叶斑艺兰花f3′5′h基因的植物表达载体构建及其应用
阅读说明：本技术 叶斑艺兰花f3′5′h基因的植物表达载体构建及其应用 (Construction and application of plant expression vector of F3'5' H gene of phyllanthus floridulus ) 是由 王玉英 李枝林 凌青 李国昌 苏俊 马伟荣 黄新龙 刘丹 李茹 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有叶斑艺兰花类黄酮3’,5’-羟化酶基因(F3’5’H)且能提高植物花青素含量的专用植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3’5’H。本发明是利用RACE的方法从叶斑艺兰花中克隆出F3’5’H基因,用35S启动子在铁皮石斛中过量表达,并通过类似叶盘(原球茎)转化法将其转入野生型铁皮石斛中。实验结果表明在转基因铁皮石斛中F3’5’H基因能够正常表达,转入F3’5’H基因的生长情况比对照植株,转基因植株表现为更健壮,茎秆和叶片显示紫红色的特点,过量表达F3’5’H基因能够很大程度的提高增加转基因铁皮石斛中F3’5’H酶活性,蛋白质含量、可溶性糖含量增加,花青素和类黄酮物质含量增加。表明了叶斑艺兰F3’5’H基因对铁皮石斛生长发育有促进作用,且促进了类黄酮和花青素的合成,导致植株出现紫红色显色。(The invention discloses a special plant expression vector pCAMBIA1301-35S-F3'5' H containing 3',5' -hydroxylase gene (F3'5' H) of cymbidium floribundum and capable of improving the content of plant anthocyanin. The invention clones F3'5' H gene from leaf spot art orchid by RACE method, uses 35S promoter to over-express in Dendrobium officinale, and transfers it into wild type Dendrobium officinale by similar leaf disc (protocorm) transformation method. Experimental results show that the F3'5' H gene in the transgenic dendrobium officinale can be normally expressed, the transgenic plant is stronger when the growth condition of the F3'5' H gene is transferred than that of a control plant, the stem and the leaves show purplish red, the F3'5' H enzyme activity in the transgenic dendrobium officinale can be greatly improved and increased by over-expressing the F3'5' H gene, the protein content and the soluble sugar content are increased, and the anthocyanin and flavonoid substance content is increased. The result shows that the leaf spot art orchid F3'5' H gene has a promoting effect on the growth and development of the dendrobium officinale, and promotes the synthesis of flavonoid and anthocyanin, so that the plant is purple red and develops color.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种类黄酮3′,5′-羟化酶基因F3′5′H的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H，其构建方法及在转基因植物中的应用。
背景技术
叶(线)艺兰(线艺兰)是指兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)植株的叶片上镶嵌着或金黄色、或银白色、或浓绿色、或朱红色、或墨黑的嘴、边、点、线、斑的中国兰统称，大致可分为线艺兰、斑艺兰、水晶艺兰这三大类，随着人们对兰花叶艺欣赏和了解的深入也出现了叶蝶等不同颜色和形状变异类型。叶艺兰品种以墨兰(C.sinense)最多(如‘叶艺白墨’、‘银拖墨兰’、‘达摩’、‘闪电’、‘日向’、‘瑞玉’、‘大石门’)，建兰(Cymbidiumellsifolium)次之，春兰(C.goeringii)、蕙兰(C.faberi)与寒兰(C.kanran)较少，其栽培历史已有千年之久，被誉为“花中君子”，是珍贵的观赏花卉。叶(线)艺最早流行于日本，随着叶(线)艺兰‘加冶屋’的问世，日本兰界掀起了一场追求叶艺兰花品种的热潮，形成极为火爆的叶(线)艺兰市场氛围，如40年代墨兰叶(线)艺品种‘瑞玉’售价曾达5万日元(3苗)，到60年代的‘鹤之华’售价达650万日元(7苗)，而‘达摩’每苗更是高达20-30万美元。最近几十年，叶(线)艺在我国大陆流行，虽然起步较迟，但发展迅速，奇花、奇叶和矮种等各种变异类型层出不穷。兰花在无花时，较难交易，容易产生纠纷，而叶艺兰以观叶为主，可通过叶形、叶态、颜色等来鉴别，其商品价值根据线艺类型不同可成倍甚至数百倍地增加，市场前景十分广阔。
目前，参与花色形成的类黄酮物质生物合成途径已较为明确。在类黄酮合成途径中4-香豆酰辅酶A(coumaroyl-coenzyme A)是3类花青素苷的合成的前体，它能够在查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)的催化下合成4,2’,4’,6’-四羟基苯基苯乙烯酮(tetrahydroxychalcone)。4,2’,4’,6’-四羟基苯基苯乙烯酮在查尔酮异构酶(chalconeisomerase,CHI)催化下合成无色的柚皮素(naringenin)。柚皮素能够被黄烷酮-3-羟基化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)催化成二氢堪非醇(dihydrokaempferol,DHK)，DHK被类黄酮-3′-羟基化酶(flavonoid 3′-hydroxylase，F3′H)催化后生成二氢栎皮黄酮(dihydroquercetin,DHQ)。类黄酮-3′,5′-羟基化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase,F3′5′H)催化DHK生成二氢杨梅黄酮(dihydromyricetin,DHM)(步骤a)。二氢栎皮黄酮在二羟黄酮还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)，花青素苷合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)或3-葡萄糖基转移酶(flavonoid 3-glucosyl transferase,3GT)酶的作用下生成红色至红紫色的矢车菊素(cyaniding 3-O-glucoside,Cy)。二氢杨梅黄酮可以在以上三种酶的催化作用下生成蓝紫色的飞燕草素(delphinidin 3-O-glucoside,Dp)[24]。F3′5′H基因在花青素苷的合成中起着重要的调控作用，故对叶斑艺兰F3′5′H基因进行研究，可使花青素苷的种类或含量变化，进而定向改良叶色。
目前，已从番茄(Solanumlycopersicum)、非洲紫罗兰(SaintpauliaionanthaH.Wendl.)、洋桔梗(Eustomagrandiflorum)、茄子(Daturastramonium)、箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、山葡萄(VitisamurensisRupr)等植物中克隆了F3′5′H基因序列。目前NCBI网站上已公布至少38种植物约58条F3′5′H基因序列。杨晓娜等从‘转心乌’块茎嫩芽提取总RNA，通过RT-PCR克隆到F3’5’H的cDNA序列(GenBank登录号为HQ860267)，SDS-PAGE获得表达蛋白的分子量约为55kDa，基因全长1518bp，编码区长1485bp，共编码494个氨基酸。黄敏玲等采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类黄酮生物合成途径关键基因SrF3′5′H，该cDNA全长1766bp，具有完整的开放阅读框(ORF)，共1509个碱基，编码503个氨基酸，应用半定量PCR分析表明，SrF3′5′H在始花期转录水平达到最高。Nakatsuka等成功通过反义抑制方法，降低了龙胆植物的F3′5′H基因的表达，改变了龙胆植物的花色。Holton等对矮牵牛的F3′5′H基因进行研究，结果发现F3′5′H酶可以催化二氢槲皮素和二氢山奈酚生成二氢杨梅素。Toguri等也对矮牵牛进行了研究，发现F3′5′H基因在叶子中不表达，在花蕾发育中期的表达量很高。通过转基因技术，将蝴蝶兰F3′5′H导入百合中，同时导入DFR辅色基因，最终得到蓝色百合。Bruqliera等在菊花中导入紫罗兰F3′5′H基因获得了开浅蓝色的菊花。徐碧玉等将矮牵牛F3′5′H基因转入铁炮百合，获得了转基因植株，Wang等发现蝴蝶兰F3′5′H基因仅仅在花色着色期能被检测到，在根、叶和其它器官中不表达。白蓝等对转基因香石竹中F3′5′H基因进行了克隆、表达和免疫学鉴定。
Chandler等将矮牵牛F3′5′H基因和DFR基因导入白色的康乃馨中，获得了蓝色康乃馨，并成功投入了市场。李光等通过转录组测序获得了金荞麦F3′5′H基因cDNA序列，由进化树分析得知，金荞麦F3′5′H基因属于细胞色素P450 78A 10家族。王琳等从蓝色矮牵牛花瓣中克隆F3′5′H基因全长cDNA，并成功构建了花特异性启动子PchsA驱动的F3′5′H基因的表达载体。但目前叶艺兰叶片F3′5′H基因的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物花青素含量的类黄酮3′,5′-羟化酶基因的植物表达载体，该载体是含有类黄酮3′,5′-羟化酶基因F3′5′H的植物表达载体。同时，提供该载体的构建方法以及该载体在提高植物花青素含量的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种重组载体，含有叶斑艺兰花类黄酮3′,5′-羟化酶基因即F3′5′H基因，所述F3′5′H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pCAMBIA1301。
进一步地，所述重组载体为pCAMBIA1301-35S-F3′5′H，在起始载体pCAMBIA1301上连有启动子35S，其后紧接F3′5′H基因。
进一步地，本发明还提供一种重组载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)叶斑艺兰花F3′5′H基因的扩增
对转录组中获得的F3′5′H基因序列进行比对，发现F3′5′H基因序列具有5’，利用RACE技术对3’进行扩增,得到全长基因片段；
(2)F3′5′H基因的TA克隆
回收F3′5′H的编码区基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA,通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-F3′5′H，筛选正向阳性克隆进行菌液富集后提取质粒；
(3)F3′5′H基因植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H的构建
用NcoI和BstEII对重组质粒pMD-F3′5′H进行双酶切，将酶切后包含F3′5′H全长的条带进行回收；然后用NcoI和BstEII酶切pCAMBIA1301载体，将所得到的载体片段进行回收，所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达的重组载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H。优选的，所述步骤(1)叶斑艺兰花F3′5′H基因的扩增具体包含以下步骤：
①PCR引物
根据转录组中获得的F3′5′H基因片段设计得到以下引物，
B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；
F3′5′H1：5’-CTCTCAGCATACCTCACTACGCCTC-3’；
F3′5′H2：5’-GTTCCCAAGAAATACTGCACCATCA-3’；
②用上述反转录产物进行PCR，体系如下：10xPCR buffer2.5ul、dNTP mixture(10mM)2.5ul、F3’5’H1 0.5ul、B26 0.5ul、cDNA1.5ul、Taq plus0.25ul和H2O16.25ul，总容量为25ul；
③PCR反应程序如下：96℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应；
④同样的体系和反应程序，步骤②③中得到的RCR产物为模板做第二轮PCR，引物为F3′5′H2和B26；
⑤将所得片段连入pMDl8-T，酶切鉴定后进行序列测定；
⑥根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，分别设计引物F3′5′H3：5’-CGTTCGGAGCGGGGCGGAGGATTTGC-3’和F3′5′H4：5’-CGGGAAGTTAATGGGGATGCTGATGG-3’，PCR扩增全长序列做进一步的验证。
进一步地，本发明通过上述构建方法构建得到的重组载体主要应用于制备农杆菌转基因植株。
进一步地，本发明制备的重组载体应用在制备农杆菌转基因铁皮石斛中。
本发明是利用RACE的方法从叶斑艺兰花中克隆出F3′5′H基因，用35S启动子在铁皮石斛中过量表达，并通过类似叶盘(原球茎)转化法将其转入野生型铁皮石斛中。实验结果表明在转基因铁皮石斛中F3′5′H基因能够正常转录，转入F3′5′H基因的生长情况比对照植株(未转基因的野生型)，转基因植株表现为更健壮，茎秆和叶片显示紫红色的特点，过量表达F3′5′H基因能够很大程度的提高增加转基因铁皮石斛中F3′5′H酶活性，蛋白质含量、可溶性糖含量增加，花青素和类黄酮物质含量增加。表明了叶斑艺兰F3′5′H基因对铁皮石斛生长发育有促进作用，且促进了类黄酮和花青素的合成，导致植株出现紫红色显色。
附图说明：
图1:A:F3′5′H基因3’端PCR产物,M:maker2000bp；3：3’RACE产物B:F3′5′H基因全长扩增,M:maker10000bp；1：F3′5′H基因全长；
图2：pCAMBIA1301载体的双酶切；
图3：F3′5′H基因过表达载体；
图4:QPCR检测转基因和野生型植株F3′5′H基因的表达情况
图5:转基因和野生型植株形态；
图6：野生型和转基因铁皮石斛植株叶片内花青素和类黄酮含量；
图7：野生型和转基因铁皮石斛植株叶片内可溶性蛋白和糖含量
其中：A、B、C为转基因植株；CK为野生植株。
具体实施方式
为了能够更加清楚地理解本发明的技术实质和有益效果，申请人在下面以实施例的方式作详细说明，但是对实施例的描述均不是对本发明方案的限制，任何依据本发明构思所做出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。
为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知技术将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
一、构建F3′5′H的重组载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′HpCAMBIA1301-35S-F3′5′H是重组植物表达载体，在pCAMBIA1301-35S-F3′5′H植物表达载体中含有叶斑艺兰花的F3′5′H基因，其起始载体为pCAMBIA1301。
本发明所得到的pCAMBIA1301-35S-F3′5′H植物表达载体，它含有35S启动子，其后紧接F3′5′H基因。
所谓的F3′5′H基因，是在我们构建的转录组数据中的EST序列的基础上，通过RACE技术获得的，其命名为F3′5′H，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，ORF Finder分析表明F3′5′H基因具有序列较长且完整的开放阅读框，共1512bp，起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,共编码503个氨基酸。经ExPASy分析推测该蛋白的分子式为C2517H4018N686O692S27,分子量为55827.39，等电点PI为8.75。
二、重组载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H由下述方法构建而成：
(1)叶斑艺兰花F3′5′H基因的扩增
对我们转录组中获得的F3′5′H基因序列进行比对，发现F3′5′H基因序列具有5’，利用RACE技术对3’进行扩增，得到如图1所示的全长基因序列。
①PCR引物
根据我们转录组中获得的F3′5′H基因片段设计引物：
B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
F3′5′H1：5’-CTCTCAGCATACCTCACTACGCCTC-3’
F3′5′H2：5’-GTTCCCAAGAAATACTGCACCATCA-3’
②用上述反转录产物进行PCR，体系如下：
10xPCR buffer
2.5ul
dNTP mixture(10mM)
2.5ul
F3′5′H1
0.5ul
B26
0.5ul
cDNA
1.5ul
Taq plus
0.25ul
H<sub>2</sub>O
16.25ul
Total volume
25ul
③PCR反应程序如下：96℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。
④同样的体系和反应程序，以第一轮的RCR产物为模板做第二轮PCR，引物为F3′5′H2和B26。
⑤将所得片段连入pMDl8-T，酶切鉴定后进行序列测定。
⑥根据已测定序列及其重叠区域，拼接出目的基因的全长cDNA，分别设计引物F3′5′H3：5’-CGTTCGGAGCGGGGCGGAGGATTTGC-3’和F3′5′H4：5’-CGGGAAGTTAATGGGGATGCTGATGG-3’。PCR扩增全长序列做进一步的验证。
(2)F3′5′H基因的TA克隆
回收F3′5′H的编码区基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-F3′5′H；
(3)F3′5′H基因植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H的构建筛选正向阳性克隆进行菌液富集后提取pMD-F3′5′H质粒，并用NcoI和BstEII进行双酶切，将酶切后包含F3′5′H全长的条带进行回收；然后用NcoI和BstEII酶切pCAMBIA1301载体，其酶切后结果如图2所示，将所得到的载体片段进行回收。所得到的全长序列和载体序列上带上了互补的粘性末端，再将二者连接后，转化大肠杆菌，通过酶切鉴定筛选出重组子，构建起了植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H。
二、农杆菌的遗传转化和转化子的检测
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pCAMBIA1301-35S-F3′5′H转入农杆菌(EHA105)中，在加有壮潮霉素的平板上筛选转化子菌落。以农杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用F3′5′H基因的特异引物F3′5′H3和F3′5′H4做PCR检测转化子菌落，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
三、用含有F3′5′H基因的植物表达载体的农杆菌转化植物
挑取携带有质粒pCAMBIA1301-35S-F3′5′H的农杆菌单菌落接种于液体培养基中培养，离心收集菌体，再用MS液体培养基悬浮。用悬浮的农杆菌感染容易分化的植物组织，然后通过组织培养获得转基因小苗，再利用抗生素筛选获得转基因植株。
四、F3′5′H基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测
为了确认用抗生素筛选获得的转基因植物确实含有F3′5′H基因，用利用2XT5Direct PCR Kit(Plant)试剂盒对筛选到的转基因植物做进一步的鉴定。首先提取转基因植物的基因组DNA,然后以植物基因组DNA为模板，用F3′5′H基因内部片段的特异性引物做PCR检测，进行分析，其结构显示如图3所示。
为了考察在含有F3′5′H基因的转基因植株中F3′5′H基因的表达情况，从转基因植物中提取总RNA,反转录合成cDNA后用于QPCR分析，检测F3′5′H基因在转基因植物中的表达水平。以cDNA为模板，用F3′5′H基因特异性引物做PCR，经QPCR确认的阳性转基因植株用于后续的花青素含量等测定实验。
五、转基因植株颜色变化的实验
将转F3′5′H基因的以及对照野生型小芽在培养基中培养成苗，转F3′5′H基因植物铁皮石斛茎秆和叶片显示出紫红色，说明叶斑艺兰F3′5′H基因确实改变了植株颜色，达到预期效果，进行各项生理指标的测定，得到了表1、图5、图6、图7的测定结果，实验结果表明在转基因铁皮石斛中F3′5′H基因能够正常表达，转入F3′5′H基因的生长情况比对照植株(未转基因的野生型)，转基因植株表现为更健壮，茎秆和叶片显示紫红色的特点，过量表达F3′5′H基因能够很大程度的提高增加转基因铁皮石斛中F3′5′H酶活性，蛋白质含量、可溶性糖含量增加，花青素和类黄酮物质含量增加。
表1转基因铁皮石斛组培苗的形态特征
<110> 云南农业大学
<120> 叶斑艺兰花 F3'5'H基因的植物表达载体构建及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1512
<212> DNA
<213> 叶斑艺兰花(Cymbidium)
<400> 1
atgtctatct tcctcatcgc agccctcctg ctctgccttt tcctcctcct cctcctccgc 60
cgccgccgcg gttgtctccc cctccctcca ggaccaccta acttccctat ccttggcgct 120
ctgcccttca tcggccccat gccacactcc gctctcgctc tccttgcacg tcactacggc 180
cccatcatgt tcctcaagat gggcacccgg cgcgtcgtcg tagcgtcatc cgccgccgca 240
gctcgatcgt ttctcaaaac cctcgactcc cacttctccg accgccccac cggcatcatc 300
tccaaggaaa tcagctacaa cggccagaac atggtctttg ccgactacgg cccaaagtgg 360
aagctcctcc gcaaagtctc cagcctccat cttctcggtt ccaaggccat gtcccgttgg 420
tccggcgtgc ggcgcgatga ggccttctcc acgcttcaat tcttgaagaa tcggagcgat 480
tctggaaagc cggtgttgct tccgaattta ctggtttgtg ccatggcgaa tgtgataggg 540
aggatttcca tgagcaagag ggtatttgat gaggacggga aggaggcgaa ggagttcaag 600
gagatgatca aggagctttt ggttgggcag ggggcatcga atatcgggga tttggtgcct 660
gggatcaggt ggttggatcc gcagggagtg aggaagaaga tgctgggatt gaatcgcagg 720
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gggaaccctg atctgttgga tcttatgatg gctaataaag taactggtga ggatggggag 840
gggctcaacg aggaaaacat caagggcttc atatctgatc tgttcgtagc ggggacggac 900
acgtccgcca tagtcataga gtgggcgatg gcggagatgc taaaaaatcc agcgatcctc 960
cgacgagcgc aagaggaaac cgaccgcgtc gtcggccgcc accgccttct cgacgaatcc 1020
gacataccga atctccccta cctccaagcc atctgcaagg aagctctgcg aaagcatccc 1080
ccaactcctc tcagcatacc tcactacgcc tccgagccct gcgaggtgga aggttacagc 1140
attccaggca agacatggct ctttgtcaac atatgggcca tcggccggga cccggacgtg 1200
tgggaggagc cgttggcgtt cgatccggag aggttcctgc aaggaaagat ggcgaagatt 1260
gatcccatgg gaaacgactt tgagctgata ccgttcggag cggggcggag gatttgcgcc 1320
gggaagttaa tggggatgct gatggtgcag tatttcttgg gaacattggt gcacgctttc 1380
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aggcttgatt aa 1512