNA鉴定：优势菌株THE-4的16S rDNA碱基序列如SEQ ID:1所示。
经鉴定，优势菌株THE-4属于土芽孢杆菌属，采用邻接法构建的系统发育树见图1。
三、通过工艺优化，获得利用所筛选的优势菌株进行污泥减量处理的最佳工艺。
在本实施例中，采用优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4进行污泥减量处理的最佳工艺：
步骤1、优势菌株的活化培养：
按1-5％的接种量将优势菌株THE-4接种于液体培养基中，于50℃-85℃温度下振荡培养 2-3次进行活化，获得OD600在1.0-1.2的种子液，然后离心，收集菌体；每次振荡培养的时间是12-15h，震荡速率为100-120rpm。
步骤2、将收集的菌体用无菌水吹打均匀，得菌液，备用；所述菌液的OD600为0.7-0.8；
步骤3、污泥的溶胞处理
按待处理有机污泥体积的10-15％，向待处理有机污泥中投入菌液后，调pH为6-10，然后，于50-85℃，搅拌且曝气条件下，溶胞反应1-36h；曝气速率为0.1-1.0vvm，搅拌速率为40-200rpm。
实施例2：优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4的胞外酶活性分析
剩余污泥是一种含有较高浓度的悬浮固体的有机废水，它的主要成分包括一些小分子的可溶性有机物(单糖、氨基酸等)和难降解的大分子有机物(主要包括蛋白质、多糖，脂类化合物)，其中，碳水化合物的占比达到了总有机质的20％。研究发现，在剩余污泥的溶解过程中，葡糖苷酶，蛋白酶和α-淀粉酶与污泥的胞外聚合物的降解息息相关，蛋白质的水解更是关键性因素。所以，细菌分泌的胞外蛋白酶的活性至关重要。
将本发明优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4按照1％的接种量接种至相对应的液体培养基中，采用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性。取不同时间点的菌液，在台式离心机中离心后(4℃，10min，14,000×g)，取上清液与底物偶氮酪蛋白在50-85℃下充分反应30 min，立刻加入5％的三氯醋酸(TCA)，用漩涡振荡器充分混合5秒钟后置于冰块下平衡10 分钟，离心取上清液滴加NaOH至浓度为0.4M，使用UV/VIS分光光度计测定440nm下的吸光度值。1个蛋白酶活单位定义成单位时间内，在一定实验条件下，将可溶性酪蛋白水解成1微摩尔酪氨酸所需要酶的数量。研究结论表明：本发明优势菌株THE-4整体的酶活趋于平稳，在14h达到587.5U/L，在14h的平均酶活分别是455.5U/L。
实施例3：优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4的溶解污泥性能探究
将本发明优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4和对照菌株YL-1分别接入相应的固体培养基中，在50-85℃下活化培养12h，使用无菌枪头将活化后的菌株接种至含有50ml 液体培养基的250ml锥形瓶中，50-85℃培养12h，震荡速率为120rpm，如此反复活化3次。活化成熟后的菌体经台式离心机离心后(6000rpm，10min)，收集菌体，使用无菌水将菌体吹打均匀。各批次溶解的污泥体积均为360ml，投加的菌液体积为40ml，另设未接种的空白对照组，未接种的空白对照组投加40ml的蒸馏水，使得菌液体积占总反应体系的10％。然后将各组于50-85℃、pH6.8-7.0且曝气条件下，搅拌反应36h；曝气速率为0.2vvm，搅拌速率为60±10rpm。采用国标方法测量各个样品中的VSS浓度，计算污泥VSS的降解率。结果见表1，研究结论得出：未接种的空白对照中污泥VSS的降解率为4.7％，而本发明土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4中污泥VSS的降解率为20.2％。本发明土芽孢杆菌(Geobacillussp.)THE-4相较于空白对照组VSS的降解率提高了15.5％，相较于对照菌株YL-1提高了12.9％。
表1
THE-4
对照菌株YL-1
空白对照组
VSS的降解率(％)
20.2±0.20
7.3±0.03
4.7±0.05
实施例4：温度对溶胞效果的影响
将优势菌株土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4分别在60℃，65℃和70℃下用液体培养基培养15-18h，反复活化3次，使其OD600在1.0-1.2之间，离心(6000rpm，10min)，收集菌体，用于后续溶胞实验。各个反应器的温度分别为60℃，65℃和70℃。溶解的污泥体积均为360ml，投加的菌液体积为40ml，菌液体积占总反应体系的10％。土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4在不同温度下VSS的降解率如表2所示，其中以65℃下土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)THE-4溶解污泥的效果最好，达到20.2％。
表2
60℃
65℃
70℃
VSS的降解率(％)
19.7±0.20
20.2±0.20
15.2±0.20
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种溶胞菌株、污泥减量处理剂及其应用
<130> 11
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1520
<212> DNA
<213> 土芽孢杆菌属菌株(Geobacillus sp.THE4)
<400> 1
tagagtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60
cggaccgaat ggaagcttgc tttcattcgg ttagcggcgg atgggtgagt aacacgtggg 120
taacctgccc gtaagaccgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gataacacca 180
aagaccgcat ggtctttggt tgaaaggtgg cttttgctac cacttacgga tgggcccgcg 240
gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccggcctga 300
gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcgac gccgcgtgag cgaagaaggt 420
cttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaagaagta ccgttcgaat agggcggtac 480
ggtgacggta cctaacgaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540
tagggggcga gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gtcccttaag 600
tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt 660
gcagaagagg agagcggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac 720
accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga 780
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga 840
ggggttaaac cctttagtgc tgtagctaac gcgttaagca ctccgcctgg ggagtacggc 900
cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 960
taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcccctgaca accctggaga 1020
cagggcgttc ccccttcggg gggacagggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgcccct agttgccagc 1140
attcagttgg gcactctagg gggactgccg gctaaaagtc ggaggaaggt ggggatgacg 1200
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cggtacaaag 1260
ggctgcgaac ccgcgagggg gagcgaatcc caaaaagccg ctctcagttc ggattgcagg 1320
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