一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用 (Method for regulating and controlling synthesis of unsaturated fatty acid in synechocystis and application thereof ) 是由 陈高 钟怀荣 曹月蕾 范仲学 崔晓艳 于金慧 李燕乐 路晓媛 于 2020-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种丝氨酸/苏氨酸激酶基因在集胞藻不饱和脂肪酸合成中的应用,构建了集胞藻PCC6803中的spkD基因敲除突变株和spkG基因敲除突变株；本发明首次公开了集胞藻PCC6803中的spkD和spkG基因在改变集胞藻合成不饱和脂肪酸中的重要作用,突变株在正常培养条件下细胞中的C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C18:4等脂肪酸的含量明显低于野生型的集胞藻；spkD和spkG两种基因在培养前期与集胞藻多不饱和脂肪酸的产量呈负相关,为下一步通过协同调控spkD和spkG基因表达进而提高蓝藻中亚油酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸等多不饱和脂肪酸的含量奠定基础。(The invention relates to an application of serine/threonine kinase gene in synechocystis unsaturated fatty acid synthesis, and constructs a spkD gene knockout mutant strain and a spkG gene knockout mutant strain in synechocystis PCC 6803; the invention discloses the important function of spkD and spkG genes in synechocystis PCC6803 in changing the synthesis of unsaturated fatty acid by synechocystis for the first time, and the content of fatty acid such as C18:2, C18:3n6, C18:3n3, C18:4 and the like in the mutant strain in cells under normal culture conditions is obviously lower than that of wild synechocystis; the spkD and spkG genes are negatively related to the yield of polyunsaturated fatty acid of synechocystis before culture, and a foundation is laid for further improving the content of polyunsaturated fatty acid such as linoleic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid and the like in the blue algae by synergistically regulating the expression of the spkD and spkG genes.)
本申请为申请号202010159165.9、申请日2020年03月09日、发明名称“一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
蓝藻(Cyanobacteria)是一类具有光合自养能力的原核生物。蓝藻细胞能进行自养生长，可以不依赖外界的有机物生存，能利用简单的无机物合成有机物为生命活动提供能量，外源基因表达产生的蛋白质能充分进行折叠、组装，这意味着蓝藻几乎不形成包涵体，并且多数蓝藻及其细胞提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC6803(Synechocystis sp.PCC6803)作为一种单细胞蓝藻，具有结构简单、遗传背景简单、易于培养、便于构建载体、提取物安全、细胞内蛋白酶活性低等特点，是很好的蓝藻基因工程受体。
在外部环境发生变化时，蓝藻依靠包括丝氨酸/苏氨酸激酶系统(serine/threonine kinases system,STKs)在内的两个主要的信号转导系统迅速感知变化，并通过精准调控基因表达，使得相关代谢物发生改变，使蓝藻对外界环境的变化做出积极快速的响应，从而在各种逆境中得以生存下来。
丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)是原核生物所必需的，它参与生长，分裂和分化等活动。STK与其同源磷酸酶一起通过催化可逆蛋白磷酸化来发挥核心作用。在感测到外部刺激后，STK经历自身磷酸化，然后使底物蛋白转磷酸化。特定氨基酸残基的磷酸化可以直接控制靶蛋白的活性或间接通过调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用来发挥作用。
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个及以上的双键并且碳原子数目为16-22的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(C18:2，LA)、γ-亚麻酸(C18:3n6，GLA)、α-亚麻酸(C18:3n3，ALA)、十八碳四烯酸(C18:4，SDA)、花生四烯酸(C20:4n6，AA)、二十碳五烯酸(C20:5n3，EPA)、二十二碳六烯酸(C22:6n3，DHA)等。根据不饱和键起始于脂肪酸碳链甲基端的位置，利用ω(omega)-编号系统将多不饱和脂肪酸分为多种。具有重要功能的是ω-3类和ω-6类，其中LA、GLA、AA等属于ω-6类多不饱和脂肪酸，ALA、SDA、EPA，DHA等属于ω-3类多不饱和脂肪酸。
PUFAs对人体的健康具有极其重要的作用。亚油酸和亚麻酸是人体必须的多不饱和脂肪酸，它们在人体内不能合成。硬脂酸在工业和化妆品应用中较多。花生四烯酸在人体内不能大量合成。对人体最重要的是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸与其类似物。PUFAs也在动物饲料、能源行业发挥了不可替代的作用。
目前AA等脂肪酸的来源主要是肉类、奶类和鸡蛋。而EPA、DHA的商业来源主要为深海鱼类。但近年来深海鱼类的过度捕捞导致的资源短缺大大限制了PUFAs的生产。从转基因蓝藻中提取PUFAs工艺相对简单，蓝藻相对深海鱼类资源的数量可谓是取之不尽用之不竭，另外没有特殊的异味，胆固醇含量较低。而且随着地球环境日益变化，植物资源受地域及季节限制、环境恶化等影响越来越大，另外海洋鱼类资源日益枯竭及来源于鱼油的PUFAs提纯过程中残留鱼腥味及氧化不稳定性等问题，突出了蓝藻可工厂化养殖不受季节、地域影响，蓝藻资源数量丰富，生产过程无异味等生产不饱和脂肪酸的优点。
近年来，向集胞藻PCC6803中转入合成不饱和脂肪酸调控酶基因来得到高产不饱和脂肪酸的突变株取得了较大进展。如中国专利文献CN103014037A(申请号201210529390.2)公开了一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。该方法发现其他生物合成不饱和脂肪酸调控酶的基因可以在集胞藻PCC6803中表达，利用这些基因可以在集胞藻PCC6803中表达相应调控酶，得到相应不饱和脂肪酸。为扩展集胞藻PCC6803中的不饱和脂肪酸代谢通路提供了研究方法。
该方法虽然可以增加集胞藻中不饱和脂肪酸的含量，但是不能再进一步提升不饱和脂肪酸的含量。因此，寻找新的途径来进一步提升不饱和脂肪酸的含量成为新的热点。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用。我们利用插入失活手段分别构建了集胞藻2个STKs激酶基因(spkD基因和spkG基因)敲除突变株，并检测了野生型和突变株中PUFAs(多不饱和脂肪酸)含量和脂肪酸脱氢酶基因表达。结果表明，在培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下野生型集胞藻PCC6803中spkD和spkG基因相对表达量显著高于spkD敲除突变株和spkG基因敲除突变株。脂肪酸检测结果首次发现上述2个STKs激酶spkD基因和spkG具有调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的作用。STKs激酶spkD基因和spkG在调控集胞藻PUFAs生物合成方面发挥一定作用。
本发明首次公开了丝氨酸/苏氨酸激酶spkD基因和spkG基因分别在集胞藻不饱和脂肪酸合成中存在重要作用。
本发明技术方案如下：
spkD基因在不饱和脂肪酸合成中的应用，所述spkD基因作为调控亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸表达量的基因；所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法I；包括步骤如下：
(1)用引物对spkD-F，spkD-R对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增，得到spkD基因；
(2)扩增后的spkD片段与pClone007 simple载体连接，然后转化入大肠杆菌DH5α中进行克隆，得到007-spkD质粒；
(3)将007-spkD质粒使用EcoR I内切酶进行酶切，将spkD基因切开，EcoR I内切酶的酶切位点前的spkD基因片段作为同源重组上游臂，酶切位点后的spkD基因片段作为同源重组下游臂；
(4)用EcoR I内切酶酶切质粒pBluescript-Kan，回收卡那霉素片段，与同样经EcoR I内切酶酶切的步骤(3)制得的质粒007-spkD连接，制得质粒007-spkD-kan；
(5)将步骤(4)制得的重组载体007-spkD-kan转化到集胞藻PCC6803，经筛选，制得敲除spkD基因的集胞藻突变株；
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，spkD基因以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spkD-F：5’-ACTTACCCGTTCTGATTGA-3’ SEQ ID NO.1；
spkD-R：5’-TAACCATTGATAAGCAGAT-3’ SEQ ID NO.2。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增体系如下：
2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-F 1μL，引物spkD-R 1μL，ddH2O 7μL，共计20μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min，94℃变性25s，60℃复性25s，72℃延伸lmin，35个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
上述制备的敲除spkD基因的集胞藻突变株用于不饱和脂肪酸的合成。
spkG基因在不饱和脂肪酸合成中的应用，所述spkG基因作为调控亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸表达量的基因；所述spkG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法II；包括步骤如下：
a用引物对spkG-F，spkG-R对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增，得到spkG基因；
b扩增后的spkG片段与pClone007 simple载体连接，然后转化入大肠杆菌DH5α中进行克隆，得到007-spkG质粒；
c将007-spkG质粒使用BamHⅠ内切酶进行酶切，将spkG基因切开，BamHⅠ内切酶的酶切位点前的spkG基因片段作为同源重组上游臂，酶切位点后的spkG基因片段作为同源重组下游臂；
d用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Kan，回收卡那霉素片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤c制得的质粒007-spkG连接，制得质粒007-spkG-kan；
e将步骤d制得的重组载体007-spkG-kan转化到集胞藻PCC6803，经筛选，制得敲除spkG基因的集胞藻突变株。
根据本发明优选的，所述步骤a中，spkG基因以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spkG-F：5’-AGACTTTCTCTATTGCCTC-3’ SEQ ID NO.3；
spkG-R：5’-GGACCCAAATCCAGAAGAC-3’ SEQ ID NO.4。
根据本发明优选的，所述步骤a中，PCR扩增体系如下：
2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkG-F 1μL，引物spkG-R 1μL，ddH2O 7μL，共计20μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min，94℃变性25s，60℃复性25s，72℃延伸lmin，35个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
上述制备的敲除spkG基因的集胞藻突变株用于不饱和脂肪酸的合成。
所述spkD和spkG基因是集胞藻中的两个丝氨酸/苏氨酸激酶基因。
所述pClone007 simple载体为市售产品。
有益效果
1.本发明首次公开了丝氨酸/苏氨酸激酶spkD基因(简称spkD)和spkG基因(简称spkG)在集胞藻不饱和脂肪酸合成中存在重要作用，本发明通过在集胞藻PCC6803中利用插入失活方法将spkD和spkG敲除后，在培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下，突变株中的多不饱和脂肪酸的含量发生了变化，敲除突变株中的亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3n6)、α-亚麻酸(C18:3n3)、十八碳四烯酸(C18:4)的含量明显低于野生型集胞藻。
2.本发明首次在集胞藻PCC6803中敲除了丝氨酸/苏氨酸激酶spkD基因和spkG基因，这对于进一步提高集胞藻中的不饱和脂肪酸的含量存在重大意义，这为集胞藻PCC6803中不饱和脂肪酸的研究提供了理论支持。
3.本发明在集胞藻PCC6803中，通过插入失活的方式敲除了丝氨酸/苏氨酸激酶spkD基因和spkG基因以后，在相同培养条件下，不同时间段内分别比较野生型和突变株中四种脂肪酸脱氢酶基因表达的差异，发现上述两种突变株中脂肪酸脱氢酶相关基因均呈现下降趋势，spkD敲除突变株的脂肪酸脱氢酶的基因表达量高于spkG敲除突变株，在对spkD敲除突变株的研究中，发现在培养初始阶段突变株的脂肪酸脱氢酶基因表达量明显高于野生型，并在培养初始6h时突变株的脂肪酸脱氢酶基因表达相对于野生型差异最为显著，但随着培养时间的延长，这种差异越来越小，并最终表现为野生型占优势，说明spkD的敲除，对脂肪酸脱氢酶基因表达产生影响。在对spkG敲除突变株的研究终，发现在培养初始6h时脂肪酸脱氢酶基因的表达量达到了最高，高于野生型的表达量，但是差异较小，6h之后野生型中脂肪酸脱氢酶含量呈现出上升的趋势，最后高于spkG敲除突变株，说明spkG的敲除，对脂肪酸脱氢酶基因表达产生影响。由此说明，spkD和spkG对集胞藻中脂肪酸脱氢酶基因有极大地相关性。且spkG相比于spkD对脂肪酸脱氢酶基因的影响更大。在培养144h时，基因敲除的突变株相对于野生型进一步抑制了脂肪酸脱氢酶基因的表达，因此突变株中相关基因的表达进一步降低。以上结果表明spkD和spkG两种基因在培养前期与集胞藻多不饱和脂肪酸产量呈负相关。这为提高集胞藻PCC6803中多不饱和脂肪酸的研究提供了新的思路。
附图说明
图1为集胞藻PCC6803 spkD和spkG基因敲除原理图；
图中:(A)为spkD基因敲除原理图；(B)为spkG基因敲除原理图；
图2为集胞藻PCC6803 spkD和spkG基因敲除突变体PCR扩增电泳检测图；
图中:电泳图(A)，M为Trans 5k Marker,WT为野生型集胞藻PCR扩增结果，1为spkD基因敲除的集胞藻PCR扩增结果；电泳图(B)，M为Trans 5k Marker,WT为野生型集胞藻PCR扩增结果，1为spkG基因敲除的集胞藻PCR扩增结果。
图3为集胞藻PCC6803 spkD和spkG基因敲除突变株以及野生型中脂肪酸组成含量柱状图；
图中：C18:2，亚油酸；C18:3n6，γ-亚麻酸；C18:3n3，α-亚麻酸；C18:4，十八碳四烯酸；others，其它脂肪酸。
图4为集胞藻PCC6803 spkD和spkG基因敲除突变株以及野生型中脂肪酸脱氢酶基因表达变化图；
图中：(A)为培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下藻株Δ6脂肪酸脱氢酶基因表达变化；(B)为培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下藻株Δ9脂肪酸脱氢酶基因表达变化；(C)为培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下藻株Δ12脂肪酸脱氢酶基因表达变化；(D)为培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下藻株Δ15脂肪酸脱氢酶基因表达变化。
具体实施方式
以下实施例描述了本发明丝氨酸/苏氨酸激酶基因在集胞藻不饱和脂肪酸合成中的应用。下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
材料来源
大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；
pClone007 simple载体购自北京擎科新业生物技术有限公司；
野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；下述野生型集胞藻，均为野生型集胞藻PCC6803
质粒pBluescript-Kan购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；
BG-11培养基购自上海光语生物科技有限公司；
硝酸纤维素滤膜购自上海安谱实验科技股份有限公司；
中性酚试剂购自Invitrogen公司；
玻璃珠购自sigma公司；
Trans 5k Marker购自北京全式金生物技术有限公司；
Trizol试剂购自Invitrogen公司
M-MLV逆转录酶购自宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)；
2×SYBR Green I PCR Master Mix购自宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)；
其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为普通市售产品。
实施例1
spkD基因克隆及插入快速连接载体和spkG基因克隆及插入快速连接载体：
用引物对对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增后电泳，spkD基因片段长度为1.9kb spkD基因序列为SEQ ID NO.17，验证正确，切胶回收；所述引物对如下：
spkD-F：5’-ACTTACCCGTTCTGATTGA-3’SEQ ID NO.1
spkD-R：5’-TAACCATTGATAA GCAGAT-3’SEQ ID NO.2；
用引物对对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增后电泳，spkG基因片段长度为1.9kb spkG基因基因序列为SEQ ID NO.18，验证正确，切胶回收；所述引物对如下：
spkG-F：5’-AGACTTTCTCTATTGCCTC-3’SEQ ID NO.3
spkG-R：5’-GGACCCAAATCCAGAAGAC-3’SEQ ID NO.4。
PCR扩增体系如下：
2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-F 1μL，引物spkD-R 1μL，ddH2O 7μL，共计20μL。
2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkG-F 1μL，引物spkG-R 1μL，ddH2O 7μL，共计20μL。
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min，94℃变性25s，60℃复性25s，72℃延伸lmin，35个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
将得到的spkD基因和spkG基因分别经TA克隆方法与pClone007 simple载体连接10min，将其转入大肠杆菌DH5α，具体操作如下：将上述基因质粒分别和大肠杆菌DH5α制得混合物置于冰浴30min，后42℃，热激90s，然后迅速置于冰浴3min，各加入750μL LB液体培养基，37℃，170rpm复活45min。取200μL上述复活后的菌液平铺到含有氨苄青霉素(50mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的LB固体平板上，用玻璃涂棒涂匀，37℃培养3h至菌液被完全吸收，将平板倒置，37℃过夜。长出单克隆后，用牙签从LB固体培养基平板上挑取白色单菌落进行菌落PCR验证，筛选阳性克隆并测序。隔夜用牙签从固体培养基上挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证正确再次用牙签挑取相应的单菌落置于LB+AMP50的液体培养基内，AMP50是指含氨苄青霉素的浓度为50mg/mL，后于37℃、180rpm过夜摇菌，摇菌后提取质粒，分别得到007-spkD和007-spkG质粒。
实施例2
spkD基因敲除(插入失活)和spkG基因敲除(插入失活)质粒的构建：
007-spkD质粒使用EcoRI进行酶切，制得007-spkD-EcoR I。EcoR I的酶切位点在spkD基因片段的0.9kb处，将前0.9kb作为同源重组上游臂，将后1.0kb(spkD基因片段的长度为1.9kb)作为同源重组下游臂。007-spkG质粒使用BamHⅠ进行酶切，制得007-spkG-BamHⅠ。BamHⅠ的酶切位点在spkG基因的前0.9kb处。将前0.9kb作为同源重组上游臂，将后1.0kb(spkG基因片段的长度为1.9kb)作为同源重组下游臂。
用EcoRI内切酶酶切质粒pBluescript-Kan(提供卡纳霉素抗性片段)，电泳切胶回收卡那霉素片段(1.2kb)，与同样经EcoR I内切酶酶切制得的质粒007-spkD-EcoR I连接，制得质粒007-spkD-kan。
用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Kan(提供卡纳霉素抗性片段)，电泳切胶回收卡那霉素片段(1.2kb)，与同样经BamH I内切酶酶切制得的质粒007-spkG BamHⅠ连接，制得质粒007-spkG-kan。
实施例3
spkD基因敲除(插入失活)突变株和spkG基因敲除(插入失活)突变株的获得：
取对数培养期(OD730＝0.6)(培养条件：BG-11液体培养基，30℃，光照条件40μmol·m-2·s-1)的集胞藻PCC6803培养液30ml，在室温条件下，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11液体培养基洗涤一次后，离心，去掉培养液，加新鲜BG-11液体培养基至终浓度OD730＝4.8，并立刻用来转化，具体转化过程；将收集的藻液分装到1.5mlEP管中(每管400μl)，每管加5μg质粒(分别为实施例2制备的质粒007-spkD-kan和007-spkG-kan)，弱光条件下光照温育6小时(光照条件：10μmol·m-2·s-1，温度为30℃)，期间轻微颠倒混匀一次。然后，将集胞藻与质粒混合培养物涂在硝酸纤维素滤膜上，在光照培养箱中培养24h后(培养条件：30℃，光照条件40μmol·m-2·s-1)，转入BG-11+50ug/mL卡纳霉素的固体培养基上培养，10天长出单克隆藻株。
用接种环挑取单克隆藻株涂在相应抗生素浓度较高(卡纳霉素分别为100ug/mL，150ug/mL)的BG-11平板上进行培养，进一步分离纯化后接入BG-11液体培养基中置于摇床上振荡培养(培养条件：30℃，180rpm，光照条件40μmol·m-2·s-1)。分别获得spkD基因敲除(插入失活)突变株藻液和spkG基因敲除(插入失活)突变株藻液。
实施例4
spkD基因敲除突变株和spkG基因敲除突变株的PCR检测：
采用中性酚试剂并利用玻璃珠震荡法分别从spkD基因敲除和spkG基因敲除的集胞藻和野生型集胞藻中提取DNA。具体操作步骤如下：取50mL OD730＝1.8的蓝藻(分别为spkD基因敲除突变株、spkG基因敲除突变株、野生型集胞藻)，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，加入0.4mLTE缓冲液和0.4mL中性酚，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以2000rpm速度震荡1min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5m1离心管中，加入0.5mL等体积的酚/氯仿(体积比为1:1)，颠倒混匀15s，静置4min，4℃，11900rpm离心10min。取上清液到新的1.5m1离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃冰箱沉降1.5h。4℃，11900rpm离心10min，去上清液，加入1ml75％乙醇(V/V)，颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心10min，弃上清液，室温下敞口晾干至沉淀透明，加入50μlTE缓冲液溶解沉淀，分别制得spkD基因敲除藻株、spkG基因敲除藻株、野生型集胞藻总DNA。
以spkD基因敲除的集胞藻、spkG基因敲除的集胞藻和野生型集胞藻DNA为模板，分别以spkD-F SEQ ID NO.1，spkD-R SEQ ID NO.2和spkG-F SEQ ID NO.3，spkG-R SEQ IDNO.4为引物对，进行PCR扩增。
PCR扩增体系如下：
10×PCR buffer 2uL，dNTP(2.5mM each)2.5uL，Mg2+2uL，Taq酶(5U/uL)0.5uL，引物F(10uM)1uL，引物R(10uM)1uL，ddH2O 20uL。
具体扩增程序如下：
95℃预变性3min，94℃变性25s，60℃复性25s，72℃延伸lmin，35个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
电泳检测PCR产物如图2所示。图中，电泳图(A)，M为Trans 5k Marker，WT为野生型集胞藻PCR扩增结果，1为spkD基因敲除的集胞藻PCR扩增结果；电泳图(B)，M为Trans 5kMarker，WT为野生型集胞藻PCR扩增结果，1为spkG基因敲除的集胞藻PCR扩增结果。
实施例5
集胞藻PCC6803 spkD基因敲除藻株和spkG基因敲除藻株气相色谱-质谱检测：
将野生型集胞藻PCC6803、spkD基因敲除藻株、spkG基因敲除藻株分别接种于50mlBG-11液体培养基中(培养条件：30℃，180rpm，光照条件40μmol·m-2·s-1)，于对数生长期OD730＝5.0离心收集藻细胞，真空干燥。
准确称取粉碎的干藻粉0.2g，放入研钵中，加入液氮反复研磨至粉末；
用7.0ml甲醇-氯仿(2：1，V:V)提取，超声10min混匀，离心分离15min 6000rpm后，保留有机相提取液，残渣再加1.5ml甲醇-氯仿(2：1，V:V)，离心分离，保留有机相提取液，残渣再加1.5ml甲醇-氯仿(2：1，V:V)，离心分离；保留有机相提取液。
合并有机相提取液转移到分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0ml1％氯化钠溶液，静置分层，回收下层，置于提脂瓶中，50℃氮气挥干溶剂至恒重，于天平称量得到藻类总脂的总重量。
将藻类总脂进一步甲酯化，将其进行相色谱-质谱检测，脂肪酸含量分析数据如图3所示。
如图3所示，在野生型中亚油酸(C18:2)、γ-亚麻酸(C18:3n6)、α-亚麻酸(C18:3n3)、十八碳四烯酸(C18:4)的含量明显高于spkD和spkG基因敲除突变株。
实施例6
RNA分离和cDNA合成：
在指数生长期(培养条件：BG-11液体培养基，30℃，180rpm，光照条件40μmol·m-2·s-1)培养并收获相同细胞浓度的野生型集胞藻PCC6803、spkD基因敲除藻株和spkG基因敲除藻株，并使用Trizol试剂分离总RNA，使用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA，并按照M-MLV逆转录酶制造商的说明修改寡核苷酸(dT)合成cDNA。
集胞藻PCC6803 spkD和spkG基因敲除藻株的脂肪酸脱氢酶基因表达变化的检测：
用Bio-Rad iQ5进行丝氨酸/苏氨酸激酶表达的定量实时PCR检测，使用以下基因特异性引物PCR扩增得到cDNA序列；按照2×SYBR Green I PCR Master Mix(TaKaRa)制造商的说明制备反应，并使用Bio-Rad iQ5进行qRT-PCR。
所述基因特异性引物如下：
用于扩增rnpB基因的引物对：
rnpB-F：5’-GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3’SEQ ID NO.5
rnpB-R：5’-GGCAGGAAAAAGACCAACCT-3’SEQ ID NO.6
用于扩增16SrRNA基因的引物对：
16S rRNA-F：5’-AGCGTCCGTAGGTGGTTATG-3’SEQ ID NO.7
16S rRNA-R：5’-CTACGCATTTCACCGCTACA-3’SEQ ID NO.8
用于扩增Δ6脂肪酸脱氢酶基因的引物对：
D6-RT-F：5’-GCCATTGATGACGAGTG-3’SEQ ID NO.9
D6-RT-R：5’-TAGCCAGCGATAGTTAGAG-3’SEQ ID NO.10
用于扩增Δ9脂肪酸脱氢酶基因的引物对：
D9-RT-F：5’-GGCATTGGCATTACTTT-3’SEQ ID NO.11
D9-RT-R：5’-CCTTATTAGAATCGTGGG-3’SEQ ID NO.12
用于扩增Δ12脂肪酸脱氢酶基因的引物对：
D12-RT-F：5’-TGGACAGGGACAGCCTTAAC-3’SEQ ID NO.13
D12-RT-R：5’-TTTTGTTGGTGTGGAGGTGA-3’SEQ ID NO.14
用于扩增Δ15脂肪酸脱氢酶基因的引物对：
D15-RT-F：5’-TCGCCTCAAACAAAGC-3’SEQ ID NO.15
D15-RT-R：5’-AATCGGATAGAAGAACCAG-3’SEQ ID NO.16
反应体系如下：
每个PCR在含有2×SYBR Green I PCR Master Mix(TaKaRa)，100nM浓度的每种引物和1μL(按体积比1:20稀释)模板cDNA，总体积为20μL，每个样品3个重复。
反应程序如下：
95℃预变性1min，95℃变性10s，60℃复性30s，72℃延伸30s，42个循环后；额外一个循环：95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸5min，95℃10s。
得到spkD基因敲除突变株、spkG基因敲除突变株和野生型中脂肪酸脱氢酶基因表达变化图，如图4所示，在相同培养条件下，不同时间段内分别比较野生型和突变株中四种脂肪酸脱氢酶基因表达的差异，发现上述两种突变株中脂肪酸脱氢酶相关基因均呈现下降趋势，spkD敲除突变株的脂肪酸脱氢酶的基因表达量高于spkG敲除突变株，在对spkD敲除突变株的研究中，发现在培养初始阶段突变株的脂肪酸脱氢酶基因表达量明显高于野生型，并在培养初始6h时突变株的脂肪酸脱氢酶基因表达相对于野生型差异最为显著，但随着培养时间的延长，这种差异越来越小，并最终表现为野生型占优势，说明spkD的敲除，对脂肪酸脱氢酶基因表达产生影响。在对spkG敲除突变株的研究终，发现在培养初始6h时脂肪酸脱氢酶基因的表达量达到了最高，高于野生型的表达量，但是差异较小，6h之后野生型中脂肪酸脱氢酶含量呈现出上升的趋势，最后高于spkG敲除突变株，说明spkG的敲除，对脂肪酸脱氢酶基因表达产生影响。由此说明，spkD和spkG对集胞藻中脂肪酸脱氢酶基因有极大地相关性。且spkG相比于spkD对脂肪酸脱氢酶基因的影响更大。在培养144h时，基因敲除的突变株相对于野生型进一步抑制了脂肪酸脱氢酶基因的表达，因此突变株中相关基因的表达进一步降低。以上结果表明spkD和spkG两种基因在培养前期与集胞藻多不饱和脂肪酸产量呈负相关。这为提高集胞藻PCC6803中多不饱和脂肪酸的研究提供了新的思路。
以上结果表明，在培养温度为30℃、光照强度为40μmol·m-2·s-1条件下野生型集胞藻PCC6803中spkD和spkG基因相对表达量显著高于spkD敲除突变株和spkG基因敲除突变株。同时，脂肪酸检测结果发现spkD和spkG具有调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的作用。在野生型中亚油酸(C18:2，LA)、γ-亚麻酸(C18:3n6，GLA)、α-亚麻酸(C18:3n3，ALA)和十八碳四烯酸(C18:4，SDA)的含量明显高于spkD和spkG基因敲除突变株。STKs激酶spkD基因和spkG基因在调控集胞藻PUFAs生物合成方面发挥一定作用。
同时，为下一步通过协同调控spkD和spkG基因表达进而提高蓝藻细胞中LA、ALA和SDA等多不饱和脂肪酸的含量奠定基础，进而为利用微藻进行工业化生产二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)提供理论依据和实验方案。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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acactcttac caagaagttg ccagttgaat tttctagcga ccagcaaaca ggccaattag 240
actggcaaag tcatgtatct aaaatcgatt ctgtcttggc taaagtaatc aataaagcca 300
tagaaatgga gcctagtcgt cgttattcca gtgccgaagc aatgtatcag gctctacact 360
ccttaattag ttctggggct gagccagcac ttccaatgga aactgttcga gttgcaccta 420
gtaatgaatt tttagtcacg agaagttcca ccaaaacggc tgaaactgtt gttaagcccg 480
tcggtaactc tcataataac tactcgaaca acaatggaaa atcaaaaatt gcaacgctgt 540
taactgttct tattgggatt attgtggtca ctgctggttt aggaggtggg tttataatta 600
ctcaacaaat taaagaagct gaagctaggg cggctcaagc tgaaaaagaa aaacaggaag 660
cagagcaaaa acgaatagaa gcagagcaaa aaattgccga gaatgaaaaa cgtcaaaggg 720
aattagaaca aaaacgagta gaagaagaac gtcaaagact agctgctgag gccgaacgag 780
ctaagcaaga aaggcagcgt ttagccgcag aaagacagag agttcaagtt ttagcaaatc 840
aggcaaaggc tatggccagc ggtgctagcg caactattgg aggaattcct ggatctaaaa 900
atattcgctc tggtccggga acagattatg gcgttattac tcaaggctat acaggtgagg 960
gtttagacat cttagatagt agtactgatt ccagtggcca tgtttggtat aaagtttatc 1020
actatggttc aggatcaacg gggtggattg ccagtcaatt agtaaacttt tagacttgat 1080
tctaaggaaa atgctaaaat ttttaaaaaa taactttcaa ttggtaaact tttttgttgc 1140
cgctctgtta gtgggaatgt tgtatggttg gtggtactta cctaatgcta aacaattatc 1200
tattaacgaa actagtggca ttcataatca agaaaaaatt ccatctcccc ccccccttga 1260
agatagagag ctttcctctc ttccggttcc cactccgact ccaactaatc tcgaaccatt 1320
aataactgaa gtccccgaaa tccagactag ccccctattg ccaggacttc caccagatta 1380
tgaacaatta tccccgctag cagaacagca aggatcaaga gaagttccca acaatattgc 1440
ggttaaaact aatttaggtc attattcttt ccctgaaaat agccagcaaa gattagtaaa 1500
agtaggtgaa tattacggcc gcagtgaatc tttagatcaa gaagcagcca ctgcttttaa 1560
aaagatgcaa gctgatgctc aagttcaagg agtaagatta actattattt ctggatttcg 1620
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agatatagga gatggtgcta atccagcaaa tgatttaaaa ataaattttg aaaatacatc 1800
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<210> 18
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<400> 18
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agatggaatc actccccgtc ctaggcgtat tttttatggt aaagactgcc aatgtggcgg 120
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