一种猪链球菌9型高密度发酵培养基及其制备方法、应用
阅读说明：本技术 一种猪链球菌9型高密度发酵培养基及其制备方法、应用 (Streptococcus suis 9 type high-density fermentation medium and preparation method and application thereof ) 是由 余姣 肖澄 周琳 车巧林 沈晓红 董彦鹏 缪芬芳 谢洁 张志华 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪链球菌9型高密度发酵培养基及其制备方法、应用,包括基础培养基和培养基添加剂,基础培养基中包括以下组分：胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、硫酸铵、葡萄糖、七水合硫酸镁、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、剩余组分为纯水；培养基添加剂为马血清或牛血清；培养基添加剂按照所述基础培养基体积的2％～15％,与所基础培养基混合,得到猪链球菌9型高密度发酵培养基。使用本发明的猪链球菌9型高密度发酵培养基培养猪链球菌9型,有利于细菌的生长繁殖,培养的活菌滴度高。(The invention discloses a streptococcus suis 9 type high-density fermentation culture medium, a preparation method and application thereof, wherein the culture medium comprises a basic culture medium and a culture medium additive, and the basic culture medium comprises the following components: tryptone, yeast powder, beef powder, ammonium sulfate, glucose, magnesium sulfate heptahydrate, dipotassium hydrogen phosphate trihydrate, potassium dihydrogen phosphate and the balance of pure water; the culture medium additive is horse serum or bovine serum; the culture medium additive is mixed with the basic culture medium according to the volume of 2-15% of the basic culture medium to obtain the streptococcus suis 9 type high-density fermentation culture medium. The streptococcus suis 9 type high-density fermentation medium is used for culturing the streptococcus suis 9 type, so that the growth and the propagation of bacteria are facilitated, and the titer of the cultured viable bacteria is high.)
技术领域
本发明涉及兽医技术领域，具体涉及一种猪链球菌9型高密度发酵培养基及其制备方法、应用。
背景技术
猪链球菌分33种血清型，其中猪链球菌2型(SS2)流行最广，发病率最高，而且可感染人致死，是一种重要的人畜共患病病原，由SS2引起的猪链球菌病常呈散发或地方性爆发，发病率和死亡率均很高，严重危害养猪业的发展；到目前为止，各国致力于猪链球菌的研究一直是猪病的热点，尤其是对SS2的研究就从未停止，虽然在猪链球菌所有血清型中以2型分布最广，毒力最强，但是近年来，我国SS9的分离率和致病率有明显上升的趋势，不断有新的9型菌株被分离出来；随着越来越多的9型菌株在病猪体内被分离，关于9型的研究也就很有必要；有研究发现，不同的9型菌株致病力存在差异，猪脑脊液分离株对小鼠的致病力更强，随着国家对减抗的力度加强，研究相应的疫苗迫在眉睫。
目前有许多猪链球菌的推荐培养基，但是没有猪链球菌9型的专用培养基，研究中常用THB、TSB、马丁肉汤来培养猪链球菌，商品化的THB、TSB培养基虽然使用方便，但是在培养过程中，细菌生长缓慢，活菌数较低，发酵过程中最高活菌数为10～20亿，不适宜大规模生产。
发明内容
为此，本发明提供一种猪链球菌9型高密度发酵培养基及其制备方法、应用，能够使得细菌生长快，活菌数高，适宜大规模生产，解决了背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种猪链球菌9型高密度发酵培养基，包括基础培养基和培养基添加剂，每1000ml所述基础培养基中包括以下组分：
胰蛋白胨 15g～25g；
酵母粉 3g～5g；
牛肉粉 3g～5g；
硫酸铵 1g～5g；
葡萄糖 1g～10g；
七水合硫酸镁 0.2g～1.0g；
三水合磷酸氢二钾 5g～10g；
磷酸二氢钾 0.5g～1.0g；
每1000ml所述基础培养基中剩余组分为纯水；
所述培养基添加剂为马血清或牛血清；
所述培养基添加剂按照所述基础培养基体积的2％～15％，与所述基础培养基混合，得到猪链球菌9型高密度发酵培养基。
所述猪链球菌9型高密度发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1：按照如下配比制备水溶液，作为基础培养基：
胰蛋白胨 15g/1000ml～25g/1000ml；
酵母粉 3g/1000ml～5g/1000ml；
牛肉粉 3g/1000ml～5g/1000ml；
硫酸铵 1g/1000ml～5g/1000ml；
葡萄糖 1g/1000ml～10g/1000ml；
七水合硫酸镁 0.2g/1000ml～1.0g/1000ml；
三水合磷酸氢二钾 5g/1000ml～10g/1000ml；
磷酸二氢钾 0.5g/1000ml～1.0g/1000ml；
S2：用1mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基础培养基的pH值至7.4～7.8；
S3：灭菌，冷却；
S4：按所述基础培养基体积的2％～15％加入马血清或牛血清，得到所述猪链球菌9型高密度发酵培养基。
其中，进一步地，所述灭菌条件为：115℃高压灭菌20min。
本发明另一方面提供了一种猪链球菌9型高密度发酵培养基的应用，使用猪链球菌9型高密度发酵培养基培养猪链球菌9型。
本发明另一方面提供了一种猪链球菌9型高密度发酵培养基的基础培养基，每1000ml中包括以下组分：
胰蛋白胨 15g～25g；
酵母粉 3g～5g；
牛肉粉 3g～5g；
硫酸铵 1g～5g；
葡萄糖 1g～10g；
七水合硫酸镁 0.2g～1.0g；
三水合磷酸氢二钾 5g～10g；
磷酸二氢钾 0.5g～1.0g；
剩余组分为纯水。
本发明另一方面提供了一种组合物，包括以下组分：
胰蛋白胨 15份～25份；
酵母粉 3份～5份；
牛肉粉 3份～5份；
硫酸铵 1份～5份；
葡萄糖 1份～10份；
七水合硫酸镁 0.2份～1.0份；
三水合磷酸氢二钾 5份～10份；
磷酸二氢钾 0.5份～1.0份，
将上述组合物按照适当比例溶于纯水中，即可得到本发明提供的一种猪链球菌9型高密度发酵培养基的基础培养基。
本发明的有益效果是：
1、使用本发明的猪链球菌9型高密度发酵培养基培养猪链球菌9型，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌滴度高。
2、本发明的猪链球菌9型高密度发酵培养基的制备方法简单。
3、本发明所使用的原料相比于常用的脑心浸液培养基和胰蛋白陈大豆培养基的原料，成本更低。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
按照胰蛋白胨25g，酵母粉3g，牛肉粉3g，硫酸铵2g，葡萄糖1g，七水合硫酸镁0.5g，三水合磷酸氢二钾10g，磷酸二氢钾0.6g，加蒸馏水至1000ml，用用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.45，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按10％(V/V)比例添加牛血清，得到猪链球菌9型高密度发酵培养基。
对比实施例一
自英国OXID公司购买TSB培养基，TSB培养基的主要成分为胰蛋白胨，并且含有0.25％的葡萄糖，0.25％的磷酸氢二钾和0.5％的氯化钠。按照瓶签说明配制TSB培养基1000ml，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按10％(V/V)比例添加牛血清。
培养及培养结果对比方法
在实施例一制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基上接种猪链球菌9型，在对比实施例购买的TSB培养基上接种猪链球菌9型，将上述两种培养基同时置于37℃180RPM摇床中培养，每隔1小时取样1次，使用分光光度计测定猪链球菌9型光密度值(OD6oo)，并进行活菌计数，连续测定8小时。
通常来讲处于对数生长期的菌液OD值与浓度成正比，但OD值与细菌活菌数的峰值并不同时出现。通过OD值估算菌液浓度区间，并采用活菌计数法(按现行《中国兽药典》附录进行)测定活菌含量，记录并汇总相应数据如下表所示：
从上表中可知，猪链球菌9型在TSB培养基的OD值和活菌数最高出现时间较晚(7h)，活菌数为19.1亿，而本发明实施例一所使用的培养基活菌数最高在4h出现，活菌数为62.3亿。
因此，本发明实施例一制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基在培养猪链球菌9型时的效果，明显优于传统的TSB培养基，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌滴度高。
实施例二
按照胰蛋白胨20g，酵母粉4g，牛肉粉4g，硫酸铵1g，葡萄糖5g，七水合硫酸镁0.2g，三水合磷酸氢二钾5g，磷酸二氢钾0.5g，加蒸馏水至1000ml，用用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.45，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按2％(V/V)比例添加牛血清，得到猪链球菌9型高密度发酵培养基。
对比实施例二
自英国OXID公司购买TSB培养基，TSB培养基的主要成分为胰蛋白胨，并且含有0.25％的葡萄糖，0.25％的磷酸氢二钾和0.5％的氯化钠。按照瓶签说明配制TSB培养基1000ml，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按2％(V/V)比例添加牛血清。
培养及培养结果对比方法
在实施例二制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基上接种猪链球菌9型，在对比实施例购买的TSB培养基上接种猪链球菌9型，将上述两种培养基同时置于37℃180RPM摇床中培养，每隔1小时取样1次，使用分光光度计测定猪链球菌9型光密度值(OD6oo)，并进行活菌计数，连续测定8小时。
通常来讲处于对数生长期的菌液OD值与浓度成正比，但OD值与细菌活菌数的峰值并不同时出现。通过OD值估算菌液浓度区间，并采用活菌计数法(按现行《中国兽药典》附录进行)计算菌液的浓度，记录并汇总相应数据如下表所示：
从上表中可知，猪链球菌9型在TSB培养基的OD值和活菌数最高出现时间较晚(7h)，活菌数为15.9亿，而本发明实施例二所使用的培养基活菌数最高在5h出现，活菌数为62.8亿。
因此，本发明实施例一制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基在培养猪链球菌9型时的效果，明显优于传统的TSB培养基，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌滴度高。
实施例三
按照胰蛋白胨15g，酵母粉5g，牛肉粉5g，硫酸铵5g，葡萄糖10g，七水合硫酸镁1g，三水合磷酸氢二钾8g，磷酸二氢钾1g，加蒸馏水至1000ml，用用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.45，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按15％(V/V)比例添加牛血清，得到猪链球菌9型高密度发酵培养基。
对比实施例三
自英国OXID公司购买TSB培养基，TSB培养基的主要成分为胰蛋白胨，并且含有0.25％的葡萄糖，0.25％的磷酸氢二钾和0.5％的氯化钠。按照瓶签说明配制TSB培养基1000ml，115℃高压灭菌20分钟，冷却后按15％(V/V)比例添加牛血清。
培养及培养结果对比方法
在实施例三制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基上接种猪链球菌9型，在对比实施例购买的TSB培养基上接种猪链球菌9型，将上述两种培养基同时置于37℃180RPM摇床中培养，每隔1小时取样1次，使用分光光度计测定猪链球菌9型光密度值(OD6oo)，并进行活菌计数，连续测定10小时。
通常来讲处于对数生长期的菌液OD值与浓度成正比，但OD值与细菌活菌数的峰值并不同时出现。通过OD值估算菌液浓度区间，并采用活菌计数法(按现行《中国兽药典》附录进行)计算菌液的浓度，记录并汇总相应数据如下表所示：
从上表中可知，猪链球菌9型在TSB培养基的OD值和活菌数最高出现时间较晚(6h)，活菌数为18亿，而本发明实施例一所使用的培养基活菌数最高在5h出现，活菌数为63.3亿。
因此，本发明实施例一制备的猪链球菌9型高密度发酵培养基在培养猪链球菌9型时的效果，明显优于传统的TSB培养基，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌滴度高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。
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