基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用
阅读说明：本技术 基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用 (CRRNA (crribonucleic acid) of specific targeting F3-T3 fusion gene based on CRISPR-Cas13a system and application ) 是由 康春生 武烨 王琦雪 于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明创造提供了基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用,所述crRNA的序列如SEQID NO：1所示。本发明创造所述的crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统能够明显抑制胶质瘤细胞增殖。(The invention provides CRRNA based on CRISPR-Cas13a system specificity targeting F3-T3 fusion gene and application thereof, wherein the sequence of the CRRNA is shown as SEQID NO: 1 is shown. The CRRNA-mediated CRISPR-Cas13a gene editing system can obviously inhibit glioma cell proliferation.)
技术领域
本发明创造属于生物领域，尤其是涉及基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用。
背景技术
Cas13a是一种RNA引导的CRISPR效应子，能靶向并切割单链RNA (ssRNA)，作为RNA病毒感染性疾病和恶性肿瘤的治疗和诊断工具，引起了极大的关注。CRISPR-Cas13a系统由两个部分组成，包括靶向RNA的CRISPR-RNA(crRNA)和由crRNA引导的RNA酶Cas13a。迄今为止，CRISPR-Cas13a系统被认为是一种在转录水平上直接抑制基因表达的方法。与Cas9相比，Cas13a提供了一种可能更安全的替代方案，因为它会导致功能表型丧失，但不会扰乱基因组。更加重要的是，Cas13a具有独特的“附带切割”效应：在识别其靶RNA后，活化的Cas13a不仅对靶RNA表现出切割作用，而且对非靶RNA也表现出切割作用。
FGFR3-TACC3(F3-T3)融合基因首次在胶质母细胞瘤样本中报道，已成为多种癌症的致癌驱动因子，包括尿路上皮癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、头颈癌、胃肠道癌恶性肿瘤和恶性黑色素瘤。预计大约 1.2-8.3％的GBM会携带这种染色体易位。编码FGFR3和TACC3的基因位于人类染色体4p16，相距48kb，代表恶性胶质瘤中最常见的FGFR-TACC染色体重排。FGFR-TACC融合是有效的癌基因，具有促生长作用并诱导非整倍性。但是，其细胞内信号通路尚不清楚。携带FGFR-TACC融合的肿瘤患者预后不良，死亡率高。目前，针对 FGFR3-TACC3融合蛋白仅限于针对FGFRs的激酶抑制剂，这些小分子化合物是典型的多激酶抑制剂，靶向FGFR和其他酪氨酸激酶。因此，精确靶向FGFR3-TACC3将减少不良反应，对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的 crRNA，其序列如SEQID NO：1所示。
一种应用上述crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统。
一种上述crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统在抑制癌细胞增殖或杀伤肿瘤细胞中的应用。
优选的，所述crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统通过触发旁效应引起RNA降解来抑制肿瘤细胞增殖或杀伤肿瘤细胞。
优选的，所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞。
更优选的，所述胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤细胞。
优选的，所述胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞U87细胞或TBD0220细胞。
一种上述crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统在特异性靶向FGFR3-TACC3融合基因中的应用。
优选的，所述Cas13a基因在肿瘤细胞中的表达载体为慢病毒表达载体。
更优选的，所述慢病毒表达载体为p GV341。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
(1)本发明创造所述的crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统具有较高的目的基因敲低效率；
(2)本发明创造所述的crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统可触发旁效应；
(3)本发明创造所述的crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统能够明显抑制胶质瘤细胞增殖；
(4)本发明创造所述的crRNA介导的CRISPR-Cas13a基因编辑系统能够抑制小鼠颅内肿瘤的形成。
附图说明
图1为本发明创造所述的crRNA1对目的基因的敲低效率图(图1A为四种crRNA在U87-F3-T3-Cas13a细胞中敲低F3-T3 mRNA的效率，图1B为四种crRNA在TBD0220-F3-T3-Cas13a细胞中敲低 F3-T3 mRNA的效率)；
图2为本发明创造所述的Cas13a-crRNA1触发旁效应图(图2A 为从U87和TBD0220细胞群中分离出的总RNA的电泳图，图2B为在 Agilent 2100上测定的RNA完整值；图2C为在Agilent 2100上测定的28S:18S比率)；
图3为本发明创造所述的Cas13a-crRNA1抑制胶质瘤细胞增殖图 (图3A为在U87和TBD0220细胞中进行的集落形成分析的图像，图3B为图3A中菌落数的量化图，图3C为用CCK8测定U87细胞的生长曲线，图3D为用CCK8测定TBD0220细胞的生长曲线)；
图4本发明创造所述的Cas13a-crRNA1抑制小鼠颅内肿瘤的形成图(图4A为在植入后第7、14和21天拍摄植入颅内肿瘤的小鼠的代表性生物发光图像；图4B为在植入后第7、14和21天拍摄植入颅内肿瘤的小鼠的生物发光量化信号强度图；图4C为小鼠的生存曲线)。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1 crRNA的设计
遵循叠瓦状的设计原则，设计靶向特异性片段的crRNA文库，共包含4个crRNA：
crRNA1：
5’-GGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCUUUACGUCGGUGGACGUCACGGUAAG-3’
crRNA2：
5’-GGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCGCCUUUACGUCGGUGGACGUCACGGU-3’
crRNA3：
5’-GGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUGUCGCCUUUACGUCGGUGGACGUCAC-3’
crRNA4：
5’-GGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCUGUGUCGCCUUUACGUCGGUGGACGU-3’
实施例2筛选最佳crRNA序列
计算机模拟crRNA与Cas13a蛋白、靶RNA的对接，计算出 Cas13a-crRNA、Cas13a-crRNA-RNA复合物的结合能，根据结合能大小进行筛选，由于结合能越小，复合物越稳定，结合能最小的crRNA1 为计算机筛选出的潜在最佳crRNA序列。
实施例3 Cas13a慢病毒的包装
Cas13a慢病毒表达载体选用p GV341。采用瞬时共转染法，将含有表达Cas13a的质粒和包装质粒等转染体系转入HEK293T细胞，使细胞内进行慢病毒的包装。包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外培养上清中，收集上清获取慢病毒。
实施例4 crRNA的合成
(1)使用T7侧翼引物，通过PCR生成crRNA的DNA模板。在 95℃下加热5分钟使反应混合物变性，随后在冰上急冷10分钟，并在72℃下孵育30分钟来进行引物延伸。
(2)使用T7 sgRNA MICscriptTM试剂盒(Biomics Biotech，江苏，中国)将T7 PCR产物进行体外转录。
(3)使用EzOmicsTM RNA Quick Clear试剂盒(Biomics Biotech，江苏，中国)对转录的crRNA进行纯化。
实施例5细胞培养和转染
人胶质瘤细胞U87细胞和TBD0220细胞在10％FBS，和1％青霉素-链霉素的DMEM和DMEM-F12培养基中培养。置于37℃和5％CO2的环境中生长，每隔1天更换1次培养基。用Lipofectamine R3000 (Invitrogen，加利福尼亚，美国)将crRNA转染到细胞中。
实施例6利用qRT-PCR在细胞水平检测crRNA敲低目的基因的效率
将细胞在TRIzol试剂(Invitrogen，加利福尼亚，美国)中裂解。按照TRIzol：氯仿的体积5：1的比例加入氯仿，震荡10秒，静置2分钟。12,000g离心(4℃)15min，取上清。加入适量异丙醇，混匀后静置10min。12,000g离心(4℃)10min，弃上清。加入适量75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，7500g离心(4℃)5min，弃上清。晾干后加入适量的DEPC H2O溶解RNA。然后使用逆转录试剂盒(RR047A，TaKaRa，日本)进行cDNA的合成。用SYBR Green Master Mix试剂(LifeTechnologies)在DNA Engine Opticon 2两色qRT-PCR 检测系统上进行qRT-PCR实验。所用PCR引物包括：
FGFR3-TACC3-F:5’-CCAACTGCACACACGACCT-3’；
FGFR3-TACC3-R:5’-TCCTCCTGTGTCGCCTTTAC-3’；
GAPDH-F:5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；
GAPDH-R:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；
检测结果见图1，由图1A和图1B可以看出，本发明的crRNA1 对于U87-F3-T3-Cas13a和TBD0220-F3-T3-Cas13a细胞中敲低目的基因F3-T3 mRNA的效率最高。
实施例7安捷伦2100质控验证旁效应
用实施例6的方法抽提RNA，在安捷伦2100质控平台上上机检测。检测结果见图2，由图2可以看出，本发明的Cas13a-crRNA1可触发旁效应，并引起广泛的RNA降解。
实施例8细胞水平验证Cas13a-cr1可以抑制胶质瘤细胞增殖
(1)平板克隆：取生长状态良好的肿瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，离心后，用培养基重悬细胞并吹打成单细胞悬液备用。倍数稀释细胞悬液，每组的细胞分别按照每六孔板每孔50、100和 200个细胞的数量接种，孔里包含2mL培养基，然后一定要把细胞晃动至分散均匀。然后在培养箱中培养2周左右。期间注意换液。经常观察，当孔里出现肉眼可见的细胞团块时，即可终止培养。吸弃上清，用PBS洗2次取出培基。加入4％多聚甲醛没过细胞，室温固定15分钟。然后吸弃固定液，加入少量结晶紫染液没过细胞即可，室温15分钟，然后用缓慢的流间接冲洗染色液，看到好的克隆后，空气干燥。将六孔板倒置并在下面放一张带网格的胶片，计数克隆数量，并拍照。检测结果见图3A-3B所示，由图3A-3B可以看出，本发明的Cas13a-crRNA1可明显抑制胶质细胞瘤的增殖。
(2)CCK-8法细胞活性实验：将96孔板中，每孔加入100ul的细胞悬液，悬液包含处于对数生长期的肿瘤细胞2000-3000个。将培养板放在培养箱预贴壁培养24小时(37℃，5％CO2的孵育条件)。按需求对培养板进行分组，每组3-5个重复孔。向培养板每孔加入 10ul不同的处理。将培养板在培养箱孵育适当的时间(实验时间为 48小时)。孵育后向每孔悬液中加入10ul CCK-8溶液(注意操作过程不要在孔中生成气泡，会影响O.D值，也不要接触培养板底部的细胞，以免造成细胞死亡)。按需求继续将96孔板在培养箱内孵育 1-4小时。用酶标仪检测450nm处的吸光度，并记录数据。生长曲线检测结果如图3C-3D所示，从图3C-3D中可以看出，同样可以得出，本发明的Cas13a-crRNA1可明显抑制U87和TBD0220细胞的增殖。
实施例9动物水平验证Cas13a-cr1可以抑制颅内肿瘤形成
五周大的雌性裸鼠(中国医学科学院肿瘤研究所)被用来建立颅内原位肿瘤模型。U87和U87-FGFR3-TACC3细胞被用来作为细胞模型。用小动物的立体定向仪将培养好的组织立体定位植入裸鼠的颅内区域。手术在无菌环境下进行，步骤包括：气体麻醉小鼠，然后切开头部皮肤，在颅骨中线右侧2mm处钻孔，之后在立体定向仪辅助下将 50万细胞打入颅内2mm处，最后缝合皮肤。在第7、14、21天，使用生物发光成像检测小鼠的颅内肿瘤生长状态。试验结果见图 4A-4C，实验结果表明，本发明的Cas13a-crRNA1组可明显抑制小鼠颅内肿瘤的形成，提高小鼠的生存率和生存时间。
综上所述，本发明的crRNA引导的CRISPR-Cas13a可提高敲低目的基因的效率，触发旁效应，进而引起广泛的RNA降解，并起到抑制胶质瘤细胞的增殖，抑制颅内肿瘤的形成。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 天津医科大学总医院
<120> 基于CRISPR-Cas13a系统特异性靶向F3-T3融合基因的crRNA及应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacccu uuacgucggu ggacgucacg 60
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