具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述。

下述实施例中涉及的培养基如下

MRS琼脂平板(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0ml/L、K₂PO₄·3H₂0 2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO₄·7H₂0 0.2g/L、MnSO₄·4H₂0 0.05g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，其配制方法将各成分混合均匀，灭菌备用。MRS液体培养基是不添加琼脂。

MRS肉汤培养基(g/L)：酪蛋白酶消化物10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、MgSO₄·7H₂0 0.2g/L、MnSO₄·4H₂0 0.05g/L、K₂PO₄·3H₂0 2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0g/L，溶剂为水，其配制方法将各成分混合均匀，灭菌备用。

实施例1乳酸菌的分离、鉴定

1、乳酸菌的分离

采集中国内蒙古自治区呼伦贝尔市满洲里市芜菁甘蓝作为样本，在无菌环境下，取0.1g芜菁甘蓝样本加入5ml MRS液体培养基，震荡混匀后于37℃厌氧条件下富集培养24h，吸取0.5ml菌液进行梯度稀释。加入生理盐水制成10^-1至10^-5稀释梯度菌悬液，分别吸取10^-3、10^-4、10^-5三个梯度菌悬液100μl至MRS琼脂培养基，使用涂布棒涂抹均匀，再于37℃厌氧条件下培养48h。挑取平板上形态典型的菌落至MRS琼脂培养基上进行划线纯化，两次纯化后挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，于37℃培养24h收集菌体用于菌体DNA的提取。

2、乳酸菌的鉴定

采用细菌DNA提取试剂盒(Mabio，CHINA)进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix(Dongshengbio，CHINA)进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16SrRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物序列为1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min 30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收后进行一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。获得的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与戊糖片球菌同源性最高，故将该菌株命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)IM96。

戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)IM96于2021年5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61654。

3、乳酸菌的活化、培养及保藏方法

从-80℃冰箱取出戊糖片球菌IM96菌株后，于MRS琼脂培养基中活化两次。挑取菌落接种于MRS液体培养基中，在37℃厌氧培养24-48h。在培养好的菌液中加入甘油，保藏于-80℃的冰箱中。

实施例2戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96抗菌能力的评估

1、乳酸菌发酵液的制备

将戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96单菌落接种于MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养48h。采用10000r×4℃离心10min，获取发酵上清。采用0.22μm滤膜过滤发酵上清，获得戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96发酵的无细胞上清液，冻存于-80℃待用。

2、指示菌的制备

将大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895的单菌落分别接种于LB液体培养基中，37℃，200r/min培养6h，调节浓度至1×10⁸CFU/mL，进行抗菌实验。

3、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96抗菌能力测定

取以上制备获得的指示菌菌液200μL均匀涂布于营养琼脂培养基上，用灭菌的镊子将无菌牛津杯放置于平板上，每只牛津杯加入200μL以上制备的上清液。同时，以MRS培养基作为空白对照组。将平皿置于4℃冰箱扩散均匀，然后于37℃培养18h后，测量抑菌圈直径。由图1可知，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96对大肠杆菌O157：H7ATCC43895的抑菌圈24.67±0.58mm。

实施例3戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96益生性能评价

1、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的耐受人工胃液实验

耐受人工胃液实验：将PBS(pH7.4)缓冲液用0.1mol/L HCl调节pH值为3.0，加入胃蛋白酶(3g/L)，溶解后用0.22μm的无菌滤膜过滤，现用现配。将所筛选出菌株活化，将制备好的Pediococcus pentosaceus IM96菌液以体积比2％接种量接种于10mL MRS液体培养基中，37℃无氧条件下静置培养24h，4000×g，10min离心收集菌体，PBS(pH7.4)洗涤菌体3次，用PBS调整菌液浓度到10⁹CFU/mL，备用。取1mL PBS重悬的乳酸菌菌液加入到5mL的模拟胃液中，同时加入1.5mL 0.5％(w/v)NaCl混匀，迅速放入37℃培养箱，培养0h和3h后，以无菌生理盐水按1:10梯度稀释，吸取100μL稀释液用一次性涂布棒均匀涂布于MRS固体培养基中，37℃条件下培养48h，进行乳酸菌活菌计数，如下公式计算戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96在pH 3.0情况下，0h和3h的存活率。

存活率(％)＝3h菌株的存活数/0h菌株的存活数×100％

2、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的耐受人工肠液实验

耐受人工肠液实验：将PBS缓冲液用0.1mol/L NaOH调节pH值为8.0，加入1mg/mL的胰蛋白酶和0.3％的牛胆盐。将1mL重悬的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96菌体(菌悬液制备同耐受人工胃液)加入到5mL模拟肠液中迅速混匀，放入37℃培养箱中，于0h和4h后，以无菌生理盐水按1:10梯度稀释，吸取100μL稀释液，用一次性涂布棒均匀涂布于MRS固体培养基中，37℃条件下培养48h，进行戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96活菌计数，如下公式计算不同乳酸菌株4h的存活率。

存活率(％)＝4h菌株的存活数/0h菌株的存活数×100％

对所筛选菌株进行人工胃肠液模拟实验，结果显示戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96耐受胃液存活率为80.31±2.88％。耐受肠液存活率为80.21±3.46％。

3、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的抗菌谱

将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、阪崎肠杆菌ATCC 29544、小肠结肠炎耶尔森氏菌GDMCC60852、铜绿假单胞菌ATCC 15442、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、单核增生李斯特菌ATCC 19117、蜡样芽胞杆菌ATCC 14579、枯草芽胞杆菌ATCC 6633的单菌落分别接种于LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜，调节浓度至1×10⁸CFU/mL。利用牛津杯琼脂扩散法对戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96进行抗菌谱的测定。由表1抑菌圈直径大小可知，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96对上述的食源性致病菌均具有良好的抗菌活性，表明戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96是一株具有良好应用前景且有广谱抗菌活性的潜在益生菌。

表1戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的抑菌谱

实施例4戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96基因组及其表型安全性评价

1、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的基因组安全性评价

采用Illumina Nextseq 550二代测序平台对戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMTRapid DNA-Seq Kit for Illumina(CISTRO,CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit(Illumina,USA)试剂盒测序。

下机数据采用Trimmomatic软件(v0.39)进行质控，后采用SPAdes软件(v3.13.1)进行组装。组装后戊糖片球菌基因组采用Quast软件(v5.0.2)进行组装质控评估，对于质控合格的基因组，采用Prokka软件(v1.13)进行注释。采用Abricate软件比对VFDB(VirulenceFactor Database)、ARG-Annot(Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation)和CARD(theComprehensive Antibiotic Research Database)数据库，均未发现该菌含有毒力基因或耐药基因。

2、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的表型安全性评价

2.1戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96耐药表型评价

根据临床和实验室标准协会(CLSI)标准使用纸片扩散法检测戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96对抗生素的敏感性。选取七种作为试验用抗生素，即氨苄西林，红霉素、克林霉素、四环素，氯霉素，亚胺培南、利福平，结果见表2(注：R为耐药，S为敏感)。

表2抗生素的敏感性实验

由表2可知，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96对抗生素氨苄西林，红霉素、克林霉素、四环素，氯霉素，亚胺培南、利福平均具敏感。

2.2戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96溶血表型评价

分别取5μL戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96点种于血平板上，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923为对照。37℃培养48h后观察结果。若观察到菌落周围如出现透明环状标志则为β-溶血，棕色或绿色为α-溶血，无现象为γ-溶血。

结果表明，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96周围无现象，溶血型为γ-溶血。所以戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96不具有溶血性。

实施例5戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96缓解并改善小鼠由大肠杆菌O157：H7引起的肠道病理损伤、肠道炎症和肠道上皮屏障损伤

1、动物实验与设计

对具有拮抗大肠杆菌O157：H7活性、良好的益生特性和安全特性的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96进行体内小鼠实验验证。7周龄SPF级别的C57BL/6小鼠，来自北京华阜康生物科技股份有限公司。将小鼠置于受控环境条件下(温度23±3℃，相对湿度50％-60％，光照/黑暗周期12/12h，实验过程中自由取水和食物)。小鼠在实验前1周开始适应，并被随机分成4组。小鼠实验设计如下：对照组(Control group)：每日灌胃0.1ml的PBS，4h后灌胃0.1ml的PBS；肠出血性大肠杆菌O157：H7感染组(EHEC group)：每日灌胃1×10⁹cfu大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895，4h后灌胃0.1ml的PBS；诺氟沙星干预组(Norfloxacin group)：每日灌胃1×10⁹cful大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895，4h后灌胃5mg/kg的诺氟沙星；戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96干预组(IM96 group)：每日灌胃1×10⁹cful大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895，4h后灌胃1×10⁸cfu的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96。灌胃持续1周。

2、小鼠存活率和体重变化情况

实验过程测量记录小鼠存活率和体重变化情况，结果如图2显示。对照组的存活率为100％，而大肠杆菌O157：H7感染组的存活率下降到80％。但是在戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96干预后，IM96干预组的存活率上升到100％，诺氟沙星干预组也有同样的效果。在体重的变化上，和对照组相比，大肠杆菌O157：H7感染组的体重显著降低。戊糖片球菌Pediococcus pentosaceusIM96和诺氟沙星干预的显著缓解了的感染大肠杆菌O157：H7小鼠体重降低。使用软件SPSS 26.0进行统计分析，使用t检验或单因素方差分析。数值表示为均值±标准差，p值<0.05被认为具有统计学意义。此外，p值的表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3、空肠和回肠织形态学观察

实验结束对小鼠进行取材，迅速将小鼠空肠和回肠置于10％中性福尔马林固定液中固定。组织经过脱水透明、石蜡包埋、切片过程制备组织切片。经过H&E染色进行大小肠组织形态学的观察。结果如图3所示。

从图3中可以看出，对照组小鼠的小肠绒毛形态结构完整、排列整齐，无脱落现象。肠黏膜上皮完整，上皮细胞结构正常无断裂。较于对照组，大肠杆菌O157：H7感染组小肠绒毛存在不同程度的糜烂和脱落，肠粘膜损害严重，存在炎症细胞浸润现象，并在回肠处伴有充血。相比于模型组，诺氟沙星和戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96干预组能够减轻小肠的炎症浸润，减轻小肠绒毛的脱落和缓解绒毛的糜烂和黏膜屏障的损坏，起到了保护小肠绒毛结构和肠粘膜屏障的作用。

4、肠道炎症指标测量

制备空肠组织匀浆，利用IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10炎症因子Elisa试剂盒检测和分析小鼠肠道炎症指标和水平。由图4可知，相比于对照组，大肠杆菌O157：H7感染组在大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895感染后，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度均得到显著提高，证明该感染模型建模成功。相比于感染组，诺氟沙星干预组和戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96干预组的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α均得到显著下调。此外，和感染组相比，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96也显著升高了抗炎因子IL-10的生成。综上所述，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96具有良好的调节肠道炎症的功能。特别地，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

5、肠道上皮屏障指标测量

制备空肠组织匀浆，按照Elisa检测试剂盒中说明书操作测量小鼠空肠的MUC2、Occludin、ZO-1含量用于分析小鼠肠道上皮屏障。由图5可知，相比于对照组，大肠杆菌O157：H7感染组在大肠杆菌O157：H7 ATCC 43895感染后，小鼠空肠的MUC2、Occludin、ZO-1的浓度均得到显著下降，说明小鼠感染大肠杆菌O157：H7会破坏小鼠的肠道屏障的完整。相比于感染组，诺氟沙星干预组和戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96干预组的MUC2、Occludin、ZO-1含量均得到显著增加。综上所述，戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96具有良好的修复肠道上皮屏障的功能。特别地，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

实施例6戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的特异性分子靶标挖掘及其验证

1、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的特异性分子靶标挖掘

采用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件对戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96及NCBI数据库内其他68株戊糖片球菌及其它787株乳杆菌基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins(v2.4.1)软件识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96有别于其它戊糖片球菌及乳杆菌的特异序列SEQ ID No.2。根据戊糖片球菌Pediococcus pentosaceusIM96菌株特有的基因片段序列SEQ ID NO.2设计特异性PCR扩增引物组：正向引物：5’-ATCGCCAAAGCCAAACGTC-3’和反向引物：5’-TTCCTCCTGTCAACTCATAGC-3’，引物组序列如下表3。

表3检测特异基因片段序列PCR引物组

2、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96特异性分子识别靶标的有效性验证

采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)及琼脂糖电泳验证戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的特异性分子靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法同前。

PCR反应体系配置如下：

以下为PCR反应条件：

PCR结束后取5μl PCR产物进行1.2％琼脂糖电泳。若戊糖片球菌Pediococcuspentosaceus IM96能在388bp处出现单一特异条带，而其他非目标菌不能在388bp处出现条带，则说明该对靶标具有良好识别戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的效能。

PCR扩增产物凝胶结果如图6所示，M为DL2000DNA标准marker，+为目标戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96，C为阴性对照组(对照组的模板为不含基因组的DEPC水)。1-230为非目标戊糖片球菌

如图6所示，除目标菌株戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96的DNA经引物扩增后在388bp处形成的特异性扩增产物外，其余戊糖片球菌和其他种属菌株均未见特异扩增产物形成。结果证明PCR扩增引物是戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96特异性分子靶标。

所用菌株及检测结果如下表4所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表4戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus IM96特异性靶标的检测结果

虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

广东环凯生物科技有限公司

<120> 一种拮抗大肠杆菌O157：H7的戊糖片球菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌IM96(Pediococcus pentosaceus)

<400> 1

agacggctag ctcctaaaag gttaccccac cggctttggg tgttacaaac tctcatggtg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120

actagcgatt ccgacttcgt gtaggcgagt tgcagcctac agtccgaact gagaatggtt 180

ttaagagatt agcttaacct cgcggtttcg cgactcgttg taccatccat tgtagcacgt 240

gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtcg tccccacctt cctccggttt 300

gtcaccggca gtctcactag agtgcccaac ttaatgctgg caactagtaa taagggttgc 360

gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420

ctgtcattct gtccccgaag ggaacctcta atctcttaga ctgtcagaag atgtcaagac 480

ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

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cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagtaatcat cgtttacggc 660

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ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc caatgcactt 840

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ttcgtgttaa aatctcaatc agtacaagta cgtcataatc aattaacgga agttcg 1436

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌IM96(Pediococcus pentosaceus)

<400> 2

atgtttaaaa agtgtgaaat ttgtaataaa aagattggat tattttctaa accatttaca 60

actgatactg gtgcaaaagt atgtacctct tgtacatctt atgtagatcc aattttttta 120

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