用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒
阅读说明：本技术 用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒 (Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of mRNA ) 是由 N·德赛 G·迪维塔 于 2018-10-15 设计创作，主要内容包括：本申请涉及含肽复合物/纳米颗粒,其可用于将一种或多种mRNA(诸如,治疗性mRNA,如,编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA)递送至细胞内。(The present application relates to peptide-containing complexes/nanoparticles that can be used to deliver one or more mrnas (such as, for example, therapeutic mrnas, e.g., mrnas encoding tumor suppressor proteins) into a cell.)
相关申请
本申请要求2017年10月16日提交的法国申请号1759645以及2018年4月17日提交的法国申请号1853370的优先权权益，其全部出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
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技术领域
本发明涉及可用于将mRNA递送至细胞内的含肽复合物/纳米颗粒。
背景技术
在此引用的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过引用以其全文并入本文。
为了使外源性mRNA或RNAi在治疗上适用，必须将mRNA或RNAi有效地递送至靶细胞例如靶标疾病的疾病细胞的内部。通常，RNA递送可以由病毒和非病毒载体介导。非病毒载体可以大规模生产并且易于工程改造。但是，它们受到低递送效率和在一些情况下细胞毒性的困扰。另一方面，病毒载体利用发展亲本mRNA以有效识别和感染细胞的高度进化机制。但是，它们的递送特性对于工程化和改进可具有挑战性。因此，需要用于在靶细胞内部有效递送mRNA或RNAi的改进方法。
发明内容
本申请提供包含细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，其可用于将一种或多种mRNA(诸如，编码治疗性蛋白(如，肿瘤阻抑蛋白)的mRNA)递送至细胞内。mRNA的细胞内递送允许表达由mRNA编码的产物。在一些实施方式中，mRNA编码蛋白质，诸如治疗性蛋白、缺陷性蛋白质或非功能性蛋白质的功能性变体。在一些实施方式中，mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒包括抑制性RNA(RNAi)，诸如靶向内源性基因的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向疾病相关的内源性基因，如癌基因。在一些任意方式中，RNAi靶向外源性基因。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其通过包含以下步骤的方法制备：a)使包含mRNA的第一溶液与包含CPP的第二溶液混合，从而形成第三溶液，其中第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl、或v)约0-20％的PBS；以及b)培育第三溶液以允许形成mRNA递送复合物。在一些实施方式中，第一溶液包含无菌水中的mRNA和/或第二溶液包含无菌水中的CPP。在一些实施方式中，在步骤b)的培育之后，第三溶液被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl、或v)约0-20％的PBS。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白替换缺乏或异常的蛋白质、扩增现有途径、提供新功能或活性或干扰分子或有机体。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA递送复合物进一步包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi是siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方式中，mRNA编码用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白，和RNAi靶向RNA，其中RNA的表达与疾病或病症相关。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-6肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:15-40的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-9肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:41-52的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:53-70的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:79或80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽与mRNA共价连接。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽还包含与细胞穿透肽的N末端共价连接的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含与其N末端共价连接的乙酰基基团。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽还包含与细胞穿透肽的C末端共价连接的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自半胱酰胺(cysteamide)、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选取代的次氮基三乙酸、羧基、任选取代的直链或分枝C1-C6烷基、伯或仲胺、糖苷(osidic)衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含与其C末端共价连接的半胱酰胺基团。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mNRA递送复合物中的至少一些细胞穿透肽通过键与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA递送复合物还包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因，进行下调。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽与mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间。
在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA递送复合物的平均直径为约20nm和约1000nm之间。
在一些实施方式中，提供了包含核的纳米颗粒，该核包含根据上述任意的实施方式的mRNA递送复合物。在一些实施方式中，核还包含根据上述任意的实施方式的一种或多种另外的mRNA递送复合物。在一些实施方式中，核还包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因，进行下调。在一些实施方式中，RNAi在包含细胞穿透肽和RNAi的复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。
在一些实施方式中，根据上述任意的纳米颗粒，纳米颗粒中至少一些细胞穿透肽通过键与靶向部分连接。
在一些实施方式中，根据上述任意的纳米颗粒，核被包含周围细胞穿透肽的壳包被。在一些实施方式中，周围细胞穿透肽选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，周围细胞穿透肽包含选自SEQ IDNO:1-80的氨基酸序列。在一些实施方式中，壳中的至少一些周围细胞穿透肽通过键与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。
在一些实施方式中，根据上述任意的纳米颗粒，纳米颗粒的平均直接为约20nm和约1000nm之间。
在一些实施方式中，提供了包含根据上述任意实施方式的mRNA递送复合物或根据上述任意实施方式的纳米颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码治疗性蛋白的mRNA。在一些实施方式中，药物组合物还包含抑制性RNA(RNAi)。在一些实施方式中，RNAi在mRNA递送复合物或纳米颗粒中。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA。
在一些实施方式中，提供了制备根据上述任意实施方式的mRNA递送复合物的方法，包含使细胞穿透肽与一种或多种mRNA组合，由此形成mRNA递送复合物。在一些实施方式中，细胞穿透肽与mRNA分别以约1：1至约100：1的摩尔比组合。在一些实施方式中，组合包含使包含mRNA的第一溶液与包含CPP的第二溶液混合以形成第三溶液，其中第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl、或v)约0-20％的PBS，和其中第三溶液被培育以允许形成mRNA递送复合物。在一些实施方式中，第一溶液包含无菌水中的mRNA和/或其中第二溶液包含无菌水中的CPP。在一些实施方式中，在培育以形成mRNA递送复合物之后，第三溶液被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl或v)约0-20％的PBS。
在一些实施方式中，提供了将一种或多种mRNA递送到细胞中的方法，其包括使细胞与根据上述任意实施方式的mRNA递送复合物或根据上述任意实施方式的纳米颗粒接触，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA。在一些实施方式中，使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触在体内进行。在一些实施方式中，使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触离体进行。在一些实施方式中，使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是干细胞、造血前体细胞、粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、天然杀伤细胞、成纤维细胞、肌细胞、心脏细胞、肝细胞、肺祖细胞或神经元细胞。在一些实施方式中，细胞是T细胞。在一些实施方式中，mRNA编码能够调谐个体的免疫应答的蛋白质，该蛋白质在个体中表达。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码治疗性蛋白的mRNA。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒还包含抑制性RNA(RNAi)。在一些实施方式中，方法进一步包括将RNAi递送到细胞中。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA。
在一些实施方式中，提供了治疗个体的疾病的方法，其包括向个体施用有效量的根据上述任意实施方式的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物经由静脉内、肿瘤内、动脉内、外部、眼内(intraocular)、眼科(ophthalmic)、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内或口服施用进行施用。在一些实施方式中，药物组合物经由注射入血管壁或血管壁周围的组织中施用。在一些实施方式中，注射是通过具有针的导管。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，疾病选自癌症、糖尿病、自身免疫疾病、血液疾病、心脏疾病、血管疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、肝病、肺病、肌肉疾病、蛋白质缺乏疾病、溶酶体贮积病、神经系统疾病、肾脏疾病、老化和退行性疾病、和通过胆固醇水平异常表征的疾病。
在一些实施方式中，疾病是蛋白质缺乏疾病。在一些实施方式中，药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码贡献疾病的缺陷性蛋白质的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，疾病通过异常蛋白质进行表征。在一些实施方式中，药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码贡献疾病的非功能性蛋白质的功能变体的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码可用于治疗实体瘤的肿瘤阻抑蛋白的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，癌症是肝、肺、肾、结肠直肠或胰腺的癌症。在一些实施方式中，癌症是血液系统恶性肿瘤，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码可用于治疗血液系统恶性肿瘤的肿瘤阻抑蛋白的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，药物组合物进一步包含靶向参与癌症发展和/或进展的癌基因的RNAi。在一些实施方式中，RNAi在mRNA递送复合物或纳米颗粒中。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，疾病是病毒感染疾病，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码参与病毒感染疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，疾病是遗传性疾病，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码参与遗传性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，疾病是老化或退行性疾病，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码参与老化或退行性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，疾病是纤维变性或炎性疾病，和药物组合物包含mRNA递送复合物或纳米颗粒，其包含编码参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA。
在一些实施方式中，根据上述任意治疗疾病的方法，个体是人。
在一些实施方式中，提供了包含含有根据上述任意实施方式的mRNA递送复合物和/或根据上述任意实施方式的纳米颗粒的组合物的试剂盒。
附图说明
图1A-1F显示了在不同缓冲液中ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA纳米颗粒平均大小表征。ADGN-100/mRNA颗粒在无菌水中形成，然后用无菌水(A)、5％的蔗糖(B)或5％的葡萄糖(C)稀释。ADGN-106/mRNA颗粒在无菌水中形成，然后用无菌水(D)、5％的蔗糖(E)或5％的葡萄糖(F)稀释。利用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)在25℃下每次测量3分钟确定ADGN/mRNA复合物的平均大小。
图2A-2B显示了在不同T细胞培养基中ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA纳米颗粒的平均大小表征。ADGN-100/mRNA(A)和ADGN-106/mRNA(B)颗粒在无菌水中形成，然后在DMEM 50％或pH 7.4(50mM)中稀释。利用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)在25℃下每次测量3分钟确定ADGN/mRNA复合物的平均大小。
图3A-3D显示了在不同盐条件中ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA纳米颗粒的平均大小表征。ADGN-100/mRNA(A、C)和ADGN-106/mRNA(B、D)颗粒在无菌水中形成，然后在NaCl(40mM、80mM、160mM)或PBS(20％和50％)中稀释。利用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)在25℃下每次测量3分钟确定ADGN/mRNA复合物的平均大小。
图4A-4B显示了在血清条件中ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA纳米颗粒的平均大小表征。ADGN-100/mRNA(A)和ADGN-106/mRNA(B)颗粒在无菌水中形成，然后在50％血清(FCS)存在或不存在的情况下在5％蔗糖中稀释。利用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)在25℃下每次测量3分钟确定ADGN/mRNA复合物的平均大小。
图5显示了用不同缓冲液条件中培育的ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA纳米颗粒处理的HepG2细胞中的荧光素酶表达。用含有0.5μg或1.0μg的荧光素酶mRNA的ADGN-100和ADGN-106纳米颗粒转染24孔板中培养的HepG2细胞。ADGN/mRNA复合物在无菌水中形成，并在包括无菌水、5％葡糖糖、5％蔗糖、20％PBS(20％和50％)、Hepes pH 7.4(50mM)、NaCl(40mM、80mM、160mM)或DMEM(50％)的不同缓冲液中稀释。在转染后30小时监测荧光素酶表达，并报告结果为与未处理的细胞对应的RLU(发光)的百分数。
图6A-6B显示了在小鼠中经由静脉内施用ADGN-100和ADGN-106体内递送荧光素酶mRNA的评估。含有10μg mRNA的ADGN-100/Luc mRNA(A)和ADGN-106/luc mRNA(B)颗粒在无菌水中形成，然后在不同缓冲液(蔗糖5％、葡萄糖5％、NaCl 80mM或PBS 20％最终浓度)中稀释。小鼠接受100μl ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物的IV注射。通过生物发光成像在第3天和第6天监测mRNA LUC表达。并且使用制造商的软件(Living Image；PerkinElmer)获得了肝中荧光素酶信号的半定量数据。然后将结果表示为相对于第0天的值。
图7显示了在小鼠中经由静脉内施用ADGN-100和ADGN-106体内递送荧光素酶mRNA的评估。含有10μg mRNA的ADGN-100/Luc mRNA(A)和ADGN-106/luc mRNA(B)颗粒在无菌水中形成，然后在不同缓冲液(蔗糖5％、葡萄糖5％、NaCl 80mM或PBS 20％最终浓度)中稀释。小鼠接受100μl ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物的IV注射。通过生物发光成像在第3天和第6天监测mRNA LUC表达。
图8A-8B显示了在不同细胞类型中PTEN表达的蛋白质印记分析。评估胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞中PTEN的水平。如图8A中所示，使用PTEN抗体通过蛋白质印记评估PTEN表达的水平(上图面)和根据β-肌动蛋白归一化PTEN蛋白质带(下图面)。图8B显示了用含有0.5μg和1.0μg PTEN mRNA的ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物转染的癌细胞类型中PTEN表达的蛋白质印记分析。在转染后48小时分析细胞。
图9显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞增殖的影响。用含有1μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞，并通过流式细胞术试验测量在6天的时间段内的细胞增殖。
图10显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞增殖的影响。用含有0.5μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞，并通过流式细胞术试验测量在6天时间段内的细胞增殖。
图11显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞中凋亡率的影响。用ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物(1μg mRNA)处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞。在转染后72小时使用APO BrDu试剂盒通过流式细胞术测量细胞凋亡率(表达为百分数)。
图12显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞中细胞周期增殖的影响。用ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物(1μg mRNA)处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞。转染后72小时，使用PI(碘化丙啶)染色试剂盒通过流式细胞术测量细胞周期阶段。
图13显示了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送PTENmRNA的潜能。在6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。鉴定六组小鼠，对照未处理的小鼠(G1)、注射裸mRNA10ug的小鼠(G2)、注射ADGN-100/5μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G3)、注射ADGN-100/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G4)、注射ADGN-106/5μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G5)、和注射ADGN-106/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G6)。每7天对动物进行IV尾静脉注射。在第0、7、14、20、26和33天通过生物发光成像评估肿瘤大小。
图14A-14C显示了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送PTEN mRNA的潜能。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。鉴定六组小鼠，对照未处理的小鼠(G1)、注射裸mRNA 10ug的小鼠(G2)、注射ADGN-100/5μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G3)、注射ADGN-100/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G4)、注射ADGN-106/5μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G5)、和注射ADGN-106/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G6)。每7天对动物进行IV尾静脉注射。在第0、7、14、20、26和33天通过生物发光成像评估肿瘤大小。图14A和14B显示了在第33天不同组的生物发光成像和总发光的量化。在第33天，牺牲动物并收集肿瘤。图14C显示了相应的肿瘤。
图15A-15C显示了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送PTEN mRNA的潜能以及对转移发展的影响。在开始实验之前允许6周的时间段进行肿瘤发展。鉴定两组小鼠，对照未处理的小鼠(G1)和注射ADGN-106/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G2)。在第0天和第3天对动物进行IV尾静脉注射。在第0天和第7天通过生物发光成像评估肿瘤大小。图15A显示了第1天和第7天时对照和处理组中的生物发光成像。图15B显示了第0天和第7天时不同组的总发光的量化，其基于图15B中报告的选定的表面。
图16A-16B显示了在ADGN-106介导的KRAS siRNA递送后不同细胞类型中KRAS水平的蛋白质印记分析。以10nM和40nM的ADGN-106/KRAS siRNA颗粒处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞。图16A显示了转染后48小时不同细胞类型中KRAS水平的蛋白质印记分析。根据β-肌动蛋白归一化KRAS蛋白质带。图16B显示了ADGN介导的KRAS siRNA转染对癌细胞增殖的影响。用ADGN-106：KRAS siRNA复合物(10nM、40nM)处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞，并通过流式细胞术试验在转染后5天测量细胞增殖。
图17A-17B显示了使用ADGN-106体内共施用PTEN mRNA和KRAS siRNA对胰腺肿瘤小鼠模型的影响。在开始实验之前允许3周时间段进行肿瘤发展。鉴定四组小鼠，对照未处理小鼠(G1)、注射ADGN-106/10μg PTEN mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G2)、注射ADGN-106/10μg siRNA KRAS的小鼠，剂量0.5mg/kg(G3)和注射ADGN-106/10μg siRNA KRAS，剂量0.5mg/kg；ADGN-106/5μg PTEN mRNA，剂量0.25mg/kg的小鼠(G4)。每7天对动物进行IV尾静脉注射。图17A显示了在第0、7、14、20和26天时通过生物发光成像评估肿瘤大小。图17B显示了在第26天不同组的生物发光成像。
图18显示了用ADGN-100/FVIII mRNA和ADGN-106/FVIII mRNA处理的小鼠中的因子VIII水平。通过在第0天和第50天IV注射100μl盐水缓冲液(90mM NaCl)中ADGN-100/siFVIII复合物(siFVIII剂量1.0mg/kg，10ug)获得肝脏中因子VIII表达的瞬时敲低。对照小鼠，N1组接受100μl含裸siRNA siFVIII 10ug的IV注射，而未处理的C1组接受100μl的盐水缓冲液。然后，将动物分为四个不同的组(每组三只动物)，其对应于未处理(G1)和在第10天和第60天注射FVIII mRNA/ADGN-100(10μg)的治疗(G2)，FVIII mRNA/ADGN-106(10μg)的治疗(G3)和裸FVIII mRNA(10μg)的治疗(G4)。每5天在血液样品上使用因子VIII Elisa试剂盒监测因子VIII水平。
图19显示了用ADGN/FVIII mRNA复合物处理的不同小鼠组的组织学分析。通过在第0天和第50天IV注射100μl盐水缓冲液(90mM NaCl)中ADGN-100/siFVIII复合物(siFVIII剂量1.0mg/kg，10ug)获得肝脏中因子VIII表达的瞬时敲低。对照小鼠(N1组)接受100μl含裸siRNA siFVIII 10ug的IV注射，和来自C1组的小鼠接受100μl的盐水缓冲液作为未处理组。然后，将注射动物分为四个不同的组(每组三只动物)，其对应于未处理(G1)和在第10天和第60天注射FVIII mRNA/ADGN-100(10μg)的治疗(G2)和FVIII mRNA/ADGN-106(10μg)的治疗(G3)。在第90天，牺牲动物，收集肝脏并通过肝组织学进行分析。用苏木精对肝组织的薄切片进行染色并在200光显微镜下进行分析。
图20显示了在表达Luc2的PANC-1和SKVO-3细胞中的ADGN-100介导的荧光素酶基因编辑。用ADGN-100/CAS9 mRNA/gRNA Luc(0.2μg/2μg或0.5μg/5μg)转染在24孔板中培养的PANC-1和SKVO-3细胞。ADGN/CRISPR复合物在无菌水中形成并在5％蔗糖中稀释。用裸CAS9 mRNA/gRNA Luc(0.5μg/5μg)处理或用RNAiMAX CAS9 mRNA/gRNA Luc(0.5μg/5μg)转染细胞，作为对照。在转染后48小时监测荧光素酶表达，并报告结果为与未处理的细胞对应的RLU(发光)的百分比。
图21A和21B显示了在胰腺肿瘤小鼠模型中使用ADGN-100体内共施用CRISPR(mRNACAS9：Luc gRNA)的影响。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。将小鼠分为2组，注射盐水溶液的对照小鼠和注射ADGN-100/5μg CAS9 mRNA/15μg Luc gRNA的小鼠。在第0、7、和14天对动物进行IV尾静脉注射。图21A显示了在0、14、20和28天通过生物发光成像评估的肿瘤大小，并且对应的肿瘤在第33天收集。图21B显示了在第0、7、14、20和28天基于图21A指示的区域的两组的总发光的量化。
图22A和22B显示了在用与ADGN肽复合的PTEN mRNA转染的癌细胞中凋亡途径的PTEN表达和活化的拯救(rescue)。图22A显示了在不同细胞类型中PTEN表达的蛋白质印记分析。评估胰腺癌(PANC-1)、前列腺癌(PC3)、人胶质瘤(U25)和卵巢癌(SKOV3)中PTEN的水平。转染后48小时分析细胞。图22B显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞中凋亡率的影响。转染后72小时使用APO BrDu试剂盒通过流式细胞术测量细胞凋亡率(表达为百分数)。
图23显示了在ADGN-介导的PTEN mRNA转染后癌细胞增殖的抑制。用含有1μg mRNA的ADGN-100/mRNA复合物处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)和卵巢癌(SKOV3)细胞并通过流式细胞术试验测量在6天的时间段内的细胞增殖。
图24显示了ADGN介导的PTEN mRNA转染对癌细胞中细胞周期增殖的影响。用ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物(1μg mRNA)处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)和卵巢癌(SKOV3)细胞。转染后72小时，使用PI(碘化丙啶)染色试剂盒通过流式细胞术测量细胞周期阶段。
图25A和25B显示了利用靶向KRAS G12D的siRNA的ADGN介导的转染对癌细胞中增殖的影响。图25A显示了转染后48小时，在ADGN介导的KRAS siRNA递送后不同细胞类型中KRAS水平的蛋白质印记分析。以10nM和40nM的ADGN/KRAS siRNA颗粒处理胰腺癌(PANC-1)、人胶质瘤(U25)、前列腺癌(PC3)和卵巢癌(SKOV3)细胞。siRNA靶向KRAS G12D。根据β-肌动蛋白归一化KRAS蛋白质带。图25B显示了通过流式细胞术试验测量的在6天的时间段内的细胞增殖。
图26A-26C显示了利用PTEN mRNA和KRAS siRNA的ADGN介导的转染对胰腺肿瘤小鼠模型中体内肿瘤体积和体重的影响。在6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。鉴定六组小鼠，对照未处理的小鼠(G1)、注射裸mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G2)、注射ADGN/PTEN mRNA的小鼠，剂量0.25mg/kg(G3)、注射靶向KRAS的裸siRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G4)、注射ADGN/KRASsiRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G5)和注射ADGN/PTEN mRNA(0.25mg/kg)/KRAS siRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G6)。每7天对动物进行IV尾静脉注射。在第0、5、12、17、22和28天通过生物发光成像评估肿瘤大小。
图27A和27B显示了在不同细胞类型中P53表达的蛋白质印记分析。评估胰腺癌(PANC-1)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞中p53的水平。如图27A中所示，使用P53抗体通过蛋白质印记评估P53表达的水平(上图面)和根据β-肌动蛋白归一化P53蛋白质带(下图面)。图27B显示了在用含有0.5μg和1.0μg P53 mRNA的ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物转染的癌细胞类型中P53表达的蛋白质印记分析。转染后48小时对细胞进行分析。
图28显示了ADGN介导的P53 mRNA转染对癌细胞增殖的影响。利用含有1μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理胰腺癌(PANC-1)、前列腺癌(PC3)、卵巢癌(SKOV3)和人成纤维(HS68)细胞，并通过流式细胞术试验测量在6天的时间段内的细胞增殖。
图29显示了ADGN介导的P53 mRNA转染对癌细胞中凋亡率的影响。用ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物(1μg mRNA)处理胰腺癌(PANC-1)、前列腺癌(PC3)和卵巢癌(SKOV3)细胞。在转染后72小时，使用APO BrDu试剂盒通过流式细胞术测量细胞凋亡率(表达为百分数)。
图30显示了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送P53mRNA的潜能。在6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。鉴定三组小鼠，对照未处理小鼠(G1)、注射裸mRNA10ug的小鼠(G2)和注射ADGN-100/10μg P53 mRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G3)。每5天对动物进行IV尾静脉注射。在第0、7、14和20天通过生物发光成像评估肿瘤大小。
图31A-31B显示了ADGN介导的KRAS siRNA转染对癌细胞增殖的影响。以10nM或40nM的靶向密码子12(G12C、G12D)或61(Q61K)处突变的ADGN-106：KRAS siRNA复合物处理胰腺癌(PANC-1)、前列腺癌(PC3)和卵巢癌(SKOV3)细胞。单独SiRNA或SiRNA混合物用于与ADGN-106复合。通过流式细胞术试验在转染后6天测量细胞增殖。
图32显示了P53(肿瘤阻抑基因)或PTEN(肿瘤阻抑mRNA)和KRAS(癌基因)siRNA的ADGN介导的共递送对癌细胞增殖的影响。分别用ADGN-100/mRNA PTEN(0.25μg-5.7nM)、ADGN-100/mRNA P53(0.5μg-11.5nM)和ADGN 106/KRAS siRNA(G12D/G12C)(5nM)处理胰腺癌(PANC-1)(图面A)和卵巢癌(SKOV3)(图面B)细胞。转染后测量在8天的时间段内的细胞增殖。
图33显示了ADGN肽(ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送KRAS G12C/G12DsiRNA的组合的潜能。在6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)。在开始实验之前允许3周的时间段进行肿瘤发展。鉴定三组小鼠，对照未处理小鼠(G1)、注射裸siRNA 10ug的小鼠(G2)和注射ADGN-106/10μg G12D/G12C siRNA的小鼠，剂量0.5mg/kg(G3)。每5天对动物进行IV尾静脉注射。在第0、7、14和20天通过生物发光成像评估肿瘤大小。
图34显示了利用ADGN-100/FVIII mRNA以IV和皮下(SQ)处理的小鼠中因子VIII水平。通过在第0天IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中靶向因子VIII Exon 1的100μl ADGN-100/CRISPR复合物(剂量0.5mg/kg，10ug)获得肝脏中因子VIII表达的永久敲低。来自G1组的对照小鼠接受100μl的盐水缓冲液的IV注射，作为未处理组。10天后，将注射ADGN-100/CRISPR F VIII的动物分为8个不同的组(每组3只动物)，其对应于未处理(G2)和在第10天通过SQ注射FVIII mRNA/ADGN-100 20μg的处理(G3)、注射FVIII mRNA/ADGN-100 40μg的处理(G4)、注射FVIII mRNA/ADGN-100 50μg的处理(G5)、注射FVIII mRNA/ADGN-106 20μg的处理(G6)、注射FVIII mRNA/ADGN-106 40μg的处理(G7)、注射FVIII mRNA/ADGN-106 50μg的处理(G8)和IV注射FVIII mRNA/ADGN-10010μg的处理(G9)。每5天在血液样品上使用因子VIII Elisa试剂盒监测因子VIII水平。
图35显示了用多倍剂量的ADGN-100/FVIII mRNA以SQ处理的小鼠中因子VIII水平。通过在第0天IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中靶向因子VIII Exon 1的100μl ADGN-100/CRISPR复合物(剂量0.5mg/kg、10ug)获得肝脏中因子VIII表达的永久敲低。来自G1组的对照小鼠接受100μl的盐水缓冲液的IV注射，作为未处理组。10天后，以初始mRNA/ADGN-100剂量(40μg单次SQ注射)SQ注射已经注射ADGN-100/CRISPR F VIII的动物。初次施用后2周，将动物分为5个不同的组(每组4只动物)并通过SQ注射不同剂量的mRNA/ADGN 100复合物：FVIII mRNA/ADGN-100 10μg(G3,Q2W)、20μg(G4,Q3W)、30μg(G5,Q4W)和40μg(G6,Q4W)进行处理。使用Elisa显色因子VIII活性试验监测因子VIII水平。
图36显示了在人骨肉瘤细胞G292细胞上的ADGN介导的eGFP mRNA转染。用含有0.25μg、0.5μg和1.0μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理人骨肉瘤细胞，并通过流式细胞术试验测量在7天的时间段内的eGFP表达的水平。
图37显示了在人骨肉瘤细胞G292细胞上的ADGN介导的P53 mRNA转染。用含有0.25μg、0.5μg和1.0μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理人骨肉瘤细胞，通过蛋白质印记试验在72后定量P53 WT表达的水平。
图38显示了ADGN介导的P53 mRNA转染对人骨肉瘤细胞G292细胞增殖的影响。用含有0.25μg、0.5μg和1.0μg mRNA的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理人骨肉瘤细胞，并通过MTT试验测量在7天的时间段内的细胞增殖。
图39显示了在小鼠中ADGN-106经由雾化施用体内递送荧光素酶mRNA的评估。含有10μg mRNA的ADGN-106/luc mRNA颗粒在无菌水/蔗糖5％缓冲液中形成。小鼠接受非手术气管内施用100μl ADGN-ADGN-106/mRNA复合物。在6小时和24小时后通过生物发光成像监测mRNA Luc表达。
图40显示了在小鼠中ADGN-106经由雾化施用体内递送荧光素酶mRNA的评估。含有10μg mRNA的ADGN-106/luc mRNA颗粒在无菌术/蔗糖5％缓冲液中形成。小鼠接受非手术气管内施用100μl ADGN-ADGN-106/mRNA复合物，然后在24小时牺牲动物并通过生物发光对不同器官进行荧光素酶表达分析。
图41显示了在人骨肉瘤细胞G292细胞上ADGN介导的eGFP mRNA转染。用含有mRNA或5moU mRNA(0.5μg和1.0μg)的ADGN-100/mRNA或ADGN-106/mRNA复合物处理人骨肉瘤细胞。转染之前，在不存在或存在10％或25％SVF的情况下，培育ADGN/mRNA复合物3小时。通过流式细胞术试验在第6天测量eGFP表达的水平。
图42显示了在胰腺肿瘤小鼠模型中，利用PTEN mRNA和KRAS siRNA组合P53mRNA的体内ADGN介导的转染的影响。
图43显示了在胰腺肿瘤小鼠模型中，利用PTEN mRNA和/或KRAS siRNA组合Abraxane的ADGN介导的转染体内对肿瘤体积的影响。
具体实施方式
本申请提供了包含细胞穿透肽(CPP)和一种或多种mRNA的复合物和纳米颗粒，其中CPP适合于将一种或多种mRNA(诸如编码治疗产物，如，肿瘤阻抑蛋白的mRNA)递送到细胞中。复合物和纳米颗粒可以包含多种mRNA。mRNA可以包括例如编码治疗性蛋白(如，肿瘤阻抑蛋白、免疫调谐剂等)的mRNA。在一些实施方式中，mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒优选地定位于靶组织，诸如疾病组织，如肿瘤。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒还包含RNAi，诸如靶向内源性基因的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向与疾病相关的内源性基因，如癌基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。
因此，在一方面，本申请提供了新颖的mRNA递送复合物和纳米颗粒，其将在下面更详细地描述。
在另一方面，提供了使用细胞穿透肽将mRNA递送到细胞中的方法。在另一方面，提供了将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送到局部组织、器官或细胞中的方法。在另一方面，提供了通过将包含mRNA和细胞穿透肽的本文所述的复合物或纳米颗粒施用于对象来治疗疾病或障碍的方法。
还提供了包含细胞穿透肽和一种或多种mRNA的药物组合物(例如复合物和纳米颗粒形式)及其在治疗疾病中的用途。
在一些方面，mRNA递送复合物、纳米颗粒和药物组合物具有不引起明显毒性同时有利于将一种或多种mRNA有效递送至个体的优点。例如，在一些实施方式中，施用本文所述的mRNA递送复合物和纳米颗粒不会诱导显著的细胞因子应答(如，非特异性细胞因子应答)和/或显著的非特异性炎性应答。
定义
如本文所用，术语“野生型”是技术人员理解的技术术语，并且意为生物体、菌种、基因或特性其存在于自然界时的一般形式，区别于突变体或变体形式。
如本文所用，术语“变体”应用来意指呈现具有偏离自然界存在模式的性质。
术语“非天然存在”或“工程化”被可互换地使用，并且表示涉及了人工。该术语在涉及核酸分子或多肽时意为核酸分子或多肽至少基本上不具有在自然界中或在自然界中发现的与其天然缔合的至少一种其它组分。
“互补性”指核酸与另一核酸序列通过传统Watson-Crick碱基配对或其它非传统类型形成氢键(一个或多个)的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”意为核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基成氢键。本文所用的“基本上互补”指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文所用，“表达”指从DNA模板转录多核苷酸(如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽可被统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中的mRNA的剪接。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中被可互换地用于指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，鼠类、猿类、人类、农场动物、运动动物和宠物。体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞和其后代也被包括在内。
术语“治疗剂”、“治疗活性剂”或“处理剂”被可互换地使用，并且指在被施用至对象后赋予一些有益效果的分子或化合物。有益效果包括实现诊断性判断；缓解疾病、症状、障碍或病理状况；减少或预防疾病、症状、障碍或状况的发作；和总体上对抗疾病、症状、障碍或病理状况。
如本文所用，“处理”或“治疗”指获得有益的或期望的结果的方法，其包括但不限于治疗益处。治疗益处意为在处理(治疗)下一种或多种疾病、状况或症状的任何治疗相关改进或对一种或多种疾病、状况或症状的任何治疗相关效果。
术语“有效量”或“治疗有效量”指足以产生有益或期望的结果的剂量。治疗有效量可取决于下列一种或多种而变化：被治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式和类似因素——其可容易被本领域普通技术人员确定。该术语还适用于通过本文描述的任一种成像方法提供检测图像的药剂。特定药剂可取决于下列一种或多种而变化：选择的具体剂、遵照的用药方案、其是否与其它化合物组合施用、给药时机、被成像的组织和运载其的物理递送系统。
如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”和“所述”包括复数指代，除非另有说明。
本文中对“约”某一个数值或参数的提及包括(并且描述了)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
本发明的组合物和方法可包括下列、由下列组成或主要由下列组成：本文描述的本发明的必需要素和限定，以及本文描述的或其它有用的任何另外的或任选的成分、组分或限定。
除非另有说明，技术术语按照常规用法使用。
mRNA和RNAi
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码选自几种靶类别中的任意的目的多肽，靶类别包括但不限于生物制品、抗体、疫苗、治疗性蛋白或肽、细胞穿透肽、分泌蛋白、质膜蛋白、胞质或细胞主链蛋白、细胞内膜结合蛋白、核蛋白、与人疾病相关的蛋白质、靶向部分或人类基因组编码的没有鉴定治疗适应症但仍在研究和发现领域有用的那些蛋白质。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA包含根据美国专利号9,061,059和9,221,891中描述的任意mRNA的编码目的多肽的区域和连接的核苷的区域，其中每篇以其整体并入本文。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码参考多肽的多肽变体。在一些实施方式中，多肽变体可以具有与参考多肽相同或相似的活性。可选地，变体可以相对于参考多肽具有改变的活性(如，增加或减少)。一般地，本发明的特定多核苷酸或多肽的变体将具有与该特定参考多核苷酸或多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文描述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数确定的。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码生物制品。如本文所使用，“生物制品”是通过本文提供的方法生产的基于多肽的分子并且其可以被用于治疗、治愈、减轻、预防或诊断严重或危及生命的疾病或医学病症。根据本发明，生物制品包括但不限于变应原提取物(如，对于脱敏针(allergy shot)和试验)、血液成分、基因疗法产品、用于移植的人组织或细胞产品、疫苗、单克隆抗体、细胞因子、生长因子、酶、溶栓剂和免疫调谐剂等等。在一些实施方式中，生物制品是当前市场销售的或处于研发的。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码抗体或其片段(诸如抗原结合片段)。在一些实施方式中，抗体或其片段是当前市场销售的或处于研发的。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而链(一条或多条)的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段(只要它们展现出所需的生物活性)中的相应序列同一或同源。本文中目的嵌合抗体包括但不限于包含源自非人灵长类(如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；纳米抗体；由抗体片段形成的单链抗体分子和多特异性抗体。
五类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任何一种都可以由本发明的mRNA编码，包括分别指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。还包括编码亚类γ和μ的多核苷酸序列。因此，抗体的任何亚类都可以部分或全部被编码，并且包括以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
在一些实施方式中，mRNA中编码的抗体或其片段被用于治疗以下治疗领域中的病症或疾病，包括但不限于血液、心血管、CNS、中毒(包括抗蛇毒素)、皮肤病学、内分泌学、胃肠道、医学成像、肌骨骼、肿瘤学、免疫学、呼吸、感觉和抗感染。
在一些实施方式中，以mRNA编码的抗体或其片段是单克隆抗体和/或其变体。抗体的变体还可包括但不限于取代变体、保守氨基酸取代、插入变体、缺失变体和/或共价衍生物。在一些实施方式中，mRNA中编码的抗体或其片段是免疫球蛋白Fc区。在一些实施方式中，mRNA中编码的抗体或其片段是变体免疫球蛋白Fc区。在一些实施方式中，mRNA中编码的抗体或其片段是具有变体免疫球蛋白Fc区的抗体，如美国专利号8,217,147中所描述的，通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码疫苗。如本文所用，“疫苗”是改善针对特定疾病或传染剂的免疫力的生物制剂。在一些实施方式中，疫苗目前是市场销售的或处于研发的。
在一些实施方式中，由mRNA编码的疫苗被用于治疗许多治疗领域的病症或疾病，例如但不限于心血管、CNS、皮肤病学、内分泌学、肿瘤学、免疫学、呼吸和抗感染。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白是当前市场销售的或处于研发的。在一些实施方式中，治疗性蛋白可用于：(a)替换缺乏或异常的蛋白质；(b)扩增现有途径；(c)提供新的功能或活性；或(d)干扰分子或有机体。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于基于抗体的药物、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白质支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白介素和溶栓剂。在一些实施方式中，治疗性蛋白通过如下途径起作用：(a)非共价结合至靶标，如，mAb；(b)影响共价键，如，酶；或(c)发挥活性而不需要特异性相互作用，如，血清白蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白是重组蛋白质。
在一些实施方式中，由mRNA编码的治疗性蛋白被用于治疗许多治疗领域的病症疾病，例如但不限于血液、心血管、CNS、中毒(包括抗蛇毒素)、皮肤病学、内分泌学、遗传、泌尿生殖、胃肠、肌骨骼、肿瘤学、和免疫学、呼吸、感觉和抗感染。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D)、胎盘生长因子(PGF)、OX40配体(OX40L；CD134L)、白介素12(IL12)、白介素23(IL23)、白介素36γ(IL36γ)和CoA变位酶。
在一些实施方式中，治疗性蛋白替换缺乏或异常的蛋白质。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于α1抗胰蛋白酶、共济蛋白、胰岛素、生长激素(促生长素)、生长因子、激素、肌养蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF1)、因子VIII、因子IX、抗凝血酶III、蛋白质C、β-葡糖脑苷脂酶、葡萄糖苷酶-α、α-l-艾杜糖苷酸梅、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶(Galsulphase)、人α-半乳糖苷酶A、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰酶(包括脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)、腺苷脱氨酶和白蛋白，包括其重组体形式。
在一些实施方式中，治疗性蛋白扩增现有途径。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于促红细胞生成素、依泊汀(Epoetin)-α、达贝泊汀(Darbepoetin)-α、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素11(IL11)、人促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、I型α-干扰素、干扰素-α2a、干扰素-α2b、干扰素-αn3、干扰素-β1a、干扰素-β1b、干扰素-γ1b、白介素2(IL2)、表皮胸腺细胞活化因子(ETAF)、组织纤溶酶原活化物(tPA)、尿激酶、因子VIIa、活化蛋白质C、鲑鱼降钙素、人甲状旁腺激素肽(如，残基1–34)、肠降血糖素模拟物(如，艾塞那肽)、促生长素抑制素类似物(如，奥曲肽)、重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)、重组人骨形态发生蛋白7(rhBMP7)、促性腺素释放激素(GnRH)、角质形成细胞生长因子(KGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰蛋白酶和重组B-型利尿钠肽。
在一些实施方式中，治疗性蛋白提供新的功能或活性。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶I、链道酶-α、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、拉布立酶、来匹卢定、比伐卢定、链激酶和茴酰化纤溶酶原链激酶活化物复合物(APSAC)。
在一些实施方式中，治疗性蛋白干扰分子或有机体。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于抗-VEGFA抗体、抗-EGFR抗体、抗-CD52抗体、抗-CD20抗体、抗-HER2/Neu抗体、人CTLA4的细胞外结构域和人免疫球蛋白G1的修饰的Fc部分之间的融合蛋白、白介素1(IL1)受体拮抗剂、抗-TNFα抗体、CD2-结合蛋白质、抗-CD11a抗体、α4β1和α4β7整联蛋白抗体的抗-α4-亚基、抗-补体蛋白质C5抗体、抗胸腺细胞球蛋白质、嵌合(人/小鼠)IgG1、结合CD25的α链的人源化IgG1 mAb、抗-CD3抗体、抗-IgE抗体、结合呼吸道合胞病毒的F蛋白质的A抗原位点的人源化IgG1 mAb、HIV包膜蛋白质gp120/gp41结合肽、结合糖蛋白IIb/IIIa整联蛋白受体的嵌合(人/小鼠)mAb 7E3的Fab片段、和结合并中和毒液毒素的IgG的Fab片段。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码融合蛋白。在一些实施方式中，可通过可操作地将带电蛋白质连接至治疗性蛋白来产生融合蛋白。如本文所使用，“可操作地连接”是指当被引入细胞时，治疗性蛋白和带电蛋白质以允许复合物表达的方式被连接。如本文所使用，“带电蛋白质”是指携带正、负或整体中性电荷的蛋白质。在一些实施方式中，在形成融合蛋白中，治疗性蛋白与带电蛋白质共价连接。在一些实施方式中，表面电荷与总的或表面氨基酸的比为近似0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码细胞穿透肽(CPP)。在一些实施方式中，CPP包含一个或多个可检测的标签。在一些实施方式中，CPP包含信号序列。如本文所使用，“信号序列”是指在蛋白质翻译期间在，在新生蛋白质的氨基末端处结合的氨基酸残基的序列。信号序列可以被用于传导细胞穿透多肽分泌的信号。
在一些实施方式中，由mRNA编码的CPP能够在翻译后形成复合物。在一些实施方式中，复合物包含与细胞穿透多肽连接，如共价连接的带电蛋白质。
在一些实施方式中，由mRNA编码的CPP包含第一结构域和第二结构域。在一些实施方式中，第一结构域包含超带电(supercharged)多肽。在一些实施方式中，第二结构域包含蛋白质结合配偶体。如本文所用，“蛋白质结合配偶体”包括但不限于抗体及其功能片段、支架蛋白质或肽。在一些实施方式中，细胞穿透多肽还包含用于蛋白质结合配偶体的细胞内结合配偶体。在一些实施方式中，细胞穿透多肽能够从引入mRNA的细胞中分泌出来。在一些实施方式中，细胞穿透多肽还能够穿透第一细胞。
在一些实施方式中，由mRNA编码的CPP能够穿透第二细胞。在一些实施方式中，第二个细胞与第一细胞来自同一区域，或者可以来自不同的区域。在一些实施方式中，区域包括但不限于组织和器官。在一些实施方式中，第二细胞在第一细胞的近端或远端。
在一些实施方式中，mRNA编码包含蛋白质结合配偶体的细胞穿透多肽。在一些实施方式中，蛋白质结合配偶体包括但不限于抗体、超带电抗体或功能片段。在一些实施方式中，mRNA被引入其中引入包含蛋白质结合配偶体的细胞穿透多肽的细胞。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码分泌蛋白。分泌蛋白可以选自本文描述的那些或在美国专利公开20100255574中描述的那些，其内容通过引用以其全部并入本文。
在一个实施方式中，这些可以在制造大量的有价值的人基因产品中使用。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码质膜的蛋白质。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码细胞质或细胞主链蛋白。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码细胞内膜结合蛋白。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码核蛋白。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码与人类疾病相关的蛋白质。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码具有目前未知的治疗功能的蛋白质。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码靶向部分。这些包括细胞表面上的蛋白质结合配偶体或受体，其功能是在体内或体外将细胞靶向特定组织空间或与特定部分相互作用。合适的蛋白质结合配偶体包括但不限于抗体及其功能片段、支架蛋白质或肽。另外，mRNA可以用于指导脂质、碳水化合物或其他生物部分或生物分子的合成和细胞外定位。
在一些实施方式中，mRNA可用于产生多肽文库。这些文库可来自mRNA群体的产生，每个mRNA群体都包含各种结构或化学修饰设计。在该实施方式中，mRNA群体可以包含多个编码的多肽，包括但不限于抗体或抗体片段、蛋白质结合配偶体、支架蛋白质和本文教导或本领域已知的其他多肽。在一个优选的实施方式中，mRNA可以适合于直接引入靶细胞或培养物中，所述靶细胞或培养物又可以合成编码的多肽。
在某些实施方式中，可以生产和测试蛋白质的多个变体，每个变体具有不同的氨基酸修饰(一个或多个)，从而以从药代动力学、稳定性、生物相容性和/或生物活性、或生物物理性质(诸如表达水平)方面确定最佳变体。这样的文库可含有10、102、103、104、105、106、107、108、109或超过109的可能变体(包括但不限于一个或多个残基的取代、缺失以及一个或多个残基的插入)。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码抗微生物肽(AMP)或抗病毒肽(AVP)。AMP和AVP已经从广泛的动物分离并描述，广泛的动物诸如但不限于微生物、无脊椎动物、植物、两栖动物、鸟类、鱼类和哺乳动物(Wanget al.,Nucleic Acids Res.2009；37(Database issue)：D933-7)。例如，在如下文献中描述了抗-微生物多肽：抗微生物肽数据库(aps.unmc.edu/AP/main.php；Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009；37(Database issue)：D933-7)，CAMP：抗微生物肽的收集(www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/)；Thomas et al.,Nucleic Acids Res.2010；38(Database issue)：D774-80)、美国专利号5,221,732、美国专利号5,447,914、美国专利号5,519,115、美国专利号5,607,914、美国专利号5,714,577、美国专利号5,734,015、美国专利号5,798,336、美国专利号5,821,224、美国专利号5,849,490、美国专利号5,856,127、美国专利号5,905,187、美国专利号5,994,308、美国专利号5,998,374、美国专利号6,107,460、美国专利号6,191,254、美国专利号6,211,148、美国专利号6,300,489、美国专利号6,329,504、美国专利号6,399,370、美国专利号6,476,189、美国专利号6,478,825、美国专利号6,492,328、美国专利号6,514,701、美国专利号6,573,361、美国专利号6,573,361、美国专利号6,576,755、美国专利号6,605,698、美国专利号6,624,140、美国专利号6,638,531、美国专利号6,642,203、美国专利号6,653,280、美国专利号6,696,238、美国专利号6,727,066、美国专利号6,730,659、美国专利号6,743,598、美国专利号6,743,769、美国专利号6,747,007、美国专利号6,790,833、美国专利号6,794,490、美国专利号6,818,407、美国专利号6,835,536、美国专利号6,835,713、美国专利号6,838,435、美国专利号6,872,705、美国专利号6,875,907、美国专利号6,884,776、美国专利号6,887,847、美国专利号6,906,035、美国专利号6,911,524、美国专利号6,936,432、美国专利号7,001,924、美国专利号7,071,293、美国专利号7,078,380、美国专利号7,091,185、美国专利号7,094,759、美国专利号7,166,769、美国专利号7,244,710、美国专利号7,314,858和美国专利号7,582,301，其内容通过引用以其全部并入本文。
本文描述的抗-微生物多肽可以通过一个或多个包膜的病毒(如，HIV、HCV)阻断细胞融合和/或病毒进入。例如，抗-微生物多肽可以包括对应于下列区的合成肽或由其组成，如病毒包膜蛋白质(如，HIV-1gp120或gp41)的跨膜亚基的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸的连续序列。在如Kuiken et al.,(2008)."HIV SequenceCompendium,"Los Alamos National Laboratory中描述了HIV-1gp120或gp41的氨基酸和核苷酸序列。
在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以与对应的病毒蛋白质序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、100％的序列同源性。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以与对应的病毒蛋白质序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同源性。
在其他实施方式中，抗-微生物多肽可以包括对应于下列区的合成肽或由其组成，如衣壳结合蛋白质的结合结构域的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、或60个氨基酸的连续序列。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以与衣壳结合蛋白质的对应序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同源性。
本文描述的抗-微生物多肽可以阻断蛋白酶二聚化并抑制病毒前蛋白至功能蛋白的裂解(如，HIV Gag-pol加工)，从而阻止一种或多种包膜病毒(如，HIV、HCV)的释放。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以与对应的病毒蛋白质序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、100％的序列同源性。
在其他实施方式中，抗-微生物多肽可以包括对应于下列区的合成肽或由其组成，如蛋白酶结合蛋白质的结合结构域的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸的连续序列。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以与蛋白酶结合蛋白质的对应序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、100％的序列同源性。
本文描述的抗微生物多肽可包括针对病毒病原体的体外进化的多肽。
抗微生物多肽(AMP)是具有可变长度、序列和结构的小肽，其具有针对多种微生物的广谱活性，这些微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒和肿瘤/癌细胞(参见，如，Zaiou,J Mol Med,2007；85：317；通过引用以其整体并入本文)。已经显示，AMP具有广谱的快速起效的杀伤活性，具有潜在的低水平的诱导抗性和随之而来的广泛抗炎性作用。
在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以在10kDa以下，如，在8kDa、6kDa、4kDa、2kDa或1kDa以下。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)由约6至约100个氨基酸，如，约6至约75个氨基酸、约6至约50个氨基酸、约6至约25个氨基酸、约25至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、或约75至约100个氨基酸组成。在某些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以由约15至约45个氨基酸组成。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)基本上是阳离子的。
在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以基本上是两亲性的。在某些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以基本上是阳离子的和两亲性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阳性细菌细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阳性细菌细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阳性细菌细胞抑制的和细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阴性细菌细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阴性细菌细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是对革兰氏阳性细菌细胞抑制的和细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对病毒、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对病毒、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞毒性的。在某些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对病毒、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞抑制的和细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对肿瘤或癌细胞(如，人肿瘤和/或癌细胞)细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对肿瘤或癌细胞(如，人肿瘤和/或癌细胞)细胞抑制的。在某些实施方式中，抗-微生物多肽可以是对肿瘤或癌细胞(如，人肿瘤或癌细胞)细胞毒性的和细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)可以是分泌的多肽。
在一些实施方式中，抗-微生物多肽包括防卫素或由其组成。示例性防卫素包括但不限于α-防卫素(如，嗜中性粒细胞防卫素1、防卫素α1、嗜中性粒细胞防卫素3、嗜中性粒细胞防卫素4、防卫素5、防卫素6)、β-防卫素(如，β-防卫素1、β-防卫素2、β-防卫素103、β-防卫素107、β-防卫素110、β-防卫素136)和θ-防卫素。在其他实施方式中，抗-微生物多肽包括抗菌肽(cathelicidin)(如，hCAP18)或由其组成。
抗-病毒多肽(AVP)是具有可变长度、序列和结构的小肽，其具有针对广泛病毒的广谱活性。参见，如，Zaiou,J Mol Med,2007；85：317。已经显示，AVP具有广谱的快速起效的杀伤活性，具有潜在的低水平的诱导抗性和随之而来的广泛的抗炎性作用。在一些实施方式中，抗-病毒多肽在10kDa以下，如，在8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、或1kDa以下。在一些实施方式中，抗-病毒多肽包括约6至约100个氨基酸，如，约6至约75个氨基酸、约6至约50个氨基酸、约6至约25个氨基酸、约25至约100个氨基酸、约50至约100个氨基酸、或约75至约100个氨基酸，或由其组成。在某些实施方式中，抗-病毒多肽包括约15至约45个氨基酸或由其组成。在一些实施方式中，抗-病毒多肽基本上是阳离子的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽基本上是两亲性的。在某些实施方式中，抗-病毒多肽基本上是阳离子的和两亲性的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对病毒细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对病毒细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对病毒细胞抑制的和细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对细菌、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对细菌、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞毒性的。在某些实施方式中，抗-病毒多肽是对细菌、真菌、原生动物、寄生生物、朊病毒或其组合细胞抑制的和细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对肿瘤或癌细胞(如，人癌细胞)细胞毒性的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是对肿瘤或癌细胞(如，人癌细胞)细胞抑制的。在某些实施方式中，抗-病毒多肽是对肿瘤或癌细胞(如，人癌细胞)细胞毒性的和细胞抑制的。在一些实施方式中，抗-病毒多肽是分泌的多肽。
在一些实施方式中，mRNA并入一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被并入mRNA，诸如双官能修饰的RNA或mRNA。细胞毒性核苷抗癌试剂包括但不限于腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟脱氧尿苷、FTORAFUR.RTM.(替加氟(tegafur)和尿嘧啶的组合)、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)和6-巯基嘌呤。
众多细胞毒性核苷类似物在临床上使用，或已经成为临床试验的主题，作为抗癌试剂。这样的类似物的实例包括但不限于阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、替扎他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)、克拉屈滨、氯法拉滨、5-氮杂胞苷、4'-硫代-阿拉伯胞苷、环戊烯基胞嘧啶和1-(2-C-氰基2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶。这样的化合物的另一实例是磷酸氟达拉滨。这些化合物可以全身施用并且可具有细胞毒性试剂典型的副作用，诸如但不限于相对于增殖的正常细胞，对肿瘤细胞很少或没有特异性。
本领域中还报告了众多细胞毒性核苷类似物的前体药物。实例包括但不限于N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-反油酸酯)。一般地，这些前体药物可以在肝脏和全身循环中被转化为活性药物，并在肿瘤组织中展示活性药物的很少或没有选择性释放。例如，卡培他滨——5'-脱氧-5-氟胞苷(和最终5-氟尿嘧啶)——的前体药物在肝脏和在肿瘤组织两者中代谢。含有“在生理条件下容易水解的自由基”的一系列卡培他滨类似物已经由Fujiu等人(美国专利号4,966,891)要求保护，并且通过引用并入本文。由Fujiu描述的该系列包括5'-脱氧-5-氟胞苷的N4烷基和芳烷基氨基甲酸酯以及暗示这些化合物将通过在正常生理条件下的水解被活化，以提供5'-脱氧-5-氟胞苷。
Fadl等人(Pharmazie.1995,50,382-7，通过引用并入本文)已经报道了一系列阿糖胞苷N4-氨基甲酸酯，其中化合物被设计为在肝脏和血浆中转化为阿糖胞苷。WO2004/041203(通过引用并入本文)公开了吉西他滨的前体药物，其中一些前体药物是N4-氨基甲酸酯。这些化合物被设计为克服吉西他滨的胃肠毒性，并旨在通过在胃肠道吸收完整前体药物后在肝脏和血浆中通过水解释放提供吉西他滨。Nomura等人(Bioorg Med.Chem.2003,11,2453-61，通过引用并入本文)描述了1-(3-C-乙炔基-β-D-核糖-戊呋喃糖基)胞嘧啶的缩醛衍生物，其通过生物还原产生需要在酸性条件下进一步水解的中间体，以产生细胞毒性核苷化合物。
可以化疗的细胞毒性核苷酸还包括但不限于吡唑并[3,4-D]-嘧啶、别嘌醇、氮杂硫代嘌呤、卡培他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿昔洛韦、ara-腺苷、利巴韦林、7-脱氮杂-腺苷、7-脱氮杂-鸟苷、6-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-胞苷、胸苷核糖核苷酸、5-溴脱氧尿苷、2-氯-嘌呤和肌苷或其组合。
基因的非翻译区(UTR)被转录但未被翻译。5'UTR在转录起始位点开始，并继续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3'UTR在终止密码子之后立即开始并继续直至转录终止信号。越来越多的证据表明，UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面起着调节作用。可以将UTR的调节特征并入本发明的mRNA中以增强分子的稳定性。具体特征也可以被并入以确保转录物的受控下调，以防它们被错误定向至不期望的器官位点。
天然5'UTR承载在转录启动中起作用的特征。它们带有类似众所周知的参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列的特征。Kozak序列具有共有CCRCCAUGG(SEQ IDNO:91)，其中R是嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子(AUG)上游的三个碱基，AUG之后是另一个`G`。也已知5'UTR形成参与伸长因子结合的二级结构。
通过工程化通常在特定靶器官的大量表达基因中发现的特征，可以增强本发明的mRNA的稳定性和蛋白质产生。例如，肝表达的mRNA的5'UTR的引入(诸如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、脱脂载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、α甲胎蛋白、促红细胞生成素、或因子VIII)可以被用于增强肝细胞系或肝脏中的核酸分子的表达，诸如mRNA。同样，使用来自其他组织特异性mRNA的5'UTR以提高该组织中的表达是可能的，对于肌肉(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成蛋白、力蛋白)，对于内皮细胞(Tie-1、CD36)，对于髓细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)，对于白细胞(CD45、CD18)，对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂连蛋白)，和对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)。
其他非-UTR序列可以被并入5'(或3'UTR)UTR。例如，内含子或内含子序列的部分可以被并入本发明的mRNA的侧接区。内含子序列的并入可以增加蛋白质产生以及mRNA水平。
已知3'UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷的一段序列。这些富AU特征在高速率周转的基因中是特别普遍存在的。基于它们的序列特征和官能性质，富AU元件(ARE)可以被分为三类(Chen等人，1995)：I类ARE含有富U区内AUUUA基序的若干分散的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有该类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE定义较不明确。这些富U区不含有AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成蛋白是该类的两种充分研究的实例。已知与ARE结合的大部分蛋白质使信使不稳定，而ELAV家族的成员，最显著的HuR，已经被记录增加mRNA的稳定性mRNA。HuR与所有三类的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化入核酸分子的3'UTR将导致HuR结合，并因此稳定体内信息。
3'UTR富AU元件(ARE)的引入、移除或修饰可用于调谐本发明的mRNA的稳定性。当工程化特异性mRNA时，ARE的一个或多个拷贝可以被引入以使本发明的mRNA较不稳定，并从而缩短翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可以被鉴定并移除或突变以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可以使用本发明的mRNA在相关的细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的各个时间点测定蛋白质的产生。例如，可以用不同的ARE工程化分子转染细胞，以及通过使用相关蛋白质的ELISA试剂盒，并测定转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
微小RNA(或miRNA)是19-25个核苷酸长的非编码RNA，其与核酸分子的3'UTR结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译下调基因表达。在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA包含一种或多种微小RNA靶序列、微小RNA序列或微小RNA种子。这类序列可以对应于任何已知的微小RNA，诸如在US公开US2005/0261218和US公开US2005/0059005中教导的那些，其内容通过引用以其全部并入本文。
微小RNA序列包含“种子”区，即，在成熟微小RNA的第2-8位的区域中的序列，该序列具有与miRNA靶序列的完美Watson-Crick互补性。微小RNA种子可以包含成熟微小RNA的2-8或2-7位。在一些实施方式中，微小RNA种子可以包含7个核苷酸(如，成熟微小RNA的核苷酸2-8)，其中在对应miRNA靶的种子互补位点侧接与微小NRA 1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施方式中，微小RNA种子可以包含6个核苷酸(如，成熟微小RNA的核苷酸2-7)，其中在对应miRNA靶的种子互补位点侧接与微小NRA 1位相对的腺嘌呤(A)。参见，例如，Grimson A,Farh K K,Johnston W K,Garrett-Engele P,Lim L P,Bartel D P；Mol.Cell.2007Jul.6；27(1)：91-105；其中每篇通过引用以其整体并入本文。微小RNA种子的碱基具有与靶序列的完全互补性。通过将微小RNA靶序列工程化入本发明的mRNA的3'UTR，可以靶向分子，用于降解或减少翻译，条件是考虑的微小RNA是可获得的。该过程将减少在核酸分子递送后的脱靶作用的危险。微小RNA、微小RNA靶区以及它们在生物学中表达模式和作用的鉴定已被报道(Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11：943-949；Anand and Cheresh Curr OpinHematol 2011 18：171-176；Contreras and Rao Leukemia 2012 26：404-413(2011Dec.20.doi：10.1038/1eu.2011.356)；BartelCell 2009 136：215-233；Landgraf etal,Cell,2007 129：1401-1414；其中每篇通过引用以其整体被并入本文)。
例如，如果核酸分子是mRNA，并且不旨在递送到肝脏而是最终到达肝脏，那么如果miR-122中的一个或多个靶位点被工程化到mRNA的3'UTR中，则miR-122(肝脏中丰富的微小RNA)可以抑制目的基因的表达。不同微小RNA的一个或多个结合位点的引入可以被工程化以进一步降低mRNA的寿命、稳定性和蛋白质翻译。
如本文所用，术语“微小RNA位点”是指微小RNA靶位点或微小RNA识别位点，或微小RNA结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解，“结合”可以遵循传统的Watson-Crick杂交规则，或者可以反映微小RNA与微小RNA位点处或附近的靶序列的任何稳定缔合。
相反，出于本发明的mRNA的目的，可以将微小RNA结合位点工程化成移出它们天然存在的序列(即，从中去除)，以增加在特定组织中的蛋白质表达。例如，可以去除miR-122结合位点以改善肝脏中的蛋白质表达。多种组织中表达的调节可通过引入或去除一个或几个微小RNA结合位点来完成。
其中已知微小RNA调节mRNA并由此调节蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。微小RNA还可以调节复杂生物过程，诸如血管生成(miR-132)(Anandand Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18：171-176；通过引用以其全部并入本文)。在本发明的mRNA中，参与这类过程的微小RNA的结合位点可以被去除或引入，从而将mRNA表达的表达调整至生物上相关的细胞类型或相关的生物过程的内容。在2013年1月17日提交的美国临时申请号61/753,661的表9中，在2013年1月18日提交的美国临时申请号61/754,159的表9中，和在2013年1月31日提交的美国临时申请号61/758,921的表7中列出了微小RNA、miR序列和miR结合位点的列表，其中每篇通过引用以其全部并入本文。
列举了使用微小RNA驱动组织或疾病特异性基因表达的实例(Getner andNaldini,Tissue Antigens.2012,80：393-403；通过引用以其全部并入本文)。另外，微小RNA种子位点可以被并入mRNA以降低某些细胞中的表达——其导致生物改善。该实例是将miR-142位点并入表达UGT1A1的慢病毒载体。miR-142种子位点的存在降低造血细胞中的表达，并因此降低抗原呈递细胞中的表达，导致不存在针对病毒表达的UGT1A1的免疫应答(Schmitt et al.,Gastroenterology 2010；139：999-1007；Gonzalez-Asequinolaza etal.Gastroenterology 2010,139：726-729；两者通过引用以其全部并入本文)。将miR-142位点并入修饰的mRNA不仅可以降低造血细胞中编码的蛋白质的表达，而且可以降低或消除对mRNA编码的蛋白质的免疫应答。将miR-142种子位点(一个或多个)并入mRNA在治疗具有完全蛋白质缺乏的患者的情况(UGT1A1 I型，LDLR-缺乏患者，CRIM-阴性庞帕患者等)中将是重要的。
最后，通过理解不同细胞类型中微小RNA的表达模式，可以将根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA进行工程化，用于在特异性细胞类型中或仅在具体生物条件下进行更加靶向的表达。通过引入组织特异性微小RNA结合位点，可以设计出最适合组织中或生物条件情况下蛋白质表达的mRNA。
可以使用根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的各种时间点测定蛋白质产生。例如，可以用不同的微小RNA结合位点工程化mRNA转染细胞，以及通过使用相关蛋白质的ELISA试剂盒，并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和7天产生的蛋白质。也可以使用微小RNA结合位点工程化的分子进行体内实验，从而检查配制的mRNA的组织特异性表达的变化。
mRNA的5'帽结构参与核输出，其增加mRNA稳定性，并且与mRNA帽结合蛋白质(CBP)结合，所述mRNA帽结合蛋白质负责细胞中mRNA稳定性和通过CBP与聚腺苷酸结合蛋白质缔合以形成成熟环状mRNA种类的翻译能力。帽进一步辅助在mRNA剪接期间5'近端内含子的去除。
内源性mRNA分子可以是在mRNA分子的末端鸟苷帽残基和5'-末端转录有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键的5'-端帽。该5'-鸟苷酸帽可以然后被甲基化以生成N7-甲基-鸟苷酸残基。mRNA的5'端的末端和/或次末端(anteterminal)转录的核苷酸的核糖也可以被2'-O-甲基化。通过水解和裂解鸟苷酸帽结构的5'-脱帽可以靶向核酸分子，诸如mRNA分子，进行降解。
对根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA的修饰可以产生不可水解的帽结构，其阻止脱帽并因此增加mRNA半衰期。因为帽结构水解需要5'-ppp-5'磷酸二酯键的裂解，因此修饰的核苷酸可以在加帽反应期间使用。例如，来自New EnglandBiolabs(Ipswich,Mass.)的Vaccinia加帽酶可以根据制造商的说明与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以制造5'-ppp-5'帽中的硫代磷酸酯键。可以使用另外的修饰的鸟苷核苷酸，诸如α-甲基-膦酸酯和和硒基-磷酸盐核苷酸。
另外的修饰包括但不限于在糖环的2'羟基基团上的mRNA的5'-末端和/或5'-次末端核苷酸的核糖的2'-O-甲基化(如上所述)。多个不同的5'-帽结构可以被用于产生核酸分子诸如mRNA分子的5'-帽。
帽类似物，在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或者结构或功能帽类似物，在其化学结构上不同于天然(即内源性、野生型或生理性)5'-帽，同时保持帽功能。帽类似物可以化学(即非酶促地)或酶促合成和/或连接至核酸分子。
例如，抗-反向帽类似物(ARCA)帽包含由5'-5'-三磷酸酯基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基基团以及3'-O-甲基基团(即，N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷(m7G-3'mppp-G；其可以等效地被指定为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G)。其他未修饰的鸟嘌呤的3'-O原子被连接至加帽的核酸分子(如mRNA)的5'-末端核苷酸。N7-和3'-O-甲基化鸟嘌呤提供了加帽的核酸分子(如mRNA)的末端部分。
另一示例性帽是mCAP，其类似于ARCA，但是在鸟苷上具有2'-β-甲基基团(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
虽然帽类似物允许在体外转录反应中核酸分子的伴随加帽，但是至多20％的转录物可以依然未加帽。这点以及帽类似物与由内源性细胞转录机器产生的核酸分子的内源性5'-帽结构的结构差异可以导致降低的翻译能力和降低的细胞稳定性。
根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA还可以使用酶进行转录后加帽，从而产生更真实的5'-帽结构。如本文所用，短语“更真实”是指如此特征，其在结构上或功能上紧密地反映或模仿内源性或野生型特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实”的特征更好地代表了内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在一个或多个方面中性能优于相应的内源性、野生型、天然或生理特征。本发明的更真实的5'帽结构的非限制性实例是与本领域已知的合成5'帽结构(或与野生型、天然或生理5'帽结构)相比具有增强的帽结合蛋白质的结合，增加的半衰期，降低的对5'核酸内切酶的敏感性和/或减少的5'脱帽的那些。例如，重组牛痘病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可以在mRNA的5'-末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生规范的5'-5'-三磷酸键，其中加帽鸟嘌呤含有N7甲基化，并且mRNA的5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。这种结构称为Cap1结构。如与本领域已知的其他5'帽类似物结构相比，该帽导致更高的翻译能力和细胞稳定性，以及降低的细胞促炎性细胞因子的活化。帽结构包括但不限于7mG(5')ppp(5')N,pN2p(帽0)、7mG(5')ppp(5')N1mpNp(帽1)和7mG(5')-ppp(5')N1mpN2mp(帽2)。
因为根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA可以转录后加帽，并且由于该过程是更有效的，所以几乎100％的mRNA可以被加帽。这与在体外转录反应过程中将帽类似物连接至mRNA时的约80％形成对比。
根据本发明，5'末端帽可以包括内源性帽或帽类似物。根据本发明，5'末端帽可以包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮-鸟苷。
另外的病毒序列，诸如但不限于大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)、绵羊肺腺瘤逆转录病毒(JSRV)和/或地方性鼻内肿瘤病毒的翻译增强子序列(参见如，国际公开号WO2012129648；通过引用以其全部并入本文)可以被工程化并插入本发明的mRNA的3'UTR中并且可以刺激体外和体内构建体的翻译。转染实验可以在相关细胞系中进行并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和7天通过ELISA测定蛋白质产生。
进一步，提供了根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA，其可以含有内部核糖体进入位点(IRES)。首先鉴定为特征小核糖核酸病毒RNA，IRES在不存在5'帽结构的情况下引发蛋白质合成中起重要作用。IRES可以起到唯一核糖体结合位点的作用，或可以起到mNRA的多个核糖体结合位点中的一个的作用。含有多于一个功能核糖体结合位点的mRNA可以编码由核糖体独立翻译的若干肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。当mRNA提供有IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区。根据本发明可以使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小RNA病毒(如FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙肝病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。
在RNA处理期间，腺嘌呤核苷酸(聚腺苷酸尾)的长链可以添加到多核苷酸，诸如mRNA分子，从而增加稳定性。紧跟转录之后，转录物的3'端可以被裂解以使3'羟基游离。然后，聚腺苷酸聚合酶将腺嘌呤核苷酸的链添加到RNA。该过程(称为聚腺苷酸化)将添加可以介于例如约100和250个残基长度之间的聚腺苷酸尾。
一般地，本发明的聚腺苷酸尾的长度大于30个核苷酸长度。在另一个实施方式中，聚腺苷酸尾大于35个核苷酸长度(如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施方式中，mRNA包括约30至约3,000个核苷酸(如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000至3,000、2,000至2,500、和2,500至3,000)。
在一个实施方式中，相对于整个mRNA的长度设计聚腺苷酸尾。该设计可以基于编码区的长度、特定特征或区(诸如，第一或侧接区)的长度或基于由mRNA表达的最终产物的长度。
在该背景下，聚腺苷酸尾可以在长度上大于mRNA或其特征的10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。聚腺苷酸尾也可以被设计为其所属的mRNA的分数。在该背景下，聚腺苷酸尾可以是构建体的总长度或构建体的总长度减去聚腺苷酸尾的10、20、30、40、50、60、70、80、或90％或更多。进一步，对于聚腺苷酸结合蛋白质，mRNA的工程化的结合位点和缀合可以增强表达。
另外地，多个不同的mRNA可以使用在聚腺苷酸尾的3'末端修饰的核苷酸通过3'-端与PABP(聚腺苷酸结合蛋白质)连接在一起。在相关的细胞系中进行转染实验并在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和7天通过ELISA测定蛋白质产生。
本文所述的本发明的mRNA和从其翻译的蛋白质可以用作治疗剂或预防剂。它们被提供用于医学。例如，本文所述的mRNA可以施用于对象，其中mRNA在体内翻译以在对象中产生治疗性或预防性多肽。提供了用于诊断、治疗或预防人类和其他哺乳动物的疾病或病症的组合物、方法、试剂盒和试剂。本发明的活性治疗剂包括mRNA、含有多核苷酸、mRNA或从mRNA翻译的多肽的细胞。
在某些实施方式中，本文提供的是包含一种或多种mRNA的组合治疗剂，所述mRNA含有编码增强哺乳动物对象的免疫力的一种或多种蛋白质连同诱导抗体依赖性细胞毒性的蛋白质的可翻译区。例如，本文提供了含有一种或多种核酸的治疗剂，所述核酸编码曲妥珠单抗和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。具体地，这种组合治疗剂可用于对曲妥珠单抗产生诱导耐性的Her2+乳腺癌患者(参见，如，Albrecht,Immunotherapy.2(6)：795-8(2010))。
本文提供了使用本文所述的mRNA在细胞群体中诱导重组多肽翻译的方法。这样的翻译可以是体内、离体、培养或体外的。使细胞群体与有效量的组合物接触，该组合物含有具有至少一个核苷修饰的核酸和编码重组多肽的可翻译区。在使核酸定位于细胞群体的一个或多个细胞中的条件下接触群体，并且将重组多肽在细胞中从核酸翻译。
至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、核酸的物理特性(如，修饰的核苷的大小和程度)以及其他决定因素提供“有效量”的组合物。通常地，有效量的组合物在细胞中提供有效的蛋白质生产，优选地比包含相应的未修饰核酸的组合物更有效。增加的效率可以通过增加的细胞转染(即，被核酸转染的细胞的百分比)、来自核酸的增加的蛋白质翻译、减少的核酸降解(如所证明的，如，通过来自修饰的核酸的蛋白质翻译的持续时间的增加)或减少的主体细胞的先天免疫应答来证明。
本发明的方面涉及在需要其的哺乳动物对象中诱导重组多肽的体内翻译的方法。其中，使用本文所述的递送方法将有效量的包含具有至少一种结构或化学修饰的核酸和编码重组多肽的可翻译区的组合物施用于对象。以一定量和在其他条件下提供核酸，使得核酸定位于对象的细胞中，并且重组多肽在细胞中从核酸翻译。其中定位核酸的细胞或存在该细胞的组织可以被一轮或超过一轮的核酸施用靶向。
在某些实施方式中，所施用的mRNA引导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽提供在翻译所述重组多肽的细胞、组织或生物体中基本上不存在的功能活性。例如，缺失的功能活性本质上可以是酶促的、结构的或基因调节的。在相关的实施方式中，所施用的mRNA引导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽增加(如，协同地)在翻译该重组多肽的细胞中存在但基本上缺乏的功能活性。
在其他实施方式中，所施用的mRNA引导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽替代在翻译所述重组多肽的细胞中基本上不存在的多肽(或多种多肽)。这种不存在可以是由于编码基因或其调节途径的遗传突变引起的。在一些实施方式中，重组多肽使细胞内的内源性蛋白质的水平增加至期望水平；这种增加可以使内源性蛋白质的水平从亚正常水平到正常水平或从正常水平到超正常水平。
可选地，重组多肽的功能是拮抗存在于细胞中、细胞表面或由细胞分泌的内源性蛋白质的活性。通常，内源性蛋白质的活性对对象是有害的；例如，由于内源性蛋白质的突变导致活性或位置改变。另外，重组多肽直接或间接拮抗存在于细胞中、细胞表面上或从细胞分泌的生物部分的活性。被拮抗的生物部分的实例包括脂质(如，胆固醇)、脂蛋白(如，低密度脂蛋白)、核酸、碳水化合物、蛋白质毒素(诸如志贺和破伤风毒素)或小分子毒素(诸如肉毒杆菌、霍乱和白喉毒素)。另外，被拮抗的生物分子可以是内源性蛋白质，其表现出不期望的活性，诸如细胞毒性或细胞抑制活性。
本文所述的重组蛋白质可经工程化以定位于细胞内，潜在地位于诸如核之类的特定区室中，或经工程化以使其自细胞分泌或转位至细胞的质膜。
在一些实施方式中，根据本发明的修饰的mRNA和其编码的多肽可以用于治疗多种疾病、障碍和/或病症中的任一种，其包括但不限以下的一种或多种：自身免疫障碍(如，糖尿病、狼疮、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎)；炎性障碍(如，关节炎、盆腔炎症性疾病)；传染性疾病(如，病毒感染(如，HIV、HCV、RSV、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流感病毒)、细菌感染、真菌感染、脓毒症)；神经障碍(如，阿尔茨海默病、杭廷顿氏舞蹈病；孤独症；杜兴氏肌营养不良)；心血管障碍(如，动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血障碍、血管生成障碍(如黄斑变性))；增殖性障碍(如，癌症、良性肿瘤)；呼吸障碍(如，慢性阻塞性肺病)；消化障碍(如，炎性肠病、溃疡)；肌骨骼障碍(如，纤维肌痛、关节炎)；内分泌、代谢和营养障碍(如，糖尿病、骨质疏松)；泌尿科障碍(如，肾病)；心理障碍(如，抑郁、精神分裂症)；皮肤障碍(如，伤口、湿疹)；血液和淋巴障碍(如，贫血、血友病)；等等。
以机能障碍或畸变蛋白质活性为特征的疾病包括囊性纤维化、镰状细胞贫血、表皮水泡症、肌萎缩性侧索硬化和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏。本发明提供了通过引入含有本文提供的mRNA的基于核酸或细胞的治疗剂治疗对象中这类病症或疾病的方法，其中mRNA编码拮抗或以其他方式克服对象细胞中存在的畸变蛋白质活性的蛋白质。机能障碍的蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜电导调节蛋白(CFTR)基因的错义突变变体，其产生CFTR蛋白质的机能障碍的蛋白质变体，其导致囊性纤维化。
以缺失(或基本上减少，以致没有适当的(正常)或生理蛋白质功能)蛋白质活性为特征的疾病包括囊性纤维化、尼-皮二氏C型、β地中海贫血、杜兴氏肌营养不良、胡尔勒综合征、亨特综合征和血友病A。这类蛋白质可以不存在，或基本上是无功能的。本发明提供了通过引入含有本文提供的mRNA的基于核酸或细胞的治疗剂治疗对象中这类病症或疾病的方法，其中mRNA编码替代由对象的靶细胞缺失的蛋白质活性的蛋白质。机能障碍的蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜电导调节蛋白(CFTR)基因的无义突变变体，其产生CFTR蛋白质的非功能蛋白变体，其导致囊性纤维化。
因此，提供了在使得在细胞中存在有效量的CTFR多肽的条件下，通过使对象的细胞与具有编码功能CFTR多肽的可翻译区的mRNA接触来治疗哺乳动物对象中的囊性纤维化的方法。优选的靶细胞是上皮、内皮和间皮细胞，诸如肺，并且鉴于靶组织确定施用方法；即，对于肺部递送，将RNA分子配制通过吸入施用。
在另一个实施方式中，本发明提供了通过将具有编码选蛋白(通过基因组研究近来表征的蛋白质)的修饰的mRNA分子的细胞群体引入对象，从而改善对象的高脂血症来治疗对象的高脂血症的方法。SORT1基因编码称为选蛋白的反式高尔基网络(TGN)跨膜蛋白质。基因研究已经显示了，五个个体之一在SORT1基因的1p13基因座中具有单个核苷酸多态性，rs12740374，其使它们倾向于具有低水平的低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。约30％的人中存在的次要等位基因的每个拷贝改变LDL胆固醇达8mg/dL，而约5％的群体中存在的次要等位基因的两个拷贝降低LDL胆固醇16mg/dL。次要等位基因的载体也已经显示了具有40％降低的心肌梗塞风险。小鼠中体内功能研究描述了在小鼠肝脏组织中SORT1的过表达导致显著降低的LDL-胆固醇水平，高达80％降低，并且沉默SORT1增加了LDL胆固醇约200％(Musunuru K et al.From noncoding variant to phenotype via SORT1at the 1p13 cholesterollocus.Nature 2010；466：714-721)。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗造血障碍、心血管疾病、肿瘤学、糖尿病、囊性纤维化、神经系统疾病、先天性代谢障碍、皮肤和全身性障碍以及失明的方法。已经描述了治疗这些具体疾病的分子靶的身份(Templeton ed.,Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,3.sup.rd Edition,Bota Raton,Fla.:CRCPress；通过引用以其全部并入本文)。
本文提供了预防处于发展感染和/或脓毒症风险的对象中的感染和/或脓毒症的方法，该方法包括以足以预防感染和/或脓毒症的量向需要这类预防的对象施用包含编码抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)的mRNA前体或其部分或完全加工形式的组合物。在某些实施方式中，处于发展感染和/或脓毒症风险的对象可以是癌症患者。在某些实施方式中，癌症患者可以已经经历调理方案(conditioning regimen)。在一些实施方式中，调理方案可以包括但不限于化疗、放疗或两者。作为非限制性实例，mRNA可以编码蛋白质C、其酶原或前蛋白原、蛋白质C(APC)的活化形式、或本领域内已知的蛋白质C的变体。在一些实施方式中，mRNA被化学修饰并递送至细胞。本发明的化学修饰的mRNA内可被编码的多肽的非限制性实例包括在美国专利号7,226,999；7,498,305；6,630,138中教导的那些，其中每篇通过引用以其全部并入本文。这些专利教导了蛋白质C样分子、变体和衍生物，其中任意可以在本发明的化学修饰的分子内被编码。
本文进一步提供了治疗对象中的感染和/或脓毒症的方法，该方法包括以足以治疗感染和/或脓毒症的量向需要这类治疗的对象施用包含编码抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)例如本文描述的抗微生物多肽的mRNA前体或其部分或完全加工形式的组合物。在某些实施方式中，需要治疗的对象可以是癌症患者。在某些实施方式中，癌症患者已经经历调理方案。在一些实施方式中，调理方案可以包括但不限于化疗、放疗或两者。
在某些实施方式中，对象可表现出急性或慢性微生物感染(如，细菌感染)。在某些实施方式中，对象可以已经接受或可以正在接受疗法。在某些实施方式中，疗法可以包括但不限于放疗、化疗、类固醇、紫外线辐射或其组合。在某些实施方式中，患者可以患有微血管障碍。在一些实施方式中，微血管障碍可以是糖尿病。在某些实施方式中，患者可以有伤口。在一些实施方式中，伤口可以是溃疡。在具体的实施方式中，伤口可以是糖尿病性足溃疡。在某些实施方式中，对象可以有一个或多个烧伤伤口。在某些实施方式中，施用可以是局部的或全身的。在某些实施方式中，施用可以是皮下的。在某些实施方式中，施用可以是静脉内。在某些实施方式中，施用可以是口服的。在某些实施方式中，施用可以是外部的。在某些实施方式中，施用可以通过吸入。在某些实施方式中，施用可以是直肠的。在某些实施方式中，施用可以是阴道的。
本公开的其他方面涉及将含有mRNA的细胞移植至哺乳动物对象。向哺乳动物对象施用细胞是本领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于局部植入(如，外部或皮下施用)、器官递送或全身注射(如，静脉内注射或吸入)、以及药学上可接受的载体中的细胞制剂。这种含有mRNA的组合物可以配制成用于肌内、经动脉、腹膜内、静脉内、鼻内、皮下、内窥镜、透皮或鞘内施用。在一些实施方式中，组合物可以配制用于延长释放。
可以向其施用治疗剂的对象患有疾病、障碍或有害状况或处于发展疾病、障碍或有害状况的风险中。提供基于这些来鉴定、诊断和分类对象的方法，其可以包括临床诊断、生物标志物水平、全基因组关联研究(GWAS)以及本领域已知的其他方法。
本发明的mRNA可以用于伤口治疗，如表现出延迟愈合的伤口。本文提供包括施用mRNA从而管理伤口治疗的方法。本文的方法可以进一步包括在mRNA施用之前、同时或之后进行的步骤。例如，伤口床可能需要被清洁和准备以便促进伤口愈合并希望获得伤口闭合。可以使用几种策略来促进伤口愈合并实现伤口闭合，其包括但不限于：(i)清创术，任选地重复进行，锐器清创术(从伤口上外科手术去除死亡或感染的组织)，任选地包括化学清创剂，诸如酶，以去除坏死的组织；(ii)伤口敷料，为伤口提供潮湿、温暖的环境，并促进组织的修复和愈合。
用于配置伤口敷料的材料的实例包括但不限于：水凝胶(如，AQUASORB.RTM.；DUODERM.RTM.)、水胶体(如，AQUACEL.RTM.；COMFEEL.RTM.)、泡沫(如，LYOFOAM.RTM.；SPYROSORB.RTM.)和藻酸盐(如，ALGISITE.RTM.；CURASORB.RTM.)；(iii)刺激细胞分化和增殖并促进伤口愈合的另外的生长因子，如贝卡普勒明(REGRANEX GEL.RTM.)、FDA批准用于治疗神经性足溃疡的人重组血小板衍生生长因子；(iv)软组织伤口覆盖(coverage)，可以需要皮肤移植物以获得清洁、非治愈伤口的覆盖。可以用于软组织覆盖的皮肤移植物的实例包括但不限于：自体皮肤移植物、尸体皮肤移植物、生物工程皮肤替代品(如，APLIGRAF.RTM.；DERMAGRAFT.RTM.)。
在某些实施方式中，本发明的mRNA可进一步包括水凝胶(如，AQUASORB.RTM.；DUODERM.RTM.)、水胶体(如，AQUACEL.RTM.；COMFEEL.RTM.)、泡沫(如，LYOFOAM.RTM.；SPYROSORB.RTM.)和/或藻酸盐(如，ALGISITE.RTM.；CURASORB.RTM.)。在某些实施方式中，本发明的mRNA可以与皮肤移植物一起使用，皮肤移植物包括但不限于自体皮肤移植物、尸体皮肤移植物或生物工程皮肤替代品(如，APLIGRAF.RTM.；DERMAGRAFT.RTM.)。在一些实施方式中，可以将mRNA与伤口敷料制剂和/或皮肤移植物一起施加，或者可以将它们分开施加，但是方法诸如但不限于浸泡或喷雾。
在一些实施方式中，用于伤口管理的组合物可以包含编码抗-微生物多肽(如，抗-细菌多肽)和/或抗-病毒多肽的mRNA。可以对抗-微生物多肽的前体或部分或完全加工形式进行编码。组合物可以配制为使用绷带(如，粘合剂绷带)进行施用。可以将抗-微生物多肽和/或抗-病毒多肽与敷料组合物互相混合或可以分开施加，如通过浸泡或喷雾。
在本发明的一个实施方式中，mRNA可以编码抗体和这种抗体的片段。这些可以通过本文所述的任何一种方法生产。抗体可以是免疫球蛋白的任何不同亚类或同种型，诸如但不限于IgA、IgG或IgM，或任何其他亚类。可以根据本发明制备的示例性抗体分子和片段包括但不限于免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子中可能含有互补位的那些部分。抗体中含有互补位的这类部分包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、F(v)和本领域中已知的那些部分。
本发明的多核苷酸可以编码变体抗体多肽，所述变体抗体多肽可以与参考多肽序列具有一定的同一性，或者与参考多肽序列具有相似或不相似的结合特性。
通过本发明的方法获得的抗体可以是嵌合抗体，其包含源自经免疫的动物的非人抗体来源的可变区(一个或多个)序列，和人抗体来源的恒定区(一个或多个)序列。另外，它们也可以是人源化抗体，其包括源自经免疫的动物的非人抗体的互补决定区(CDR)和源自人抗体的框架区(FR)和恒定区。在另一个实施方式中，本文提供的方法可以用于增强细胞培养过程中抗体蛋白质产物产率。
在一个实施方式中，提供用于通过施用编码抗-微生物多肽的mRNA治疗或预防对象中微生物感染(如，细菌感染)和/或与微生物或病毒感染相关的疾病、障碍或病症、或其症状的方法。所述施用可以与抗微生物剂(如，抗-细菌剂)组合，如，本文描述的抗-微生物多肽或小分子抗微生物化合物。抗-微生物剂包括但不限于抗-细菌剂、抗-病毒剂、抗-真菌剂、抗-原生动物剂、抗-寄生生物剂和抗-朊病毒剂。
这些试剂可以例如以组合的单位剂量同时施用(如，提供两种试剂的同时递送)。也可以以指定的时间间隔(诸如但不限于几分钟、几小时、几天或几周的间隔)施用所述试剂。通常，试剂在对象中可以是并发(concurrently)可生物利用的，例如，可检测的。在一些实施方式中，试剂可以基本上同时地施用，例如同时施用两个单位剂量，或者两种试剂的组合单位剂量。在其他实施方式中，试剂可以单独的单位剂量递送。可以以任何顺序或作为包括两种或更多种试剂的一种或多种制品施用试剂。在优选的实施方式中，试剂之一——如第一试剂——的至少一个施用可以在另一种试剂——如第二试剂——的几分钟、1、2、3或4小时之内，或甚至在一或两天内进行。在一些实施方式中，组合可以达到协同作用，如大于加和结果，例如，比加和结果大至少25％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％。
可以与细菌感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于以下中的一种或多种：脓肿、放线菌病、急性前列腺炎、嗜水气单胞菌、一年生黑麦草毒性、炭疽、杆菌性紫癜、菌血症、细菌性肠胃炎、细菌性脑膜炎、细菌性肺炎、细菌性阴道炎、细菌相关皮肤病、巴尔通体病、BCG-oma、葡萄菌病、肉毒中毒、巴西紫癜热、布罗迪脓肿、布鲁氏菌病、布路里溃疡、弯杆菌病、龋齿、腐肉病、猫抓病、蜂窝织炎、衣原体感染、霍乱、慢性细菌性前列腺炎、慢性复发性多灶性骨髓炎、梭菌坏死性肠炎、牙周-牙髓联合病变、牛传染性胸膜肺炎、白喉、白喉性口炎、埃希氏菌病、丹毒、会厌炎(piglottitis)、丹毒、费兹-休-柯蒂斯综合征、蚤传斑点热、脚腐病(传染性足部皮炎)、加雷式硬化性骨髓炎、淋病、腹股沟肉芽肿、人粒细胞无形体病、人类单核细胞埃希氏菌病、百日咳(hundred days'cough)、脓疱病、晚期先天性梅毒眼病、军团菌病、勒米尔综合征、麻风病(汉森氏病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、淋巴结炎、类鼻疽、脑膜炎球菌病、脑膜炎球菌败血症、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、鸟胞内分枝杆菌(MAI)、支原体肺炎、坏死性筋膜炎、诺卡氏菌病、noma(口腔癌或坏疽性口炎)、脐炎、眼眶蜂窝织炎、骨髓炎、压倒性脾切除术后感染(OPSI)、羊布氏杆菌病、巴氏杆菌病、眶周蜂窝织炎、百日咳(pertussis)(百日咳(whooping cough))、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、波特病、直肠炎、假单胞菌感染、鹦鹉热、脓血症、化脓性肌炎、Q热病、复发热(回归热)、风湿热、落基山斑疹热(RMSF)、立克次体病、沙门氏菌病、猩红热、脓毒症、沙雷菌感染、志贺氏菌病、南方蜱类相关皮疹病、葡萄球菌烫伤皮肤综合征、链球菌性咽炎、游泳池肉芽肿、猪布鲁氏菌病、梅毒、梅毒性主动脉炎、破伤风、中毒性休克综合征(TSS)、沙眼、战壕热、热带溃疡、结核病、兔热病、伤寒、斑疹伤寒、泌尿生殖系统结核、尿道感染、耐万古霉素金黄色葡萄球菌感染、沃弗二氏综合征、假结核(耶尔森菌)病和耶尔森菌病。与细菌感染相关的其他疾病、障碍和/或病症可以包括，例如，阿尔茨海默病、神经性厌食症、哮喘、动脉粥样硬化、注意缺陷多动障碍、孤独症、自身免疫疾病、双相性情感障碍、癌症(如，结肠直肠癌、胆囊癌、肺癌、胰腺癌和胃癌)、慢性疲劳综合征、慢性阻塞性肺病、克罗恩病、冠心病、痴呆、抑郁、格林巴利综合征、代谢综合征、多发性硬化、心肌梗塞、肥胖、强迫症、恐慌症、银屑病、类风湿性关节炎、结节病、精神分裂症、中风、血栓闭塞性脉管炎(布尔格氏病)和图雷特综合征。
本文描述的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。细菌病原体包括但不限于鲍曼不动杆菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌、百日咳杆菌、博氏疏螺旋体、流产布氏菌、犬布鲁氏菌、羊流产布氏杆菌、猪流产布氏杆菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、凝固酶阴性葡萄球菌、白喉杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、致病性大肠杆菌、大肠杆菌O157：H7、肠杆菌属某种、兔热病杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、单核细胞增生李斯特菌、卡他莫拉菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奇异变形菌、变形杆菌某种、铜绿假单胞菌、立氏立克次体、伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、弗氏志贺氏菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、梅毒密螺旋体、霍乱弧菌和鼠疫耶尔森菌。细菌病原体还可以包括引起耐细菌感染的细菌，例如，耐克林霉素的艰难梭菌、耐氟喹诺酮的艰难梭菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐多药的粪肠球菌、耐多药的屎肠球菌、耐多药的铜绿假单胞菌、耐多药的鲍曼不动杆菌和耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)。
在一个实施方式中，本发明的修饰的mRNA可以与一种或多种抗生素结合施用。这些包括但不限于Aknilox、两性霉素、阿莫西林、氨苄西林、增强素(Augmentin)、莫西沙星(Avelox)、阿奇霉素、百多邦、必妥碘、戊酸倍他米松(Betnovate)、磺胺醋酰泼尼松龙、头孢克洛、头孢氢氨苄、头孢地尼、头孢吡肟、Cefix、头孢克肟、头孢西汀、头孢泊肟、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢他啶(Ceptaz)、氯胺苯醇、氯己定、氯霉素、Chlorsig、环丙沙星、克拉霉素、Clindagel、克林霉素、克林达奇(Clindatech)、氯唑西林、粘菌素、复方新诺明、地美环素、双氯西林、双氯唑西林、强力霉素、羟氨苄(Duricef)、红霉素、弗拉马嗪、菲宁达、新霉素B、褐霉酸钠、呋喃旦啶、夫西地酸、加替沙星、吉米沙星、吉米沙星、丙酸红霉素、碘、左氟沙星(Levaquin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、洛美沙星、美西肯、美福仙、美罗培南(Meronem)、米诺环素、莫西沙星、乙胺丁醇、制霉菌素、新孢霉素、萘替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、Norilet、氧氟沙星、头孢地尼(Omnicef)、Ospamox、土霉素、副霉素、青霉素、纽莫法、多粘菌素B-杆菌肽锌、聚维酮、利福定、利福平、利福昔明、卫非宁、异利福平、罗氏芬、罗红霉素、环丝氨酸、沙弗霉素(Soframycin)、司帕沙星、Staphlex、他格适、四环素、多西环素、亚甲赖氨酸四环素、妥布霉素、妥布霉素、乙硫异烟胺(Trecator)、替加环素、万古霉素、头孢拉定、长效土霉素、昔福申、司帕沙星、Zitrotek、Zoderm、加替沙星(Zymar)和利奈唑胺(Zyvox)。
示例性抗-细菌剂包括但不限于氨基糖苷(如，阿米卡星(AMIKIN.RTM.)、庆大霉素(GARAMYCIN.RTM.)、卡那霉素(KANTREX.RTM.)、新霉素(MYCIFRADIN.RTM.)、奈替霉素(NETROMYCIN.RTM.)、妥布霉素(NEBCIN.RTM.)、巴龙霉素(HUMATIN.RTM.))、安沙霉素类(如，格尔德霉素、除莠霉素)、碳头孢烯类(如，罗拉碳头孢(LORABID.RTM.)、碳青霉烯类(如，厄他培南(INVANZ.RTM.)、多利培南(DORIBAX.RTM.)、亚胺培南/西司他丁(PRIMAXIN.RTM.)、美罗培南(MERREM.RTM.)、头孢菌素类(第一代)(如，头孢氢氨苄(DURICEF.RTM.)、头孢唑啉(ANCEF.RTM.)、头炮噻头(cefalotin)或头孢噻吩(KEFLIN.RTM.)、头孢氨苄(KEFLEX.RTM.)、头孢菌素类(第二代)(如，头孢克洛(CECLOR.RTM.)、头孢羟唑(MANDOL.RTM.)、头孢西汀(MEFOXIN.RTM.)、头孢丙烯(CEFZIL.RTM.)、头孢呋辛(CEFTIN.RTM.、ZINNAT.RTM.))、头孢菌素类(第三代)(如，头孢克肟(SUPRAX.RTM.)、头孢地尼(OMNICEF.RTM.、CEFDIEL.RTM.)、头孢妥仑(SPECTRACEF.RTM.)、头孢哌酮(CEFOBID.RTM.)、头孢噻肟(CLAFORAN.RTM.)、头孢泊肟(VANTIN.RTM.)、头孢他啶(FORTAZ.RTM.)、头孢丁烯(CEDAX.RTM.)、头孢唑肟(CEFIZOX.RTM.)、头孢曲松(ROCEPHIN.RTM.))、头孢菌素类(第四代)(如，头孢吡肟(MAXIPIME.RTM.))、头孢菌素类(第五代)(如，头孢吡普(ZEFTERA.RTM.))、糖肽类(如，替考拉宁(TARGOCID.RTM.)、万古霉素(VANCOCIN.RTM.)、替拉万星(VIBATIV.RTM.))、林可酰胺类(如，克林霉素(CLEOCIN.RTM.)、林可霉素(LINCOClN.RTM.))、脂肽(如，达托霉素(CUBICIN.RTM.))、大环内酯类(如，阿奇霉素(ZITHROMAX.RTM.、SUMAMED.RTM.、ZITROCIN.RTM.)、克拉霉素(BIAXIN.RTM.)、地红霉素(DYNABAC.RTM.)、红霉素(ERYTHOCIN.RTM.、ERYTHROPED.RTM.)、罗红霉素、曲安霉素(TAO.RTM.)、泰利霉素(KETEK.RTM.)、大观霉素(TROBICIN.RTM.))、单内酰环类(如，氨曲南(AZACTAM.RTM.))、硝基呋喃类(如，呋喃唑酮(FUROXONE.RTM.)、呋喃妥因(MACRODANTIN.RTM.、MACROBID.RTM.))、青霉素类(如，阿莫西林(NOVAMOX.RTM.、AMOXIL.RTM.)、氨苄西林(PRINCIPEN.RTM.)、阿洛西林、羧苄青霉素(GEOCILLIN.RTM.)、氯唑西林(TEGOPEN.RTM.)、二氯唑西林(DYNAPEN.RTM.)、氟氯唑西林(FLOXAPEN.RTM.)、美洛西林(MEZLIN.RTM.)、甲氧西林(STAPHClLLIN.RTM.)、纳夫西林(UNIPEN.RTM.)、苯唑西林(PROSTAPHLIN.RTM.)、青霉素G(PENTIDS.RTM.)、青霉素V(PEN-VEE-K.RTM.)、哌拉西林(PIPRACIL.RTM.)、替莫西林(NEGABAN.RTM.)、替卡西林(TICAR.RTM.))、青霉素组合(如，阿莫西林/克拉维酸盐(AUGMENTIN.RTM.)、氨苄西林/舒巴坦(UNASYN.RTM.)、哌拉西林/他唑巴坦(ZOSYN.RTM.)、替卡西林/克拉维酸盐(TIMENTIN.RTM.))、多肽类(如，杆菌肽、粘菌素(COLY-MYCIN-S.RTM.)、多粘菌素B、喹诺酮类(如，环丙沙星(CIPRO.RTM.、CIPROXIN.RTM.、CIPROBAY.RTM.)、依诺沙星(PENETREX.RTM.)、加替沙星(TEQUIN.RTM.)、左氧氟沙星(LEVAQUIN.RTM.)、洛美沙星(MAXAQUIN.RTM.)、莫西沙星(AVELOX.RTM.)、萘啶酸(NEGGRAM.RTM.)、诺氟沙星(NOROXIN.RTM.)、氧氟沙星(FLOXIN.RTM.、OCUFLOX.RTM.)、曲伐沙星(TROVAN.RTM.)、格帕沙星(RAXAR.RTM.)、司帕沙星(ZAGAM.RTM.)、替马氟沙星(OMNIFLOX.RTM.))、磺胺类(如，磺胺米隆(SULFAMYLON.RTM.)、偶氮磺胺(PRONTOSIL.RTM.)、磺胺乙酰胺(SULAMYD.RTM.、BLEPH-100)、磺胺嘧啶(MICRO-SULFON.RTM.)、磺胺嘧啶银(SILVADENE.RTM.)、磺胺甲唑(TTHIOSULFIL FORTE.RTM.)、磺胺甲二唑(GANTANOL.RTM.)、磺亚胺(sulfanil酰胺)、柳氮磺吡啶(AZULFIDINE.RTM.)、磺胺异唑(GANTRISIN.RTM.)、甲氧苄啶(PROLOPRIM.RTM.)、TRIMPEX.RTM.)、甲氧苄啶磺胺甲唑(复方新诺明)(TMP-SMX)(BACTRIM.RTM.、SEPTRA.RTM.))、四环素类(如，地美环素(DECLOMYCIN.RTM.)、强力霉素(VIBRAMYCIN.RTM.)、米诺环素(MINOCIN.RTM.)、土霉素(TERRAMYCIN.RTM.)、四环素(SUMYCIN.RTM.、ACHROMYCIN.RTM.V、STECLIN.RTM.))、抗分枝杆菌药物(如，氯法齐明(LAMPRENE.RTM.)、氨苯砜(AVLOSULFON.RTM.),卷曲霉素(CAPASTAT.RTM.)、环丝氨酸(SEROMYCIN.RTM.)、乙胺丁醇(MYAMBUTOL.RTM.)、乙硫酰胺(TRECATOR.RTM.)、异烟肼(I.N.H..RTM.)、吡嗪酰胺(ALDIN酰胺.RTM.)、利福平(REFADIN.RTM.、RIMACTANE.RTM.)、利福布汀(MYCOBUTIN.RTM.)、利福喷丁(PRIFTIN.RTM.)、链霉素)、和其他(如，胂凡纳明(SALVARSAN.RTM.)、氯胺苯醇(氯霉素.RTM.)、磷霉素(MONUROL.RTM.)、夫西地酸(FUCIDIN.RTM.)、利奈唑胺(ZYVOX.RTM.)、甲硝唑(FLAGYL.RTM.)、莫匹罗星(BACTROBAN.RTM.)、平板霉素、奎奴普丁/达福普汀(SYNERCID.RTM.)、利福昔明(XIFAXAN.RTM.)、甲砜霉素、替加环素(TIGACYL.RTM.)、替硝唑(TINDAMAX.RTM.、FASIGYN.RTM.))。
在另一个实施方式中，提供通过施用编码抗病毒多肽(如文描述的抗病毒)的mNRA结合抗病毒剂，如本文描述的抗病毒多肽或小分子抗病毒剂治疗或预防对象中病毒感染和/或与病毒感染相关的疾病、障碍或病症，或其症状的方法。
与病毒感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角结膜炎、小儿肠胃炎、柯萨奇感染、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发HSV-1感染(如，儿童牙龈口炎、成人扁桃体炎和咽炎、角膜结膜炎)、潜伏HSV-1感染(如，唇疱疹和感冒疮)、原发性HSV-2感染、潜伏HSV-2感染、无菌性脑膜炎、传染性单核细胞增多症、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤、多中心卡斯特曼病、原发性渗出性淋巴瘤、AIDS、流感、雷伊综合征、麻疹、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、增生性上皮病变(如，常见扁平足底和肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、疣状表皮发育不良)、宫颈癌、鳞状细胞癌、哮吼、肺炎、细支气管炎、普通感冒、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、流感样综合征、伴肺炎严重细支气管炎、德国麻疹、先天性风疹、水痘和带状疱疹。
病毒病原体包括但不限于腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、脑炎病毒、EB病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、8型人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、水痘-带状病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒。病毒病原体还可以包括引起耐病毒感染的病毒。
示例性抗-病毒剂包括但不限于阿巴卡韦(ZIAGEN.RTM.)、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定(Trizivir.RTM.)、阿昔洛韦(aciclovir或acyclovir)(CYCLOVIR.RTM.、HERPEX.RTM.、ACIVIR.RTM.、ACIVIRAX.RTM.、ZOVIRAX.RTM.、ZOVIR.RTM.)、阿德福韦(Preveon.RTM.、Hepsera.RTM.)、金刚烷胺(SYMMETREL.RTM.)、安普那韦(AGENERASE.RTM.)、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦(REYATAZ.RTM.)、博赛泼维、西多福韦、达芦那韦(PREZISTA.RTM.)、地拉韦定(RESCRIPTOR.RTM.)、去羟肌苷(VIDEX.RTM.)、廿二烷醇(ABREVA.RTM.)、依多西定、依法韦仑(SUSTIVA.RTM.、STOCRIN.RTM.)、恩曲他滨(EMTRIVA.RTM.)、恩曲他滨/替诺福韦/依法韦仑(ATRIPLA.RTM.)、恩夫韦肽(FUZEON.RTM.)、恩替卡韦(BARACLUDE.RTM.、ENTAVIR.RTM.)、泛昔洛韦(FAMVIR.RTM.)、福米韦森(VITRAVENE.RTM.)、夫沙那韦(LEXIVA.RTM.、TELZIR.RTM.)、膦甲酸酯(FOSCAVIR.RTM.)、膦乙酸酯(fosfonet)、更昔洛韦(CYTOVENE.RTM.、CYMEVENE.RTM.、VITRASERT.RTM.)、GS 9137(ELVITEGRAVIR.RTM.)、咪喹莫特(ALDARA.RTM.、ZYCLARA.RTM.、BESELNA.RTM.)、茚地那韦(CRIXIVAN.RTM.)、肌苷、异丙肌苷(IMUNOVIR.RTM.)、I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素、kutapressin(NEXAVIR.RTM.)、拉米夫定(ZEFFIX.RTM.、HEPTOVIR.RTM.、EPIVIR.RTM.)、拉米夫定/齐多夫定(COMBIVIR.RTM.)、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗(SELZENTRY.RTM.、CELSENTRI.RTM.)、美替沙腙、MK-2048、莫罗西定、奈非那韦(VIRACEPT.RTM.)、奈韦拉平(VIRAMUNE.RTM.)、奥司他韦(TAMIFLU.RTM.)、聚乙二醇干扰素α-2a(PEGASYS.RTM.)、喷昔洛韦(DENAVIR.RTM.)、帕拉米韦、普来可那立、鬼臼毒素(CONDYLOX.RTM.)、雷特格韦(ISENTRESS.RTM.)、利巴韦林(COPEGUs.RTM.、REBETOL.RTM.、RIBASPHERE.RTM.、VILONA.RTM.AND VIRAZOLE.RTM.)、金刚乙烷(FLUMADINE.RTM.)、瑞托那韦(NORVIR.RTM.)、pyramidine、沙奎那韦(INVIRASE.RTM.、FORTOVASE.RTM.)、司他夫定、茶树油(白千层油)、替诺福韦(VIREAD.RTM.)、替诺福韦/恩曲他滨(TRUVADA.RTM.)、替拉那韦(APTIVUS.RTM.)、三氟尿苷(VIROPTIC.RTM.)、曲金刚胺(VIRU-MERZ.RTM.)、伐昔洛韦(VALTREX.RTM.)、缬更昔洛韦(VALCYTE.RTM.)、vicriviroc、阿糖腺苷、维拉米定、扎西他滨、扎那米韦(RELENZA.RTM.)和齐多夫定(叠氮胸苷(AZT)、RETROVIR.RTM.、RETROVIS.RTM.)。
与真菌感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于曲霉病、芽生菌病、念珠菌病、球虫病、隐球菌病、组织胞浆菌病、足分支菌病、类球孢子菌病和足癣。此外，患有免疫缺陷的人特别容易受到真菌属疾病的侵害，诸如曲霉菌、念珠菌、隐球菌、组织胞浆菌和肺孢子菌。其他真菌可攻击眼睛、指甲、头发和尤其是皮肤——所谓的皮肤真菌和角质化真菌，并引起多种病症，其中诸如脚癣等的癣是常见的。真菌孢子也是过敏的主要原因，并且不同分类群的多种真菌都可引起一些人的过敏反应。
真菌病原体包括但不限于子囊菌门(如，尖孢镰刀菌、耶氏肺孢子菌、曲霉菌属某些种、厌酷球孢子菌/波萨达斯球孢子菌(Coccidioides immitis/posadasii)、白色念珠菌)、担子菌门(如，新型线黑粉菌、毛孢子菌属(Trichosporon))、微孢子目(如，兔脑炎微孢子虫、肠微孢子虫)、和毛霉菌亚门(如，卷枝毛霉、米根霉、伞状毛霉菌)。
示例性抗-真菌剂包括但不限于多烯抗真菌药(如，那他霉素、龟裂霉素、菲利平、制菌霉素、两性霉素B、坎迪霉素、哈霉素)、咪唑抗真菌药(如，咪康唑(MICATIN.RTM.、DAKTARIN.RTM.)、酮康唑(NIZORAL.RTM.、FUNGORAL.RTM.、SEBIZOLE.RTM.)、克霉唑(LOTRIMIN.RTM.、LOTRIMIN.RTM.AF、CANESTEN.RTM.)、益康唑、奥莫康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑(ERTACZO.RTM.)、舒康唑、噻康唑)、三唑抗真菌药(如，阿巴康唑氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷伏康唑、波沙康唑、伏立康唑、特康唑)、噻唑抗真菌药(如，阿巴芬净)、烯丙基胺类(如，特比萘芬(LAMISIL.RTM.)、萘替芬(NAFTIN.RTM.)、布替萘芬(LOTRIMIN.RTM.Ultra))、棘白菌素类(如，阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净)等等(如，水蓼二醛、苯甲酸、环吡酮、托萘酯(TINACTIN.RTM.、DESENEX.RTM.、AFTATE.RTM.)、十一烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤普罗近、碳酸氢钠、大蒜素)。
与原生动物感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于阿米巴病、贾第虫病、滴虫病、非洲昏睡病、美国昏睡病、利什曼病(Kala-Azar)、肠袋虫病、弓形虫病、疟疾、棘阿米巴角膜炎和巴贝西虫病。
原生动物病原体包括但不限于溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、阴道毛滴虫、布鲁氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、结肠小袋虫、弓形虫、疟原虫属某些种和微小巴贝虫。
示例性抗-原生动物剂包括但不限于依氟鸟氨酸、呋喃唑酮(FUROXONE.RTM.、DEPENDAL-M.RTM.)、美拉胂醇、甲硝哒唑(FLAGYL.RTM.)、奥硝唑、硫酸巴龙霉素(HUMATIN.RTM.)、喷他脒、乙胺嘧啶(DARAPRIM.RTM.)和替硝唑(TINDAMAX.RTM.、FASIGYN.RTM.)。
与寄生生物感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝西虫病、肠袋虫病、baylisascariasis、恰加斯病、肝吸虫病、锥蝇属(cochliomyia)、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、布氏姜片虫病、丝虫病、贾第虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子虫病、片山热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病和鞭虫病。
寄生生物病原体包括但不限于棘阿米巴、异尖线虫、人蛔虫、肤蝇、结肠小袋虫、臭虫、绦虫类、恙螨、嗜人锥蝇、溶组织内阿米巴、肝片吸虫、贾第鞭毛虫、钩虫、利什曼原虫、锯齿舌形虫、肝吸虫、Loa boa、并殖吸虫、蛲虫、恶性疟原虫、血吸虫、粪类圆线虫、螨虫、绦虫、弓形虫、锥虫、鞭虫、斑氏丝虫。
示例性抗-寄生生物剂包括但不限于驱线虫药(如，甲苯咪唑、双羟萘酸噻嘧啶、噻苯达唑、二乙基乙胺嗪、伊维菌素)、驱绦虫药(anticestodes)(如，氯硝柳胺、吡喹酮、阿苯达唑)、驱吸虫药(antitrematodes)(如，吡喹酮)、驱阿米巴药(antiamoebics)(如，利福平、两性霉素B)和驱原生动物药(如，美拉胂醇、依氟鸟氨酸、甲硝哒唑、替硝唑)。
与朊病毒感染相关的疾病、障碍或病症包括但不限于克雅氏病(CJD)、医源性克雅氏病(iCJD)、变体克雅氏病(vCJD)、家族性克雅氏病(fCJD)、散发性克雅氏病(sCJD)、施特劳斯勒-申克综合征(GSS)、致命家族性失眠症(FFI)、库鲁病、羊痒病、牛海绵状脑病(BSE)、疯牛病、传染性水貂脑病(TME)、慢性消耗病(CWD)、猫海绵状脑病(FSE)、外来有蹄类脑病(EUE)和海绵状脑病。
示例性抗-朊病毒剂包括但不限于氟吡汀、戊聚糖多硫酸盐(pentosanpolysuphate)、奎那克林和四环化合物。
如本文所描述，本发明mRNA的有用特征是调谐(如，降低、规避或避免)细胞的先天免疫应答的能力。在一个方面中，本文提供的是编码目的多肽的mRNA，当被递送至细胞时，与由参考化合物(如与本发明的mRNA或本发明的不同mRNA对应的未修饰的多核苷酸)触发的应答相比，其导致来自宿主的降低的免疫应答。如本文所使用，“参考化合物”是当施用至哺乳动物时导致具有已知程度、水平或量的免疫刺激的先天免疫应答的任何分子或物质。参考化合物不需要是核酸分子并且其不需要是本发明的任何mRNA。因此，避免、规避或未能触发免疫应答的mRNA的量度可以相对于已知触发这种应答的任何化合物或物质进行表达。
术语“先天免疫应答”包括对通常是病毒或细菌来源的外源性单链核酸的细胞应答，其参与诱导细胞因子表达和释放——特别是干扰素，以及细胞死亡。如本文所用，先天免疫应答或干扰素应答在单细胞水平上起作用，引起细胞因子表达、细胞因子释放、蛋白质合成的整体抑制、细胞RNA的整体破坏、主要组织相容性分子的上调和/或凋亡死亡的诱导、参与凋亡、抗生长以及先天性和适应性免疫细胞活化的基因的基因转录的诱导。由I型IFN诱导的一些基因包括PKR、ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)、OAS(2',5'-低聚腺苷酸合成酶)、RNA酶L和Mx蛋白质。PKR和ADAR导致分别抑制翻译起始和RNA编辑。OAS是dsRNA依赖性合成酶，其活化核糖核酸内切酶RNA酶L以降解ssRNA。
在一些实施方式中，先天免疫应答包括I型或II型干扰素的表达，并且I型或II型干扰素的表达与来自还没有与本发明的mRNA接触的细胞的参考相比增加不超过2倍。
在一些实施方式中，先天免疫应答包括一种或多种IFN特征基因的表达并且其中一种或多种IFN特征基因的表达与来自还没有与本发明的mRNA接触的细胞的参考相比增加不超过3倍。
虽然在一些情况中，消除细胞中的先天免疫应答可能是有利的，但是本发明提供了如此mRNA，其在施用后导致基本上降低的(显著较少的)免疫应答，包括干扰素信号传导，而不完全消除这类应答。
在一些实施方式中，与通过参考化合物诱导的免疫应答相比，该免疫应答降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或大于99.9％。免疫应答自身可以通过确定1型干扰素的表达或活性水平或干扰素调节的基因(诸如toll样受体(如，TLR7和TLR8))的表达来测量。先天免疫应答的降低也可以通过测量一次或多次施用至细胞群体后降低的细胞死亡水平来测量；如，细胞死亡小于利用参考细胞观察到的细胞死亡频率的10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或超过95％。而且，细胞死亡可以影响小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或少于0.01％的与mRNA接触的细胞。
在另一个实施方式中，与未经修饰的体外合成的RNA分子多核苷酸或具有相同序列或参考化合物的一级构建体相比，本发明的mRNA免疫原性显著较低。如本文所用，“免疫原性显著较低”是指免疫原性的可检测的降低。在另一个实施方式中，该术语是指免疫原性成倍降低。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以施用有效量的mRNA而不会触发可检测的免疫应答的降低。在另一个实施方式中，该术语是指使得可以重复施用mRNA而不会引起足以可检测地减少重组蛋白质表达的免疫应答的降低。在另一个实施方式中，这种降低使得可以重复施用mRNA而不会引起足以消除重组蛋白质可检测表达的免疫应答。
在另一个实施方式中，mRNA比其未修饰的对应物或参考化合物少2倍免疫原性。在另一个实施方式中，免疫原性降低3倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低5倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低7倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低10倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低15倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低数倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低50倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低100倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低200倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低500倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低1000倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低2000倍。在另一个实施方式中，免疫原性降低另外的倍数差。
本领域内已知确定免疫原性的方法，并且其包括如，测量细胞因子(如IL-12、IFNα、TNF-α、RANTES、MIP-1α或β、IL-6、IFN-β或IL-8)的分泌，测量DC活化标记物(如CD83、HLA-DR、CD80和CD86)的表达，或测量作为适应性免疫应答的佐剂的能力。
本发明的mRNA，包括本文教导的修饰的组合，可具有优异的性质，这使其更适合作为治疗手段。
已经确定，本领域的“全有或全无”模型非常不足以描述与修饰的mRNA的治疗用途相关的生物现象。本发明人已经确定，为了提高蛋白质生产，可以考虑修饰的性质或修饰组合、修饰百分数和一种以上的细胞因子或度量的调查来确定特定修饰的mRNA的功效和风险概况。
在本发明的一方面，确定与未修饰的mRNA相比修饰的mRNA的有效性的方法涉及一种或多种细胞因子的测量和分析，所述细胞因子的表达通过施用本发明的外源性核酸触发。将这些值与未修饰核酸的施用或与标准度量(诸如细胞因子应答、PolyIC、R-848或本领域已知的其他标准品)进行比较。
本文开发的标准度量的一个实例是细胞、组织或生物体中产生的编码的多肽(蛋白质)的水平或数量与一种或多种(或一组)细胞因子的水平或数量的比率的测量，所述细胞因子的表达由于施用或接触修饰的核酸而在细胞、组织或生物体内触发。这样的比率在本文中称为蛋白质：细胞因子比率或“PC”比率。PC比率越高，修饰的核酸(编码所测量蛋白质的多核苷酸)的功效就越高。本发明的细胞因子的优选PC比率可以大于1、大于10、大于100、大于1000、大于10,000或更大。具有比不同或未修饰构建体的修饰核酸更高的PC比率的修饰核酸是优选的。
PC比率可以进一步通过多核苷酸中存在的修饰百分比进行量化。例如，将其归一化为100％修饰的核酸，可以确定作为细胞因子(或风险)或细胞因子概况函数的蛋白质生产。
在一个实施方式中，本发明提供了通过比较修饰的核酸(mRNA)的PC比率来确定跨化学、细胞因子或修饰百分数的任何特定修饰的mRNA的相对功效的方法。
可以产生含有变化水平的核碱基取代的mRNA，其维持增加的蛋白质生产和降低的免疫刺激潜能。在IVT反应期间中，任何修饰的核苷酸与其天然存在的核苷酸对应物的相对百分比可以改变(例如，100％、50％、25％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、0.01％5甲基胞苷用量vs胞苷；100％、50％、25％、10％、5％、2.5％、1％、0.1％、0.01％的假尿苷或N1-甲基-假尿苷用量vs尿苷)。也可以制备mRNA，其利用不同比率——使用2个或更多个不同的核苷酸与同一碱基(例如，假尿苷和N1-甲基-假尿苷的不同比率)。也可以以大于1个“碱基”位置处的混合比例(诸如，同时5个甲基胞苷/胞苷与假尿苷/N1-甲基-假尿苷/尿苷的比率)制备mRNA。使用具有改变比率的修饰核苷酸的修饰mRNA可以在减少对化学修饰核苷酸的潜在暴露方面有益。最后，将修饰的核苷酸定位引入mRNA——其调谐蛋白质产生或免疫刺激潜能或两者——也是可能的。可以在体外(使用试验，诸如本文描述的PBMC试验)评估这类mRNA证明这些提高的性质的能力，并且其还可以在体内通过测量mRNA-编码的蛋白质产生和先天免疫识别的调谐子诸如细胞因子两者进行评估。
在另一个实施方式中，通过确定引发上述应答之一至与给定量的未修饰的核苷酸或参考化合物相同的程度所需的mRNA的量，确定mRNA和其未修饰的对应物的相对免疫原性。例如，如果引发相同应答所需的mRNA为两倍，则mRNA的免疫原性比未修饰的核苷酸或参考化合物低两倍。
在另一个实施方式中，通过确定相对于相同量的未修饰的核苷酸或参考化合物响应于施用mRNA分泌的细胞因子(如IL-12、IFNα、TNF-α、RANTES、MIP-1α或β、IL-6、IFN-β或IL-8)的量，确定mRNA和其未修饰的对应物的相对免疫原性。例如，如果分泌一半的细胞因子，则其免疫原性要比未修饰的核苷酸少两倍。在另一个实施方式中，在计算上述方法中的免疫原性之前减去刺激的背景水平。
本文还提供了在细胞或细胞群体中进行免疫应答的滴定、减少或消除的方法。在一些实施方式中，使细胞与改变剂量的相同mRNA接触并评估剂量应答。在一些实施方式中，使细胞与相同或不同剂量的众多不同的mRNA接触以确定产生期望效果的最佳组合物。关于免疫应答，期望的效果可以是避免、规避或减少细胞的免疫应答。期望的效果还可以是改变蛋白质生产的效率。
本发明的mRNA可用于使用国际公开号WO2013003475中描述的方法减少免疫应答，国际公开号WO2013003475通过引用以其全部并入本文。
另外地，当被引入本发明的mRNA时，某些修饰的核苷或其组合将活化先天免疫应答。当与多肽和/或其他疫苗组合时，这类活化分子可用作佐剂。在某些实施方式中，活化分子含有可翻译区，其编码可作用疫苗的多肽序列，由此提供成为自佐剂(self-adjuvant)的能力。
在一个实施方式中，本发明的mRNA可以编码免疫原。递送编码免疫原的mRNA可以活化免疫应答。作为非限制性实例，编码免疫原的mRNA可以被递送至细胞以触发多条先天应答途径(参见，国际公开号WO2012006377；通过引用以其全部并入本文)。作为另一非限制性实例，本发明的编码免疫原的mRNA可以被以足够大以对脊椎动物免疫原性的剂量递送至脊椎动物(参见，国际公开号WO2012006372和WO2012006369；其中每篇通过引用以其全部并入本文)。在一些实施方式中，mRNA编码免疫原，其包括但不限于寨卡病毒包膜蛋白质(Env)抗原、包括一种或多种与癌症相关的突变的KRAS抗原、流感病毒抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原(包括gH、gL、UL128、UL130、UL131A和疱疹病毒糖蛋白(gB))、人偏肺病毒(HMPV)抗原、副流感病毒(PIV3)抗原和癌症相关的新表位。
本发明的mRNA可以编码疫苗的多肽序列并且可以进一步包括抑制剂。抑制剂可以削弱抗原呈递和/或抑制本领域的各种途径。作为非限制性实例，本发明的mRNA可用于疫苗——结合可削弱抗原呈递的抑制剂(参见，国际公开号WO2012089225和WO2012089338；其中每篇通过引用以其全部并入本文)。
在一个实施方式中，本发明的mRNA可以是自复制RNA。自复制RNA分子可以增强RNA递送的效率和封闭的基因产品的表达。在一个实施方式中，mRNA可以包括本文描述的和/或本领域已知的至少一种修饰。在一个实施方式中，可以设计自复制RNA，以便自复制RNA不诱导感染性病毒颗粒的产生。作为非限制性实例，可以通过美国公开号US20110300205和国际公开号WO2011005799中描述的方法设计自复制RNA，其中每篇通过引用以其全部并入本文。
在一个实施方式中，本发明的自复制mRNA可以编码升高免疫应答的蛋白质。作为非限制性实例，mRNA可以是可以编码至少一种抗原的自复制mRNA(参见美国公告号US20110300205和国际公开号WO2011005799、WO2013006838和WO2013006842；其中每篇通过引用以其全部并入本文)。
在一个实施方式中，可以使用本文描述的或本领域已知的方法配制本发明的自复制mRNA。作为非限制性实例，自复制RNA可以通过Geall等人(Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines,PNAS 2012；PMID：22908294)描述的方法进行配制用于递送。
在一个实施方式中，本发明的mRNA可以编码两亲性和/或免疫原性两亲性肽。
在一个实施方式中，本发明的mRNA的制剂可以进一步包含两亲性和/或免疫原性两亲性肽。作为非限制性实例，包含两亲性和/或免疫原性两亲性肽的mRNA可以如美国公开号US20110250237和国际公开号WO2010009277和WO2010009065中所描述进行配制；其中每篇通过引用以其全部并入本文。
在一个实施方式中，本发明的mRNA可以是免疫刺激性的。作为非限制性实例，mRNA可以编码全部或部分正义或负义链RNA病毒基因组(参见国际公开号WO2012092569和美国公开号US20120177701，其中每篇通过引用以其全部并入本文)。在另一非限制性实例中，本发明的免疫刺激性mRNA可以如本文描述的和/或本领域已知的利用赋形剂配制用于施用(参见国际公开号WO2012068295和美国公开号US20120213812，其中每篇通过引用以其全部并入本文)。
在一个实施方式中，通过本文描述的方法配制的疫苗的应答可以通过添加各种化合物诱导治疗效果进行增强。作为非限制性实例，疫苗制剂可以包括MHC II结合肽或具有与MHCII结合肽类似序列的肽(参见，国际公开号WO2012027365、WO2011031298和美国公开号US20120070493、US20110110965；其中每篇通过引用以其全部并入本文)。作为另一实例，疫苗制剂可以包含修饰的烟碱化合物，其可以产生对对象中烟碱残余物的抗体应答(参见国际公开号WO2012061717和美国公开号US20120114677；其中每篇通过引用以其全部并入本文)。
天然存在的突变体
在另一个实施方式中，mRNA可以用于表达具有改进的疾病修饰活性(包括增加的生物活性、改进的患者结果或保护功能等)的天然存在蛋白质的变体。已经在如下文献中描述了哺乳动物中的许多这样的修饰基因(Nadeau,Current Opinion in Genetics&Development 2003 13：290-295；Hamilton and Yu,PLoS Genet.2012；8：e1002644；Corderet al.,Nature Genetics 1994 7：180-184；所有通过引用以其全部并入本文)。人中的实例包括Apo E2蛋白质、Apo A-I变体蛋白质(Apo A-I Milano、Apo A-I Paris)、高活性因子IX蛋白质(因子IX Padua Arg338Lys)、运甲状腺素蛋白突变体(TTR Thr119Met)。已经显示ApoE2(cys112,cys158)相对其他ApoE同种型(ApoE3(cys112,arg158)和ApoE4(arg112,arg158))的表达通过减低阿尔茨海默病和可能地其他病症(诸如心血管疾病(Corder etal.,Nature Genetics 1994 7：180-184；Seripa et al.,Rejuvenation Res.2011 14：491-500；Liu et al.Nat Rev Neurol.2013 9：106-118；全部通过引用以其全部并入本文)的易感性赋予保护。Apo A-I变体的表达已经与降低的胆固醇相关(deGoma and Rader,2011Nature Rev Cardiol 8：266-271；Nissen et al.,2003JAMA 290：2292-2300；全部通过引用以其全部并入本文)。在某些群体中ApoA-I的氨基酸序列已经被变化为半胱氨酸——在Apo A-I Milano(Arg 173改变为Cys)和Apo A-I Paris(Arg 151改变为Cys)中。在位置R338L(FIX Padua)的因子IX突变导致因子IX蛋白质，其具有约10倍增加的活性(Simioni et al.,N Engl J.Med.2009 361：1671-1675；Finn et al.,Blood.2012 120：4521-4523；Cantore et al.,Blood.2012 120：4517-20；所有通过引用以其全部并入本文)。已经显示运甲状腺素蛋白在位置104或119的突变(Arg104 His、Thr119Met)为也患有引起Va130Met突变的疾病的患者提供保护(Saraiva,Hum Mutat.2001 17：493-503；DATABASE ON TRANSTHYRETIN MUTATIONS www.ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html；全部通过引用以其全部并入本文)。观察分别携带Met 119和His104突变的葡萄牙和日本Met 30患者中症状的临床表现和严重度的差异，具有非病原体突变体发挥的明显的保护作用(Coelhoet al.1996Neuromuscular Disorders(Suppl)6：S20；Terzazki etal.1999.BiochemBiophys Res Commun 264：365-370；全部通过引用以其全部并入本文)，其为分子赋予更大的稳定性。编码这些保护性TTR等位基因的修饰的mRNA可以在TTR淀粉状蛋白病患者中表达，由此降低病原体突变体TTR蛋白质的效果。
如本文所描述，术语“大沟相互作用配偶体(major groove interactingpartner)”指的是通过相互作用，如与核苷酸或核酸的大沟面相结合检测和应答RNA配体的RNA识别受体。因此，包含修饰的核苷酸或核酸(诸如本文描述的mRNA)的RNA配体降低与大沟结合配偶体的相互作用，并因此降低先天免疫应答。
实例大沟相互作用——如结合——配偶体包括但不限于以下核酸酶和解旋酶。在膜内，TLR(Toll样受体)3、7和8可以对单链和双链RNA应答。在细胞质内，超家族2类DEX(D/H)解旋酶和ATP酶的成员可以感知RNA来启动抗病毒应答。这些解旋酶包括RIG-I(维甲酸诱导基因I)和MDA5(黑素瘤分化相关基因5)。其他实例包括遗传和生理学实验室2(LGP2)、包含HIN-200结构域的蛋白质或包含解旋酶结构域的蛋白质。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码肿瘤阻抑蛋白，其中蛋白质对应肿瘤阻抑基因。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是BRCA1。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是BRCA2。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是视网膜母细胞瘤RB(或RB1)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是TSC1。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是TSC2。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白PTEN。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白PTEN由人PTEN序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：BC005821、JF268690、U92436、CR450306、AK024986、AK313581、U96180、和U93051和NM_000314。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白p53。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白p53由人TP53序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：AF052180、NM_000546、AY429684、BT019622、AK223026、DQ186652、DQ186651、DQ186650、DQ186649、DQ186648、DQ263704、DQ286964、DQ191317、DQ401704、AF307851、AM076972、AM076971、AM076970、DQ485152、BC003596、DQ648887、DQ648886、DQ648885、DQ648884、AK225838、M14694、M14695、EF101869、EF101868、EF101867、X01405、AK312568、NM_001126117、NM_001126116、NM_001126115、NM_001126114、NM_001126113、NM_001126112、FJ207420、X60020、X60019、X60018、X60017、X60016、X60015、X60014、X60013、X60011、X60012、X60010、X02469、S66666、AB082923、NM_001126118、JN900492、NM_001276699、NM_001276698、NM_001276697、NM_001276761、NM_001276760、NM_001276696和NM_001276695。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白BRCA1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA1由人BRCA1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：NM_007294、NM_007297、NM_007298、NM_007304、NM_007299、NM_007300、BC046142、BC062429、BC072418、AY354539、AY751490、BC085615、BC106746、BC106745、BC114511、BC115037、U14680、AK293762、U68041、BC030969、BC012577、AK316200、DQ363751、DQ333387、DQ333386、Y08864、JN686490、AB621825、BC038947、U64805和AF005068。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白BRCA2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA2由人BRCA2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：BC047568、NM_000059、DQ897648、BC026160。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白TSC1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC1由人TSC1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：BC047772、NM_000368、BC070032、AB190910、BC108668、BC121000、NM_001162427、NM_001162426、D87683和AF013168。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白TSC2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC2由人TSC2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：BC046929、BX647816、AK125096、NM_000548、AB210000、NM_001077183、BC150300、BC025364、NM_001114382、AK094152、AK299343、AK295728、AK295672、AK294548和X75621。
在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白视网膜母细胞瘤1(RB1)。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白RB1由人RB1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_000321、AY429568、AB208788、M19701、AK291258、L41870、AK307730、AK307125、AK300284、AK299179、M33647、M15400、M28419、BC039060、BC040540和AF043224。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码蛋白质，其中该蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码蛋白质，其中个体中该蛋白质的表达调谐对个体中该蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关抗原(如，肿瘤相关抗原)，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关抗原，诸如肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFP mRNA(5moU)或CleanCap Cyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含Luc mRNA，例如，CleanCap Fluc mRNA、CleanCap Fluc mRNA(5moU)、CleanCapCyanine 5Fluc mRNA(5moU)、CleanCap Gaussia Luc mRNA(5moU)或CleanCap RenillaLuc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自如下的mRNA：CleanCapβ-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物进一步包含干扰RNA(RNAi)，或将与RNAi结合使用。在一些实施方式中，RNAi包括但不限于siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方式中，RNAi是siRNA。在一些实施方式中，RNAi是微小RNA。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向疾病相关基因，如，癌症-相关基因，诸如癌基因。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因。在一些实施方式中，癌基因是Smoothened。在一些实施方式中，癌基因是rasK。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向癌基因，其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体包含KRAS畸变。在一些实施方式中，KRAS畸变包含在KRAS的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向KRAS的突变体形式。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)特异性靶向KRAS的突变体形式，但是不靶向KRAS的野生型形式。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含在KRAS的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向KRAS的多个突变体形式。在一些实施方式中，多个突变体形式包含KRAS的多个畸变，其中KRAS的多个畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，KRAS的多个畸变包含KRAS的密码子12和61上的至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含多个RNAi(如，siRNA)，其包含第一RNAi(如，第一siRNA)和第二RNAi(如，第二siRNA)，其中第一RNAi靶向KRAS的第一突变体形式，和其中第二RNAi靶向KRAS的第二突变体形式。在一些实施方式中，第一RNAi和/或第二RNAi不靶向KRAS的野生型形式。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有密码子12上的突变的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有密码子61上的突变的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRASG12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含含有第一RNAi(如，第一siRNA)、第二RNAi(如，第二siRNA)和第三RNAi(如，siRNA)的多个RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，第一RNAi靶向KRAS的第一突变体形式，第二RNAi靶向KRAS的第二突变体形式，和第三RNAi靶向KRAS的第三突变体形式。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含含有KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的突变的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D和Q61K。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自以下的KRAS畸变：G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，第二突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变，和第三突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向含有5’-GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:83)、5’-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3(反义)(SEQ ID NO:84)、5’-GAAGUGCAUACACCGAGACTT-3’(有义)(SEQ ID NO:86)、5’-GUCUCGGUGUAGCACUUCTT-3’(反义)(SEQ ID NO:87)、5’-GUUGGAGCUGUUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:88)和/或5'-CUACGCCAACAGCUCCAACTT-3’(反义)(SEQ ID NO:89)的序列的KRAS的RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向含有选自具有SEQ ID NO:83,84,86-89的序列的核酸序列的KRAS的RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向含有靶向KRAS G12S的序列的KRAS的RNAi(如，siRNA)，诸如在Acunzo,M.et al.,Proc Natl AcadSci USA.2017May 23；114(21)：E4203-E4212中公开的siRNA序列。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向KRAS的RNAi(如，siRNA)，如在WO2014013995、JP2013212052、WO2014118817、WO2012129352、WO2017179660、JP2013544505、US8008474、US7745611、US7576197、US7507811中所公开的，其中每篇完全并入本申请。
在一些实施方式中，RNAi包括但不限于siRNA、shRNA和miRNA。术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”是指当干扰RNA与靶基因或序列在同一细胞中时能够降低或抑制靶基因或序列的表达(如，通过介导降解或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)的单链RNA(如，成熟miRNA)或双链RNA(即，双链体RNA，诸如siRNA、aiRNA或前-miRNA)，干扰RNA因此是指与靶mRNA序列互补的单链RNA或由两个互补链或单个自互补链形成的双链RNA。干扰RNA可以具有与靶基因或序列基本上或完全的同一性，或可以包含错配区(即，错配基序)。干扰RNA的序列可以对应全长靶基因或其子序列。干扰RNA包括“小-干扰RNA”或“siRNA”，如，长度在约15-60、15-50或5-40(双链体)个核苷酸的干扰RNA，更典型地，长度在约15-30、15-25或19-25(双链体)个核苷酸，和优选地约20-24、21-22或21-23(双链体)个核苷酸长度(如，双链siRNA的每个互补序列长度在15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地长度在约20-24、21-22或21-23个核苷酸，和双链siRNA长度为约15-60、15-50、15-40、5-30、5-25或19-25个碱基对，优选地长度约8-22、9-20或19-21个碱基对)。siRNA双链体可以包含约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。siRNA的实例包括但不限于由两个单独的链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一个链是有义链和另一个是互补的反义链；由单个链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接；具有发卡二级结构的双链多核苷酸分子，其中发卡二级结构具有自互补的有义和反义区；和环状单链多核苷酸分子，其具有两个或更多个环结构和具有自互补的有义和反义区的茎，其中环状多核苷酸可以体内或体外加工以产生活性双链siRNA分子。优选地，siRNA通过化学合成。siRNA还可以通过利用大肠杆菌RNA酶III或Dicer裂解较长的dsRNA产生(如，长度上大于约25个核苷酸的dsRNA)。这些酶将dsRNA加工为生物活性siRNA(参见，如，Yang et al.,Proc Natl.Acad.Set.USA,99：9942-9947(2002)；Calegari et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99：14236(2002)；Byrom et al.,AmbionTeehNotes,10(l)：4-6(2003)；Kawasaki et al.,Nucleic Acids Res.,3 1：981-987(2003)；Knight et al.,Science,293：2269-2271(2001)；和Robertson et al.,J.Biol.Chem.,243：82(1968))。优选地，dsRNA为至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸长度。dsRNA可以在长度上长达1000、1500、2000、5000个核苷酸，或更长。dsRNA可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况中，siRNA可以由质粒编码(如，转录为自动折叠成带有发夹环的双链体的序列)。小发卡RNA或短发卡RNA(shRNA)是制造紧密发卡弯的RNA序列，其可被用于经由RNA干扰沉默基因表达。shRNA发卡结构通过细胞机器切割为siRNA，其然后与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。该复合物与mRNA结合并将其切割，所述mRNA匹配与其结合的siRNA。RNAi的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，RNAi是与对应的靶基因基本上互补的(诸如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的)。在一些实施方式中，RNAi例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
在一些实施方式中，RNAi是双链RNAi。RNAi的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，RNAi是与对应的靶基因基本上互补的(诸如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更高同一性的)。在一些实施方式中，RNAi例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
在一些实施方式中，RNAi特异性靶向RNA分子，诸如mRNA，其编码参与疾病(诸如癌症)的蛋白质。在一些实施方式中，疾病是癌症，诸如实体瘤或血液系统恶性肿瘤，和干扰RNA靶向编码参与癌症的蛋白质(诸如参与调节癌症进展的蛋白质)的mRNA。在一些实施方式中，RNAi靶向参与癌症的癌基因。
在一些实施方式中，RNAi特异性靶向RNA分子，诸如mRNA，其编码参与负调节免疫应答的蛋白质。在一些实施方式中，干扰RNA靶向编码阴性共刺激分子的mRNA。在一些实施方式中，阴性共刺激分子包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3和CTLA-4。
在一些实施方式中，RNAi是miRNA。微小RNA(缩写为miRNA)是在真核细胞中发现的短核糖核酸(RNA)分子。与其他RNA相比，微小RNA分子具有非常少的核苷酸(平均22个)。miRNA是与靶信使RNA转录物(mRNA)上互补序列结合的后转录调节子，通常导致翻译阻抑或靶标降解和基因沉默。人基因组可以编码超过1000个miRNA，其可靶向约60％的哺乳动物基因并且在许多人细胞类型中是丰富的。miRNA的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或约0-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，miRNA是与对应的靶基因基本上互补的(诸如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的)。在一些实施方式中，miRNAi例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
mRNA和/或RNAi的修饰
在一些实施方式中，本文描述的任意mRNA和/或RNAi分子可以进行修饰。经修饰的mRNA或RNAi具有避免本领域中一个或多个问题的结构和/或化学特征，例如，可用于优化基于核酸的治疗剂同时保留结构和功能完整性，克服表达阈值，提高表达率、半衰期和/或蛋白质浓度，优化蛋白质定位，和避免有害的生物应答，诸如免疫应答和/或降解途径的特征。mRNA和/或RNAi的修饰可以在包含mRNA或RNAi的核苷的核苷碱基和/或糖部分上。
教导修饰的mRNA和/或RNAi分子以及其制备的一些实例的代表性美国专利和专利申请包括但不限于美国专利号8802438、美国专利申请号2013/0123481，其中每篇通过引用以其全部并入本文。
在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi分子经修饰以提高组织中的稳定性和/或清除率、受体摄取和/或动力学、组成物的细胞进入(cellular access by the compositions)、与翻译机器的接合、半衰期、翻译效率、免疫逃避、蛋白质生产能力、分泌效率(当适用时)、循环可及性(accessibility to circulation)、蛋白质半衰期和/或细胞状态、功能和/或活性的调谐。
mRNA或RNAi可以包括任何有用的修饰，诸如对糖、核碱基或核苷间键(如，对连接磷酸/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)。例如，mRNA或RNAi的大沟或核碱基的大沟面可包含一个或多个修饰。嘧啶核碱基(如在大沟面上)的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(如，甲基或乙基)或卤素(如，氯或氟)替换或取代。在某些实施方式中，每个糖和核苷间键都存在修饰(如，一个或多个修饰)。根据本发明的修饰可以是修饰核糖核酸(RNA)为脱氧核糖核酸(DNA)，如，核糖呋喃糖基环的2'OH取代为2'H，苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂合物)。本文描述了另外的修饰。
在一些实施方式中，修饰在核碱基上并且选自假尿苷或N1-甲基假尿苷。在一些实施方式中，经修饰的核苷不是假尿苷(ψ)或5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些实施方式中，在修饰的核酸中或mRNA或RNAi的一个或多个个体核苷或核苷酸中包括多个修饰。例如，对核苷的修饰可以包括对核碱基和糖的一个或多个修饰。
在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi在大沟面上进行化学修饰，从而破坏大沟结合配偶体相互作用，其可以引起先天免疫应答。
在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi分子包含破坏大沟相互作用(如结合)配偶体与核酸结合的核苷酸，其中核苷酸具有对大沟相互作用配偶体的降低的结合亲和力。
在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi分子包含含有化学修饰的核苷酸，其中核苷酸具有对大沟相互作用配偶体的改变的结合。在一些实施方式中，化学修饰定位在核碱基的大沟面上，并且其中化学修饰可以包括用胺、SH、烷基(如，甲基或乙基)或卤素(如，氯或氟)替换或取代嘧啶核碱基的原子。在一些实施方式中，化学修饰定位在核苷酸的糖部分上。在一些实施方式中，化学修饰定位在核酸的磷酸主链上。在一些实施方式中，化学修饰改变核酸的大沟面上的电化学。
在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi分子包括含有化学修饰的核苷酸，其中与由对应未修饰的核酸诱导的细胞先天免疫相比，该核苷酸减少细胞先天免疫应答。
修饰可以是各种不同的修饰。在一些实施方式中，mRNA被修饰，其中编码区、侧接区和/或末端区可以含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷或核苷酸修饰。
在一些实施方式中，与未修饰的多核苷酸相比，引入至细胞的修饰的mRNA和/或RNAi可以展现降低的降解和/或降低的细胞先天免疫或干扰素应答。修饰包括但不限于例如，(a)端修饰，如，5’端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向键等等)，3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键等等)，(b)碱基修饰，如，用修饰的碱基替换，稳定碱基，去稳定碱基，或与配偶体的扩展库碱基配对的碱基，或缀合的碱基，(c)糖修饰(如，在2’位置或4’位置)或糖的替换，以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。在某种程度上，此类修饰干扰mRNA的翻译(即，相对于缺乏修饰——如在兔网织红细胞的体外翻译试验中，导致翻译中50％或更大的降低)，该修饰不适合本文描述的方法和组合物。可用于本文描述的方法的修饰的mRNA或RNAi分子的具体实例包括但不限于含有修饰的或非天然核苷间键的RNA分子。具有修饰的核苷间键的修饰的mRNA或RNAi分子包括在核苷间键中不具有磷原子的那些等等。在其他实施方式中，合成修饰的RNA在其核苷间键(一个或多个)中具有磷原子。
修饰的核苷间键的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、磷酰胺(包括3’-氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺、硫羰磷酰胺(thionophosphoramidate))、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫羰烷基磷酸三酯和具有正3’-5’键的硼烷磷酸、这些2’-5’连接的类似物和具有反向极性的那些，其中核苷单元的相邻对是连接的3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
其中不包括磷原子的修饰的核苷间键具有通过短链烷基形成的核苷间键或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉代键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸主链；亚甲基亚胺和亚甲基肼基主链；磺酸和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2成分部分的其他主链。
在一些实施方式中，本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子包括具有硫代磷酸酯核苷间键的核酸和具有杂原子核苷间键的低聚核苷，并且特别是上面提到的美国专利号5,489,677的—CH2-NH—CH2-、—CH2-N(CH3)-O—CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI]、—CH2-O—N(CH3)-CH2-、—CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和—N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然磷酸二酯核苷间键表示为—O—P—O—CH2-]，和上面提到的美国专利号5,602,240的酰胺主链，这两篇通过引用以其全部并入本文。在一些实施方式中，本文特征的核酸序列具有上面提到的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构，其通过引用以其全部并入本文。
本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子还可以含有一个或多个取代的糖部分。本文特征的核酸可以包括2’位处以下中的一个：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至约10。在一些实施方式中，修饰的RNA包括2’位处以下中的一个：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、报告基团、嵌入剂、用于提高RNA药代动力学特性的基团、或用于提高修饰RNA的药物动力学特性的基团、和具有类似性质的其他取代基。在一些实施方式中，修饰包括2′甲氧基乙氧基(2′-O—CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin etal.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2′-二甲基氨基氧乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域内也称为2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即，2′-O—CH2-O—CH2-N(CH2)2。
其他示例性修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。类似的修饰还可以在核酸序列上的其他位置处进行，具体地，在3′末端核苷酸上或2′-5′连接的核苷酸中的糖的3′位和5′末端核苷酸的5′位。修饰的RNA还可以具有糖模拟物，诸如代替戊呋喃糖基糖的环丁基部分。
作为非限制性实例，本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子可以包括包含2′-O-甲基修饰的核苷的至少一个修饰的核苷、包含5′硫代磷酸酯基团的核苷、2′-氨基-修饰的核苷、2′-烷基-修饰的核苷、吗啉代核苷、包含磷酰胺或非天然碱基的核苷或其任何组合。
在一些实施方式中，至少一个修饰的核苷选自N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲氧基尿苷(5moU)、肌苷(I)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、假尿苷(Ψ)、5-羟基甲基胞嘧啶(hm5C)、和N1-甲基腺苷(m1A)、N1-甲基假尿苷(me(1)ψ)、5-甲基胞苷(5mC)、3,2′-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫尿苷(s2U)、2′氟尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、2′脱氧尿苷(2′dU)、4-硫代尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基腺苷(m6A)、N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基腺苷(m62Am)、2′-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2′-O-甲基鸟苷(Gm)、N2,7-二甲基鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-三甲基鸟苷(m2,2,7G)和肌苷(I)。在一些实施方式中，至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。
在一些实施方式中，修饰的mRNA或RNAi分子包含至少一个核苷(“碱基”)修饰或取代。修饰的核苷包括其他合成和天然核碱基，诸如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟嘌呤核苷(isoguanisine)、杀结核菌素、2-(卤)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲基硫)N6(异戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(脱氮杂)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8-(卤)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6、N6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(脱氮杂)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8(卤)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、2-(硫)胞嘧啶、3(脱氮杂)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、2-(硫)尿嘧啶、5(甲基)2(硫)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫)尿嘧啶、4-(硫)尿嘧啶、5(甲基)4(硫)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫)尿嘧啶、5(甲基)2,4(二硫)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2,4(二硫)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍烷基)尿嘧啶、5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫)假尿嘧啶、4(硫)假尿嘧啶、2,4-(二硫)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4(二硫)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4(二硫)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫)-假尿嘧啶、1取代的4(硫)假尿嘧啶、1取代的2,4-(二硫)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-酚噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫)-3-(氮杂)-酚噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二英)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟嘌呤核苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异碳苯乙烯基(isocarbostyrilyl)、5-(甲基)异碳苯乙烯基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异碳苯乙烯基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异碳苯乙烯基、7-(丙炔基)异碳苯乙烯基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲蒽基、芘基、二苯乙烯基、并四苯基(tetracenyl)、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基、或其任意O-烷基化或N-烷基化衍生物。修饰的核苷还包括含有缀合部分(如配体)的天然碱基。
进一步修饰的核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些，ModifiedNucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；2009年3月26日提交的国际申请号PCT/US09/038,425中公开的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，和Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613公开的那些。
教导制备某些上面提到的修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上面提到的美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,457,191；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其中每篇通过引用以其全部并入本文，和美国专利号5,750,692，也通过引用以其全部并入本文。
与本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子一起使用的另一修饰涉及将RNA化学连接至一个或多个配体、部分或缀合物，其增强RNA的活性、细胞分布或细胞摄取。当，例如，修饰的mRNA或RNAi体内施用时，配体可以是特别有用的。这类部分包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556，通过引用以其全部并入本文)、胆酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060，通过引用以其全部并入本文)、硫醚如绿柱石-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770，其中每篇通过引用以其全部并入本文)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538，通过引用以其全部并入本文)、脂肪链如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov etal.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54，其中每篇通过引用以其全部并入本文)、磷脂如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783，其中每篇通过引用以其全部并入本文)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14：969-973，通过引用以其全部并入本文)或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,TetrahedronLett.,1995,36：3651-3654，通过引用以其全部并入本文)、棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237，通过引用以其全部并入本文)或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937，通过引用以其全部并入本文)。
本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子可以进一步包含5′帽。在本文描述的方面的一些实施方式中，修饰的mRNA或RNAi分子包含5′帽，其包含使用5′-5′三磷酸键连接至RNA分子的5′端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。如本文所使用，术语“5′帽”也旨在涵盖其他5′帽类似物，其包括如5′二鸟苷帽、具有亚甲基-双(膦酸酯)部分的四磷酸帽类似物(参见如，Rydzik,A M et al.,(2009)Org Biomol Chem 7(22)：4763-76)、具有硫代磷酸酯修饰的二核苷酸帽类似物(参见如，Kowalska,J.et al.,(2008)RNA 14(6)：1119-1131)、具有用于非桥连氧的硫取代的帽类似物(参见如，Grudzien-Nogalska,E.et al.,(2007)RNA 13(10)：1745-1755)、N7-苄基化二核苷四磷酸类似物(参见如，Grudzien,E.et al.,(2004)RNA 10(9)：1479-1487)或抗-反向帽类似物(参见如，Jemielity,J.et al.,(2003)RNA 9(9)：1108-1122and Stepinski,J.et al.,(2001)RNA 7(10)：1486-1495)。在一个这类实施方式中，5′帽类似物是5′二鸟苷帽。在一些实施方式中，修饰的RNA不包含5′三磷酸。
5′帽对于识别mRNA并将其附接至核糖体以开始翻译是重要的。5′帽还保护修饰的mRNA或RNAi不受5′核酸外切酶介导的降解。修饰的mRNA或RNAi分子包含5′帽不是绝对的需要，并因此在其他实施方式中，修饰的mRNA或RNAi分子缺少5′帽。然而，由于包含5′帽的修饰的mRNA的更长半衰期和增加的翻译效率，本文中包含5′帽的修饰的RNA是优选的。
本文描述的修饰的mRNA分子可以进一步包含5′和/或3′非翻译区(UTR)。非翻译区是在起始密码子(5′)之前和在终止密码子(3′)之后的RNA的区，并且因此不被翻译机器翻译。因为非翻译区可以干扰核糖核酸酶和参与RNA降解的其他蛋白质，因此具有一个或多个非翻译区的RNA分子的修饰可以提高mRNA的稳定性。另外，具有5′和/或3′非翻译区的RNA的修饰可以通过结合改变与mRNA结合的核糖体的蛋白质增强翻译效率。具有3′UTR的RNA的修饰可以被用于保持RNA的胞质定位，允许在细胞的胞质中发生翻译。在一个实施方式中，本文描述的修饰的mRNA不包含5′或3′UTR。在另一个实施方式中，修饰的mRNA包含5′或3′UTR。在另一个实施方式中，本文描述的修饰的mRNA包含5′和3′UTR二者。在一个实施方式中，5′和/或3′UTR选自在细胞中已知具有高稳定性的mRNA(如，鼠α-球蛋白3′UTR)。在一些实施方式中，5′UTR、3′UTR或两者包含一个或多个修饰的核苷。
在一些实施方式中，本文描述的修饰的mRNA进一步包含Kozak序列。“Kozak序列”是指在具有共有(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:92)的真核生物mRNA上的序列，其中R是嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子(AUG)上游的三个碱基，AUG之后是另一个`G`。Kozak共有序列被核糖体识别以启动多肽的翻译。通常，在翻译机器遇到的第一个AUG密码子处启动发生，其在转录物的5′端的近端。然而，在一些情况中，该AUG密码子在称为渗漏扫描的过程中可以被绕过。在AUG密码子附近存在Kozak序列将加强该密码子作为翻译的启动位点，使得发生正确的多肽翻译。此外，向修饰的RNA添加Kozak序列将促进更有效的翻译，即使对于起始密码子没有歧义。因此，在一些实施方式中，本文描述的修饰的RNA在启动翻译的期望位点处进一步包括Kozak共有序列，以产生正确长度多肽。在一些这样的实施方式中，Kozak序列包括一个或多个修饰的核苷。
在一些实施方式中，本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子进一步包括“聚腺苷酸尾”，其是指腺嘌呤核苷酸的3′均聚物尾，其长度可以改变(如，至少5个腺嘌呤核苷酸)并且可以多达数百个腺嘌呤核苷酸)。包括3′聚腺苷酸尾可以保护修饰的RNA免于在细胞内降解，并且还促进核外定位以增强翻译效率。在一些实施方式中，聚腺苷酸尾包含1和500个之间的腺嘌呤核苷酸；在其他实施方式中，聚腺苷酸尾包含至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个腺嘌呤核苷酸或更多。在一个实施方式中，聚腺苷酸尾包含1和150个之间的腺嘌呤核苷酸。在另一个实施方式中，聚腺苷酸尾包含90和120个之间的腺嘌呤核苷酸。在一些这样的实施方式中，聚腺苷酸尾包含一个或多个修饰的核苷。
预期本文描述的修饰的mRNA和/或RNAi分子的一种或多种修饰允许修饰的RNA分子在细胞中具有更大的稳定性。在某种程度上，这样的修饰允许翻译和/或降低或不加重对具有该修饰的修饰的RNA的细胞先天免疫或干扰素应答，此类修饰被特别考虑用于本文。通常，修饰的mRNA的稳定性越大，则可以从该修饰的mRNA产生的蛋白质越多。通常，当将细胞蛋白质招募到富AU区以刺激转录物的聚腺苷酸尾的去除时，哺乳动物mRNA中富AU区的存在倾向于去稳定转录物。修饰的RNA的聚腺苷酸尾的丢失可导致RNA降解增加。因此，在一个实施方式中，如本文描述的修饰的RNA不包含富AU区。在一些实施方式中，3'UTR基本上缺乏AUUUA序列元件。
包含细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒
在一些方面，本发明提供包含细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，用于将一种或多种mrNA递送至细胞内。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA中的至少一种非共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA中的每一种非共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA中的至少一种共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA中的每一种共价地复合。在一些实施方式中，mRNA编码蛋白质，诸如治疗性蛋白。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一种修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒进一步包含RNAi，或与RNAi组合施用(如，与包含细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒组合施用，用于将RNAi递送至细胞内)。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因，如，疾病相关内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含编码第一蛋白质的第一mRNA，和编码第二蛋白质的第二mRNA。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含靶向第一内源性基因的第一RNAi(如，siRNA)，和靶向第二内源性基因的第二RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含编码蛋白质(诸如治疗性蛋白)的mRNA和靶向内源型基因的RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi。在一些实施方式中，治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)。
在一些方面，本发明提供了包含细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，其用于将一种或多种RNAi(如，siRNA)递送至细胞内。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi(如，siRNA)复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi(如，siRNA)中的至少一种非共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi(如，siRNA)中的每一种非共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi(如，siRNA)中的至少一种共价地复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi(如，siRNA)中的每一种共价地复合。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向内源性基因。在一些实施方式中，内源性基因参与疾病或病症。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含靶向第一内源性基因的第一RNAi(如，siRNA)，和靶向第二内源性基因的第二RNAi(如，siRNA)。
细胞穿透肽
本发明的mRNA递送复合物或纳米颗粒中的细胞穿透肽能够与各种mRNA形成稳定的复合物和纳米颗粒。本文描述的任意mRNA递送复合物或纳米颗粒中的任意细胞穿透肽可包含该节中描述的任意细胞穿透肽序列或由其组成。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包括选自以下的细胞穿透肽：CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核中存在的mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核中并与mRNA缔合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。WO2014/053879公开了VEPEP-3肽；WO2014/053881公开了VEPEP-4肽；WO2014/053882公开了VEPEP-5肽；WO2012/137150公开了VEPEP-6肽；WO2014/053880公开了VEPEP-9肽；WO 2016/102687公开了ADGN-100肽；US2010/0099626公开了CADY肽；和美国专利号7,514,530公开了MPG肽；其公开内容通过引用以其全部并入本文。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包含VEPEP-3细胞穿透肽，其包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X2X3X4X6X7X3X8X9X10X11X12X13(SEQ ID NO:1)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L(彼此独立)，X3是F或W(彼此独立)，X4是F、W或Y(彼此独立)，X5是E、R或S，X6是R、T或S，X7是E、R或S，X8是空、F或W，X9是P或R，X10是R或L，X11是K、W或R，X12是R或F，和X13是R或K。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1X2WX4EX2WX4X6X7X3PRX11RX13(SEQ IDNO:2)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L，X3是F或W，X4是F、W或Y，X5是E、R或S，X6是R、T或S，X7是E、R或S，X8是空、F或W，X9是P或R，X10是R或L，X11是K、W或R，X12是R或F，和X13是R或K。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1KWFERWFREWPRKRR(SEQ ID NO:3)、X1KWWERWWREWPRKRR(SEQ ID NO:4)、X1KWWERWWREWPRKRK(SEQ ID NO:5)、X1RWWEKWWTRWPRKRK(SEQ ID NO:6)或X1RWYEKWYTEFPRRRR(SEQ ID NO:7)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-7中的任一个的氨基酸序列，其中细胞穿透肽通过将10位的氨基酸替换为非天然氨基酸，在2位和3位的氨基酸之间添加非天然氨基酸和在两个非天然氨基酸之间添加烃键进行修饰。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1KX14WWERWWRX14WPRKRK(SEQ ID NO:8)，其中X1是β-A或S和X14是非天然氨基酸，和其中在两个非天然氨基酸之间存在烃键。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1X2X3WX5X10X3WX6X7WX8X9X10WX12R(SEQ ID NO:9)，其中X1是β-A或S，X2是K、R或L，X3是F或W，X5是R或S，X6是R或S，X7是R或S，X8是F或W，X9是R或P，X10是L或R，和X12是R或F。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1RWWRLWWRSWFRLWRR(SEQ ID NO:10)、X1LWWRRWWSRWWPRWRR(SEQID NO:11)、X1LWWSRWWRSWFRLWFR(SEQ ID NO:12)或X1KFWSRFWRSWFRLWRR(SEQ ID NO:13)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1和9-13中的任一个的氨基酸序列，其中细胞穿透肽通过将5位和12位的氨基酸替换为非天然氨基酸，和在两个非天然氨基酸之间添加烃键进行修饰。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含氨基酸序列X1RWWX14LWWRSWX14RLWRR(SEQ ID NO:14)，其中X1是β-丙氨酸或丝氨酸，并且X14是非天然氨基酸，和其中在两个非天然氨基酸之间存在烃键。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒核的mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的核中并且与mRNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-3肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包含VEPEP-6细胞穿透肽。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含选自以下的氨基酸序列：X1LX2RALWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ ID NO:15)、X1LX2LARWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ IDNO:16)和X1LX2ARLWX9LX3X9X4LWX9LX5X6X7X8(SEQ ID NO:17)，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L、W、C或I，X4是S、A、N或T，X5是L或W，X6是W或R，X7是K或R，X8是A或空，和X9是R或S。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含氨基酸序列X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6X7X8(SEQ ID NO:18)，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L、W、C或I，X4是S、A、N或T，X5是L或W，X6是W或R，X7是K或R，和X8是A或空。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含氨基酸序列X1LX2RALWRLX3RX4LWRLX5X6KX7(SEQ IDNO:19)，其中X1是β-A或S，X2是F或W，X3是L或W，X4是S、A或N，X5是L或W，X6是W或R，X7是A或空。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含选自以下的氨基酸序列：X1LFRALWRLLRX2LWRLLWX3(SEQID NO:20)、X1LWRALWRLWRX2LWRLLWX3A(SEQIDNO:21)、X1LWRALWRLX4RX2LWRLWRX3A(SEQIDNO:22)、X1LWRALWRLWRX2LWRLWRX3A(SEQIDNO:23)、X1LWRALWRLX5RALWRLLWX3A(SEQIDNO:24)和X1LWRALWRLX4RNLWRLLWX3A(SEQIDNO:25)，其中X1是β-A或S，X2是S或T，X3是K或R，X4是L、C或I，和X5是L或I。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含选自以下的氨基酸序列：Ac-X1LFRALWRLLRSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:26)、Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO:27)、Ac-X1LWRALWRLLRSLWRLWRKA-半胱酰胺(SEQ ID NO:28)、Ac-X1LWRALWRLWRSLWRLWRKA-半胱酰胺(SEQ ID NO:29)、Ac-X1LWRALWRLLRALWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO:30)和Ac-X1LWRALWRLLRNLWRLLWKA-半胱酰胺(SEQ ID NO:31)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-31中的任一个的氨基酸序列，其进一步包含8位和12位处两个残基之间的烃键。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含选自以下的氨基酸序列：Ac-X1LFRALWRSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:32)、Ac-X1LFLARWRSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:33)、Ac-X1LFRALWSSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:34)、Ac-X1LFLARWSSLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:35)、Ac-X1LFRALWRLLRSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:36)、Ac-X1LFLARWRLLRSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:37)、Ac-X1LFRALWRLLSSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:38)、Ac-X1LFLARWRLLSSSLWSSLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:39)和Ac-X1LFARSLWRLLRSSLWRLLWK-半胱酰胺(SEQ ID NO:40)，其中X1是β-A或S，并且其中后面跟随下标符号“S”的残基是通过所述烃键连接的那些。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒核的mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的核中并与mRNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-6肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包含VEPEP-9细胞穿透肽，其包含氨基酸序列X1X2X3WWX4X5WAX6X3X7X8X9X10X11X12WX13R(SEQ ID NO:41)，其中X1是β-A或S，X2是L或空，X3是R或空，X4是L、R或G，X5是R、W或S，X6是S、P或T，X7是W或P，X8是F、A或R，X9是S、L、P或R，X10是R或S，X11是W或空，X12是A、R或空，和X13是W或F，和其中如果X3是空，那么X2、X11和X12也是空。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含氨基酸序列X1X2RWWLRWAX6RWX8X9X10WX12WX13R(SEQ ID NO:42)，其中X1是β-A或S，X2是L或空，X6是S或P，X8是F或A，X9是S、L或P，X10是R或S，X12是A或R，和X13是W或F。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含选自以下的氨基酸序列：X1LRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:43)、X1LRWWLRWASRWASRWAWFR(SEQ ID NO:44)、X1RWWLRWASRWALSWRWWR(SEQ ID NO:45)、X1RWWLRWASRWFLSWRWWR(SEQ ID NO:46)、X1RWWLRWAPRWFPSWRWWR(SEQ ID NO:47)和X1RWWLRWASRWAPSWRWWR(SEQ ID NO:48)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含X1WWX4X5WAX6X7X8RX10WWR(SEQ ID NO:49)的氨基酸序列，其中X1是β-A或S，X4是R或G，X5是W或S，X6是S、T或P，X7是W或P，X8是A或R，和X10是S或R。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含选自以下的氨基酸序列：X1WWRWWASWARSWWR(SEQ ID NO:50)、X1WWGSWATPRRRWWR(SEQ ID NO:51)和X1WWRWWAPWARSWWR(SEQ ID NO:52)，其中X1是β-A或S。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒核的mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的核中并与mRNA缔合。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，VEPEP-9肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包括ADGN-100细胞穿透肽，其包含氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:53)，其中X1是任意氨基酸或空，和X2-X8是任意氨基酸。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含氨基酸序列X1KWRSX2X3X4RWRLWRX5X6X7X8SR(SEQ ID NO:54)，其中X1是βA、S或空，X2是A或V，X3是或L，X4是W或Y，X5是V或S，X6是R、V或A，X7是S或L，和X8是W或Y。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含氨基酸序列KWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:55)、KWRSALYRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:56)、KWRSALYRWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:57)或KWRSALYRWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:58)。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含由通过烃键连接的三个或六个残基分开的两个残基。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含氨基酸序列KWRSSAGWRSWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:59)、KWRSSAGWRWRSLWRVRSWSR(SEQ ID NO:60)、KWRSAGWRSWRLWRVRSSWSR(SEQ ID NO:61)、KWRSSALYRSWRLWRSRSWSR(SEQ ID NO:62)、KWRSSALYRWRSLWRSRSWSR(SEQ ID NO:63)、KWRSALYRSWRLWRSRSSWSR(SEQ ID NO:64)、KWRSALYRWRSLWRSSRSWSR(SEQ ID NO:65)、KWRSALYRWRLWRSSRSWSSR(SEQ ID NO:66)、KWRSSALYRWRSLWRSALYSR(SEQ ID NO:67)、KWRSSALYRSWRLWRSALYSR(SEQ ID NO:68)、KWRSALYRWRSLWRSSALYSR(SEQ ID NO:69)或KWRSALYRWRLWRSSALYSSR(SEQ ID NO:70)，其中以下标“S”标记的残基通过烃键连接。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒核的mRNA递送复合物中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的核中并与mRNA缔合。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，ADGN-100肽存在于纳米颗粒的表面层中。在一些实施方式中，ADGN-100肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽)进一步包含连接至CPP的N-末端的一个或多个部分。在一些实施方式中，该一个或多个部分共价连接至CPP的N-末端。在一些实施方式中，该一个或多个部分选自乙酰基基团、硬脂基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，该一个或多个部分是乙酰基基团和/或硬脂基。在一些实施方式中，CPP包含连接至其N-末端的乙酰基基团和/或硬脂基。在一些实施方式中，CPP包含连接至其N-末端的乙酰基基团。在一些实施方式中，CPP包含连接至其N-末端的硬脂基。在一些实施方式中，CPP包含共价连接至其N-末端的乙酰基基团和/或硬脂基。在一些实施方式中，CPP包含共价连接至其N-末端的乙酰基基团。在一些实施方式中，CPP包含共价连接至其N-末端的硬脂基。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽)进一步包含连接至CPP的C-末端的一个或多个部分。在一些实施方式中，该一个或多个部分共价连接至CPP的C-末端。在一些实施方式中，该一个或多个部分选自半胱酰胺基团、半胱氨酸、硫醇、酰胺、次氮基三乙酸、羧基基团、直链或分支C1-C6烷基基团、伯或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，该一个或多个部分是半胱酰胺基团。在一些实施方式中，CPP包含连接至其C-末端的半胱酰胺基团。在一些实施方式中，CPP包含共价连接至其C-末端的半胱酰胺基团。
在一些实施方式中，本文描述的CPP(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽)为“订书型(stapled)”。本文使用的“订书型”指肽中两个残基之间的化学键。在一些实施方式中，CPP是订书型，包含肽的两个氨基酸之间的化学键。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸被3或6个氨基酸分开。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸被3个氨基酸分开。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸被6个氨基酸分开。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸中的每个是R或S。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸中的每个是R。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸中的每个是S。在一些实施方式中，通过化学键连接的两个氨基酸中的一个是R，和另一个是S。在一些实施方式中，化学键是烃键。
包含细胞穿透肽的复合物
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与一种或多种mRNA缔合的细胞穿透肽(如，a PEP-1、PEP-2、VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9或ADGN-100肽)。在一些实施方式中，缔合是非共价的。在一些实施方式中，缔合是共价的。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物中的至少一些细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种mRNA中至少一种的摩尔比在约1：1和约100：1之间，或约1：1和约50：1之间，或约20：1。在一些实施方式中，CPP包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包括编码治疗性蛋白的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白与肿瘤-阻抑基因对应。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL。在一些实施方式中，肿瘤阻抑基因选自PB1、TSC1、TSC2、BRCA1、BRCA2、PTEN和TP53。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白PTEN的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白PTEN通过人PTEN序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC005821、JF268690、U92436、CR450306、AK024986、AK313581、U96180、和U93051和NM_000314。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白p53的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白p53通过人TP53序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：AF052180、NM_000546、AY429684、BT019622、AK223026、DQ186652、DQ186651、DQ186650、DQ186649、DQ186648、DQ263704、DQ286964、DQ191317、DQ401704、AF307851、AM076972、AM076971、AM076970、DQ485152、BC003596、DQ648887、DQ648886、DQ648885、DQ648884、AK225838、M14694、M14695、EF101869、EF101868、EF101867、X01405、AK312568、NM_001126117、NM_001126116、NM_001126115、NM_001126114、NM_001126113、NM_001126112、FJ207420、X60020、X60019、X60018、X60017、X60016、X60015、X60014、X60013、X60011、X60012、X60010、X02469、S66666、AB082923、NM_001126118、JN900492、NM_001276699、NM_001276698、NM_001276697、NM_001276761、NM_001276760、NM_001276696和NM_001276695。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白BRCA1的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA1通过人BRCA1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_007294、NM_007297、NM_007298、NM_007304、NM_007299、NM_007300、BC046142、BC062429、BC072418、AY354539、AY751490、BC085615、BC106746、BC106745、BC114511、BC115037、U14680、AK293762、U68041、BC030969、BC012577、AK316200、DQ363751、DQ333387、DQ333386、Y08864、JN686490、AB621825、BC038947、U64805和AF005068。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白BRCA2的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA2通过人BRCA2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC047568、NM_000059、DQ897648、BC026160。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白TSC1的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC1通过人TSC1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC047772、NM_000368、BC070032、AB190910、BC108668、BC121000、NM_001162427、NM_001162426、D87683和AF013168。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白TSC2的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC2通过人TSC2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC046929、BX647816、AK125096、NM_000548、AB210000、NM_001077183、BC150300、BC025364、NM_001114382、AK094152、AK299343、AK295728、AK295672、AK294548和X75621。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白视网膜母细胞瘤1(RB1)的mRNA。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白RB1通过人RB1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，其选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_000321、AY429568、AB208788、M19701、AK291258、L41870、AK307730、AK307125、AK300284、AK299179、M33647、M15400、M28419、BC039060、BC040540和AF043224。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物包含编码治疗性蛋白的mRNA，其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送RNAi(如，siRNA)的RNAi(如，siRNA)递送复合物，其包含与一种或多种RNAi(如，siRNA)缔合的细胞穿透肽(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9或ADGN-100肽)。在一些实施方式中，缔合是非共价的。在一些实施方式中，缔合是共价的。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物中至少一些细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种RNAi中至少一种的摩尔比为约1：1和约100：1之间，或约1：1和约50：1之间，或约20：1。在一些实施方式中，CPP包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物包含靶向内源性基因的RNAi(诸如siRNA)。在一些实施方式中，内源性基因参与疾病或病症。在一些实施方式中，治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物包含靶向KRAS的RNAi(诸如siRNA)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向KRAS的突变体形式。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)特异性地靶向KRAS的突变体形式但不靶向KRAS的野生型形式。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物包含靶向KRAS的多个突变体形式的RNAi(诸如siRNA)。在一些实施方式中，该多个突变体形式包含KRAS的多个畸变，其中KRAS的多个畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，KRAS的多个畸变包含KRAS的密码子12和61上至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物包含含有第一RNAi(如，第一siRNA)和第二RNAi(如，第二siRNA)的多个RNAi(如，siRNA)，其中第一RNAi靶向KRAS的第一突变体形式，和其中第二RNAi靶向KRAS的第二突变体形式。在一些实施方式中，第一RNAi和/或第二RNAi不靶向KRAS的野生型形式。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有密码子12上的突变的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有密码子61上的突变的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRASG12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变，和第二突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。
在一些实施方式中，RNAi递送复合物包含含有第一RNAi(如，第一siRNA)、第二RNAi(如，第二siRNA)和第三RNAi(如，siRNA)的多个RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，第一RNAi靶向KRAS的第一突变体形式，第二RNAi靶向KRAS的第二突变体形式，和第三RNAi靶向KRAS的第三突变体形式。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含含有KRAS的密码子12、13、17、34和/或61上的突变的KRAS畸变。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS畸变：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS畸变：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS畸变：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS畸变：KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS畸变：KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D和Q61K。在一些实施方式中，第一、第二和第三KRAS突变体形式每个包含选自如下的KRAS：G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，第一突变体形式包含含有KRAS G12C的KRAS畸变，第二突变体形式包含含有KRAS G12D的KRAS畸变，和第三突变体形式包含含有KRAS Q61K的KRAS畸变。
在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向含有如下序列的KRAS的RNAi(如，siRNA)：5’-GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:83)、5’-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3(反义)(SEQ ID NO:84)、5’-GAAGUGCAUACACCGAGACTT-3’(有义)(SEQ ID NO:86)、5’-GUCUCGGUGUAGCACUUCTT-3’(反义)(SEQ ID NO:87)、5’-GUUGGAGCUGUUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:88)和/或5'-CUACGCCAACAGCUCCAACTT-3’(反义)(SEQ ID NO:89)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向KRAS的RNAi(如，siRNA)，该KRAS包含选自具有SEQ ID NO:83,84,86-89的序列的核酸序列。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含靶向KRAS的RNAi(如，siRNA)，该KRAS包括靶向KRAS G12S的序列，诸如Acunzo,M.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2017May 23；114(21)：E4203-E4212中公开的siRNA序列。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含在如下专利或专利申请中公开的靶向KRAS的RNAi(如，siRNA)：WO2014013995、JP2013212052、WO2014118817、WO2012129352、WO2017179660、JP2013544505、US8008474、US7745611、US7576197、US7507811，其中每篇完全并入本申请。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物进一步包含RNAi(诸如siRNA)，或将与上面描述的RNAi组合施用。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含编码第一蛋白质的第一mRNA，和编码第二蛋白质的第二mRNA。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒进一步包含靶向第一内源性基因的第一RNAi(如，siRNA)和靶向第二内源性基因的第二RNAi(如，siRNA)，或将与第一和第二RNAi组合施用。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒进一步包含靶向癌基因的第一突变体形式的第一RNAi(如，siRNA)和靶向癌基因的第二突变体形式的第二RNAi(如，siRNA)，或将与第一和第二RNAi组合施用。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含编码蛋白质(如治疗性蛋白)的mRNA和靶向内源性基因的RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi。在一些实施方式中，治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)。在一些实施方式中，复合物和/或纳米颗粒包含mRNA和RNAi，其中mRNA和RNAi都可用于治疗相同疾病或病症。在一些实施方式中，mRNA单独和/或RNAi单独对治疗疾病或病症是无效的，但是当组合使用时对治疗疾病或病症是有效的。在一些实施方式中，mRNA编码参与癌症的肿瘤阻抑蛋白，和RNAi靶向参与癌症的癌基因。
CPP可使用化学缀合共价地缔合至mRNA。例如，CPP可通过包括C-末端半胱酰胺/半胱氨酸或N-末端β-丙氨酸桥的交联与mRNA连接。mRNA也可以使用本领域已知的任何技术与肽链内的各个部分共价连接，出于这样的目的，其包括例如化学品，诸如6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。
在一些实施方式中，提供了是用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ IDNO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA递送复合物进一步包含RNAi，或将与RNAi组合施用。
在一些实施方式中，提供了包含细胞穿透肽和多个mRNA的mRNA递送复合物，其中多个mRNA中的每个编码不同的蛋白质，和其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA递送复合物进一步包含RNAi，或将与RNAi组合施用。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码对应肿瘤阻抑基因的肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、CDKN2A(INK4A)、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2或ST14。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码蛋白质，和其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ IDNO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码蛋白质，和其中个体中的蛋白质表达调谐对个体中蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关抗原(如，肿瘤-相关抗原)，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关蛋白质，如肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFPmRNA(5moU)或CleanCap Cyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含LucmRNA，例如，CleanCap Fluc mRNA、CleanCap Fluc mRNA(5moU)、CleanCap Cyanine 5FlucmRNA(5moU)、CleanCap Gaussia Luc mRNA(5moU)或CleanCap Renilla Luc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自CleanCap β-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)的mRNA。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码与肿瘤阻抑基因对应的肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、CDKN2A(INK4A)、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2或ST14。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码蛋白质，其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码蛋白质，其中个体中的蛋白质表达调谐对个体中蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关抗原(如，肿瘤-相关抗原)，和个体中的抗原表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，和个体中的抗原表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关抗原，诸如肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFP mRNA(5moU)或CleanCapCyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含Luc mRNA，例如，CleanCap FlucmRNA、CleanCap Fluc mRNA(5moU)、CleanCap Cyanine 5Fluc mRNA(5moU)、CleanCapGaussia Luc mRNA(5moU)或CleanCap Renilla Luc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自CleanCap β-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)的mRNA。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物进一步包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi包含siRNA。在一些实施方式中，RNAi包含微小RNA。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因。在一些实施方式中，癌基因是Smoothened。在一些实施方式中，癌基因是rasK。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物用于与RNAi组合施用。在一些实施方式中，RNAi在用于将RNAi递送至细胞内的包含细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒中。在一些实施方式中，RNAi包含siRNA。在一些实施方式中，RNAi包含微小RNA。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因。在一些实施方式中，癌基因是Smoothened。在一些实施方式中，癌基因是rasK。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物的平均大小(直径)在约20nm和约10微米中任意之间，包括例如约30nm和约1微米之间，约50nm和约750nm之间，约100nm和约500nm之间，100nm和250nm之间，和约200nm和约400nm之间。在一些实施方式中，mRNA递送复合物是基本上无毒的。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物的靶向部分将mRNA递送复合物靶向至组织或特定细胞类型。在一些实施方式中，组织是需要治疗的组织。在一些实施方式中，靶向部分将mRNA递送复合物靶向至可被mRNA治疗的组织或细胞。
包含细胞穿透肽的纳米颗粒
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的纳米颗粒，其包含含有本文描述的一种或多种mRNA递送复合物的核。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含多种mRNA递送复合物。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含以预定比存在的多种mRNA递送复合物。在一些实施方式中，选择预定比以允许最有效地使用在下面更详细描述的任意方法中的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒核进一步包含一种或多种另外的细胞穿透肽和/或一种或多种另外的mRNA。在一些实施方式中，纳米颗粒核进一步包含与一种或多种另外的mRNA缔合(诸如共价地或非共价地)的一种或多种另外的细胞穿透肽。在一些实施方式中，一种或多种另外的细胞穿透肽包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。在一些实施方式中，一种或多种另外的细胞穿透肽中的至少一些与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的纳米颗粒，其包含含有与mRNA缔合的一种或多种细胞穿透肽(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9或ADGN-100肽)的核。在一些实施方式中，缔合是非共价的。在一些实施方式中，缔合是共价的。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含编码蛋白质(诸如治疗性蛋白)的mRNA。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白，其中蛋白质与肿瘤阻抑基因对应。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、CDKN2A(INK4A)、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2或ST14.
在一些实施方式中，纳米颗粒包含mRNA，其中mRNA编码蛋白质，其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含mRNA，其中根据本文描述的任意实施方式的mRNA递送复合物中含有的mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFP mRNA(5moU)或CleanCap Cyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含Luc mRNA，例如，CleanCap Fluc mRNA、CleanCapFluc mRNA(5moU)、CleanCap Cyanine 5Fluc mRNA(5moU)、CleanCap GaussiaLuc mRNA(5moU)或CleanCap Renilla Luc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自CleanCapβ-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)的mRNA。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码与肿瘤阻抑基因对应的肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、CDKN2A(INK4A)、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2或ST14。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码蛋白质，和其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ IDNO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码蛋白质，和其中个体中的蛋白质表达调谐对个体中蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，所述细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关抗原(如，肿瘤-相关抗原)，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ IDNO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关抗原，诸如肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列(或由其组成)。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFPmRNA(5moU)或CleanCap Cyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含LucmRNA，例如，CleanCap Fluc mRNA、CleanCap Fluc mRNA(5moU)、CleanCap Cyanine 5FlucmRNA(5moU)、CleanCap Gaussia Luc mRNA(5moU)或CleanCap Renilla Luc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自CleanCap β-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)的mRNA。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码与肿瘤阻抑基因对应的肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白质(pRb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、CDKN2A(INK4A)、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2或ST14。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码蛋白质，其中蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子VIII。在一些实施方式中，蛋白质是因子IX。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码蛋白质，其中个体中蛋白质的表达调谐对个体中蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关抗原(如，肿瘤-相关抗原)，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，诸如双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关抗原，诸如肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送纳米颗粒，其包含与mRNA缔合的细胞穿透肽，其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列，和其中mRNA包含报告mRNA。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA包含EGFP mRNA，例如，CleanCap EGFP mRNA、CleanCap EGFP mRNA(5moU)或CleanCapCyanine 5EGFP mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含Luc mRNA，例如，CleanCap FlucmRNA、CleanCap Fluc mRNA(5moU)、CleanCap Cyanine 5Fluc mRNA(5moU)、CleanCapGaussia Luc mRNA(5moU)或CleanCap Renilla Luc mRNA(5moU)。在一些实施方式中，mRNA包含选自CleanCap β-gal mRNA、CleanCap β-gal mRNA(5moU)和CleanCap mCherry mRNA(5moU)的mRNA。
在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包含RNAi，诸如靶向内源性基因(如，疾病相关内源性基因)的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，RNAi包含siRNA。在一些实施方式中，RNAi包含微小RNA。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因。在一些实施方式中，癌基因是Smoothened。在一些实施方式中，癌基因是rasK。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含编码第一蛋白质的mRNA和靶向第二蛋白质的RNAi。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi，和蛋白质是可用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，治疗性RNAi靶向内源性基因(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)的疾病相关形式。在一些实施方式中，mRNA与内源性基因的治疗形式对应(如，mRNA编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或mRNA导致蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了包含核的纳米颗粒，该核包含一种或多种细胞穿透肽(如，PEP-1、PEP-2、VEPEP-3、VEPEP-6、VEPEP-9、或ADGN-100肽)和多种mRNA，其中多种mRNA中每种编码不同的蛋白质。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含与多种mRNA中至少一种缔合的一种或多种细胞穿透肽中的一种。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含a)包含与多种mRNA中至少一种缔合的一种或多种细胞穿透肽中的一种的第一复合物，和b)包含与剩余mRNA缔合的剩余细胞穿透肽的一种或多种另外的复合物。在一些实施方式中，纳米颗粒中一种或多种细胞穿透肽中的至少一些与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。在一些实施方式中，在纳米颗粒中存在的复合物中细胞穿透肽和与细胞穿透肽缔合的mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间，或约1：1和约50：1之间，或约20：1。在一些实施方式中，一种或多种mRNA中一种编码治疗性蛋白，即，肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，一种或多种细胞穿透肽包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。
在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的纳米颗粒，其包含含有细胞穿透肽和mRNA的核，其中细胞穿透肽与mRNA缔合，和其中细胞穿透肽包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-1肽包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-2肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方式中，PEP-3肽包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包含表面层，其包含包围核的周围CPP。在一些实施方式中，周围CPP与核中的CPP相同。在一些实施方式中，周围CPP与核中的任意CPP不同。在一些实施方式中，周围CPP包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。在一些实施方式中，周围CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。在一些实施方式中，表面层中至少一些周围细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包含纳米颗粒的核与表面层之间的中间层。在一些实施方式中，中间层包含中间CPP。在一些实施方式中，中间CPP与核中的CPP相同。在一些实施方式中，中间CPP与核中的任意CPP不同。在一些实施方式中，中间CPP包括但不限于基于PTD的肽、两亲性的肽、基于聚精氨酸的肽、MPG肽、CADY肽、VEPEP肽(诸如VEPEP-3、VEPEP-6或VEPEP-9肽)、ADGN-100肽、Pep-1肽和Pep-2肽。在一些实施方式中，中间CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意纳米颗粒，纳米颗粒的平均大小(直径)为约20nm至约1000nm，包括例如约50nm至约800nm，约75nm至约600nm，约100nm至约600nm，和约200nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均大小(直径)不大于约1000纳米(nm)，诸如不大于约900、800、700、600、500、400、300、200或100nm中的任一个约。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约20nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约30nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约40nm至约300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约50nm至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约60nm至约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约70nm至约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是无菌可过滤的。
在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电势为约-30mV至约60mV(诸如约-30、-25、-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60mV中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电势为约-30mV至约30mV，包括例如约-25mV至约25mV、约-20mV至约20mV、约-15mV至约15mV、约-10mV至约10mV和约-5mV至约10mV。在一些实施方式中，纳米颗粒的多分散指数(PI)为约0.05至约0.6(诸如约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55和0.6中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒是基本上无毒的。
修饰
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包括靶向部分，其中靶向部分是能够细胞-特异性靶向和/或细胞核靶向的配体。细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物是可以以高亲和力和优选地以高特异性结合所述配体的分子或结构。所述细胞膜表面受体和/或细胞表面标志物优选地特异于特定的细胞，即它主要在一种类型的细胞而不是另一种类型的细胞中被发现(例如，半乳糖残基靶向肝细胞表面上的脱唾液酸糖蛋白受体)。细胞膜表面受体促进细胞靶向和将配体(例如靶向部分)与附加的分子(例如本发明的复合物或纳米颗粒)内化入靶细胞。在文献中广泛地描述了可以在本发明的背景中使用的大量配体部分/配体结合配偶体。这样的配体部分能够给本发明的复合物或纳米颗粒赋予结合至在至少一种靶细胞的表面处定位的给定的结合配偶体分子或一类结合配偶体分子的能力。合适的结合配偶体分子非限制性地包括多肽，其选自细胞-特异性标志物、组织-特异性标志物、细胞受体、病毒抗原、抗原表位和肿瘤相关标志物。而且，结合配偶体分子可以由例如，一种或多种糖、脂质、糖脂、抗体分子或其片段、或适配体组成，或包括这些成分。根据本发明，配体部分可以是例如脂质、糖脂、激素、糖、聚合物(例如PEG、聚赖氨酸、PET)、寡核苷酸、维生素、抗原、凝集素的全部或部分、多肽——比如例如JTS1(WO 94/40958)——的全部或部分、抗体或其片段、或其组合。在一些实施方式中，在本发明中使用的配体部分是具有最小长度为7个氨基酸的肽或多肽。它是天然多肽或衍生自天然多肽的多肽。“衍生的”意思是包含(a)关于天然序列的一种或多种修饰(例如一个或多个残基的添加、缺失和/或置换)，(b)氨基酸类似物，其包括非天然存在的氨基酸，(c)置换的键，或(d)本领域已知的其它修饰。充当配体部分的多肽涵盖变体和通过融合多种起源的序列获得的嵌合多肽，比如例如人源化抗体，其组合小鼠抗体的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。此外，这样的多肽可以具有线性或环化结构(例如通过在两端处利用半胱氨酸残基使多肽配体侧接)。另外，通过置换或添加化学部分(例如糖基化、烷基化、乙酰化、酰胺化、磷酸化、添加巯基等)，用作配体部分的多肽可以包括其原始结构的修饰。本发明进一步考虑致使配体部分可检测的修饰。出于此目的，可以设计具有可检测的部分的修饰(即闪烁照相、放射或荧光部分、或染料标记等)。这样的可检测的标记可以通过任何常规技术附加至配体部分并且可以用于诊断目的(例如肿瘤细胞的成像)。在一些实施方式中，结合配偶体分子是抗原(例如靶细胞-特异性抗原、疾病-特异性抗原、在工程化靶细胞的表面上特异性表达的抗原)并且配体部分是抗体、其片段或最小识别单位(例如仍呈递抗原特异性的片段)，比如在免疫学手册(参见例如Immunology,第三版1993,Roitt,Brostoff and Male,ed Gambli,Mosby)中详细描述的那些。配体部分可以是单克隆抗体。结合许多这些抗原的许多单克隆抗体是已知的，并且使用与单克隆抗体技术有关的本领域已知的技术，可以制备大部分抗原的抗体。配体部分可以是抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如，ScFv)。在一些实施方式中，配体部分选自抗体片段，而不是完整抗体。完整抗体的有效功能比如补体结合被去除。ScFv和dAb抗体片段可以表达为与一种或多种其它多肽的融合。最小识别单位可以源自Fv片段的互补决定区(CDR)中的一个或多个的序列。完整抗体和F(ab')2片段是“二价的”。“二价的”的意思是所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv、dAb片段和最小识别单位是单价的，其仅具有一个抗原结合位点。在一些实施方式中，配体部分允许靶向至肿瘤细胞并且能够识别和结合至与肿瘤状态相关的分子，比如肿瘤-特异性抗原、在肿瘤细胞中差异表达或过表达的细胞蛋白质或癌症相关波形蛋白质(vim)的基因产物。肿瘤-特异性抗原的实例包括但不限于与乳腺癌相关的MUC-1(Hareuveni et al.,990,Eur.J.Biochem 189,475-486)、与乳腺癌和卵巢癌相关的由突变的BRCAl和BRCA2基因编码的产物(Miki et al,1994,Science 226,66-7 1；Fuireal et al,1994,Science 226,120-122；Wooster et al.,1995,Nature 378,789-792)、与癌症相关的APC(Poiakis,1995,Curr.Opin.Genet.Dev.5,66-71)、与前列腺癌相关的前列腺特异性抗原(PSA)(Stamey etal.,1987,New England J.Med.317,909)、与癌症相关的癌胚抗原(CEA)(Schrewe et al.,1990,Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)、与黑素瘤相关的酪胺酶(Vile et al,1993,CancerRes.53,3860-3864)、在黑素瘤细胞中高度表达的促黑素细胞激素(MSH)的受体、与乳腺癌和胰腺癌相关的ErbB-2(Harris et al.,1994,Gene Therapy 1,170-175)和与肝癌相关的甲胎蛋白(Kanai et al.,1997,Cancer Res.57,46 1-465)。在一些实施方式中，配体部分是能够识别和结合至MUC-1抗原并且因而靶向MUC-1阳性肿瘤细胞的抗体的片段。在一些实施方式中，配体部分是识别MUC-1抗原的串联重复区的SM3单克隆抗体的scFv片段(Burshell et al.,1987,Cancer Res.47,5476-5482；Girling et al.,1989,Int.J.Cancer 43,1072-1076；Dokurno et al.,1998,J.Mol.Biol.284,713-728)。在肿瘤细胞中差异表达或过表达的细胞蛋白质的实例包括但不限于在一些淋巴肿瘤中过表达的白介素2(IL-2)的受体，在肺癌细胞、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤和胃肿瘤中过表达的GRP(胃泌素释放肽)(Michael et al.,1995,Gene Therapy 2,660-668)，TNF(肿瘤坏死因子)受体，表皮生长因子受体，Fas受体，CD40受体，CD30受体，CD27受体，OX-40，α-v整合素(Brooks etal,994,Science 264,569)和某些血管生成生长因子的受体(Hanahan,1997,Science 277,48)。基于这些指示，限定能够识别和结合至这样的蛋白质的适当的配体部分在本领域技术人员的范围内。为了说明，IL-2是结合至TL-2受体的合适的配体部分。在特异于纤维化和炎症的受体的情况下，这些包括在上面确认的并且是用于本发明组合物的合适靶标的TGFβ受体或腺苷受体。多发性骨髓瘤的细胞表面标志物包括但不限于CD56、CD40、FGFR3、CS1、CD138、IGF1R、VEGFR和CD38，并且是用于本发明组合物的合适靶标。结合至这些细胞表面标志物的合适配体部分包括但不限于抗-CD56、抗-CD40、PRO-001、Chir-258、HuLuc63、抗-CD138-DM1、抗-IGF1R和贝伐单抗(bevacizumab)。
mRNA或RNAi组合物
在一些实施方式中，提供了包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物(如，药物组合物)。在一些实施方式中，组合物是包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的药物组合物。在一些实施方式中，组合物中复合物或纳米颗粒的浓度为约1nM至约100mM，包括例如约10nM至约50mM、约25nM至约25mM、约50nM至约10mM、约100nM至约1mM、约500nM至约750μM、约750nM至约500μM、约1μM至约250μM、约10μM至约200μM、和约50μM至约150μM。在一些实施方式中，药物组合物是冻干的。
如本文使用的术语“药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体”意欲包括与施用至人或其它脊椎动物宿主相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂与抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是被联邦管理机构、州政府或其它管理机构批准的，或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物——包括人以及非人哺乳动物——的稀释剂、赋形剂和/或载体。术语稀释剂、赋形剂和/或“载体”指的是使用其施用药物组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这样的药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、盐水溶液和水性右旋糖与甘油溶液可以被采用作为液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别地用于可注射的溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等，包括冻干助剂。组合物，如果需要，还可以包含微量的湿润剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等的形式。合适的药物稀释剂、赋形剂和/或载体的实例被描述在E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中。制剂应当适合施用模式。适当的稀释剂、赋形剂和/或载体对本领域技术人员将是显而易见的并且将在很大程度上取决于施用途径。
在一些实施方式中，包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体影响组合物中mRNA递送复合物或纳米颗粒的聚集水平和/或通过组合物中的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒介导的细胞内递送的效率。在一些实施方式中，影响聚集和/或通过药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体介导的递送效率的程度和/或方向取决于组合物中药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的相对量。
例如，在一些实施方式中，组合物中以一个或多个浓度存在的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体(诸如，盐、糖、化学缓冲剂、缓冲溶液、细胞培养基或载体蛋白)不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不大于约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是盐，其包括但不限于NaCl。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是糖，其包括但不限于蔗糖、葡萄糖和甘露醇。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是化学缓冲剂，其包括但不限于HEPES。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是缓冲溶液，其包括但不限于PBS。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是细胞培养基，其包括但不限于DMEM。可以使用本领域中已知的用于测量粒径的任何手段来确定粒径，例如通过动态光散射(DLS)。例如，在一些实施方式中，通过DLS测量的聚集体的Z-平均值大于通过DLS测量的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的Z-平均值10％，该聚集体大于mRNA递送复合物或纳米颗粒10％。
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％(诸如不超过约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含盐(如，NaCl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中盐的浓度不大于约100mM(诸如不大于约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1mM中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，盐是NaCl。
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％(诸如不超过约24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中糖的浓度不大于约20％(诸如不大于约18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，糖是葡萄糖。在一些实施方式中，糖是甘露醇。
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％(诸如不超过约9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约7.5％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约5％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约3％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约1％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，该浓度不促进和/或不助于形成mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，化学缓冲剂是HEPES。在一些实施方式中，HEPES以包含HEPES的缓冲液的形式添加到组合物。在一些实施方式中，包含HEPES的溶液的pH为约5和约9之间(诸如，约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，组合物以不大于约75mM(诸如不大于约70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10mM中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包含HEPES。在一些实施方式中，化学缓冲剂是磷酸盐。在一些实施方式中，磷酸盐以包含磷酸盐的缓冲液的形式添加至组合物。在一些实施方式中，组合物不包含PBS。
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，细胞培养基是DMEM。在一些实施方式中，组合物以不大于约70％(诸如不大于65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10％中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包含DMEM。
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包含载体蛋白(如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，载体蛋白是白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。
在一些实施方式中，本文描述的药物组合物配制进行静脉内、肿瘤内、动脉内、外部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内或口服施用。
在一些实施方式中，发现适于治疗人或哺乳动物对象的本发明药物组合物的剂量在以下范围内：约0.001mg/kg至约100mg/kg(如，约0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、和100mg/kg中的任一个，包括这些数值之间的任何范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，剂量范围是约0.1mg/kg至约20mg/kg(如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20mg/kg中的任一个，包括这些数值之间的任何范围)。在一些实施方式中，剂量范围是约0.5mg/kg至约10mg/kg。
在一些实施方式中，发现适于治疗人或哺乳动物对象的本发明药物组合物的剂量在以下范围内：约0.03mg/m2至约4x103mg/m2(诸如，约0.03、0.3、3、30、300、3x103、和4x103mg/m2中的任一个，包括这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，剂量范围是约3mg/m2至约800mg/m2(诸如约3、30、300、600、800mg/m2中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，剂量范围是约18mg/m2至约400mg/m2。
示例性用药频率包括，但不限于，每周一次不间断；每周一次，四周三次；每三周一次；每两周一次；每周一次，三周两次。在一些实施方式中，药物组合物被施用约每两周一次、每三周一次、每四周一次、每六周一次或每八周一次。在一些实施方式中，药物组合物被施用至少约1×、2×、3×、4×、5×、6×、或7×(即，每天)/周中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔大于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或12个月中的任一个。在一些实施方式中，用药进度方案中无间断。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔不长于约一周。在一些实施方式中，药物组合物施用个体的进度方案的范围是从单次施用构成整个治疗至每日施用。药物组合物的施用可在延长时期内延续，如约1个月上至约7年。在一些实施方式中，药物组合物在至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月中的任一个的时段内被施用。
用作第二药剂的纳米颗粒组合物
本文描述的用作第二药剂的纳米颗粒组合物包含含有紫杉烷(诸如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和白蛋白(诸如，人血清白蛋白)的纳米颗粒(在各种实施方式中，基本上由其组成)。水溶性差的药物(诸如，紫杉烷)的纳米颗粒已经在例如，美国专利号5,916,596；6,506,405；6,749,868和6,537,579；7,820,788和美国专利公开号2006/0263434和2007/0082838；PCT专利申请WO08/137148中公开，其中每篇通过引用以其全部并入。
在一些实施方式中，组合物包含平均或均值直径不大于约1000纳米(nm)，诸如不大于约900、800、700、600、500、400、300、200和100nm中的任一个的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径不大于约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约20至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均或均值直径为约40至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是无菌可过滤的。
在一些实施方式中，本文描述的组合物中的纳米颗粒的平均直径不大于约200nm，包括例如不大于约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、或60nm中的任一个。在一些实施方式中，组合物中至少约50％(例如至少约60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一个)的纳米颗粒的直径不大于约200nm，包括例如，不大于约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、或60nm中的任一个。在一些实施方式中，组合物中的至少约50％(例如至少60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一个)的纳米颗粒落入约20至约400nm的范围内，包括例如约20至约200nm、约40至约200nm、约30至约180nm和约40至约150、约50至约120和约60至约100nm中的任一个。
在一些实施方式中，白蛋白具有可以形成二硫键的硫氢(sulfhydral)基团。在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中的至少约5％(包括例如至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％中的任一个)的白蛋白进行交联(例如，通过一个或多个二硫键交联)。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含包被有白蛋白(如，人血清白蛋白)的紫杉烷(诸如太平洋紫杉醇)。在一些实施方式中，组合物包含纳米颗粒形式和非纳米颗粒形式两者的紫杉烷，其中组合物中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一个的紫杉烷为纳米颗粒形式。在一些实施方式中，纳米颗粒中的紫杉烷构成大于按重量计纳米颗粒的约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一个。在一些实施方式中，纳米颗粒具有非聚合物基质。在一些实施方式中，纳米颗粒包含基本上不含聚合物材料(诸如聚合物基质)的紫杉烷的核。
在一些实施方式中，组合物包含组合物的纳米颗粒和非纳米颗粒部分两者中的白蛋白，其中组合物中的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％中的任一个的白蛋白在组合物的非纳米颗粒部分中。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中的白蛋白(诸如，人血清白蛋白)和紫杉烷的重量比是约18：1或更小，诸如约15：1或更小，例如约10：1或更小。在一些实施方式中，组合物中的白蛋白(诸如，人血清白蛋白)和紫杉烷的重量比落入约1：1至约18：1、约2：1至约15：1、约3：1至约13：1、约4：1至约12：1、约5：1至约10：1中的任一个的范围内。在一些实施方式中，组合物的纳米颗粒部分中的白蛋白和紫杉烷的重量比是约1：2、1：3、1：4、1：5、1：10、1：15、或更小中的任一个。在一些实施方式中，组合物中的白蛋白(诸如，人血清白蛋白)和紫杉烷的重量比为以下中的任一个：约1：1至约18：1、约1：1至约15：1、约1：1至约12：1、约1：1至约10：1、约1：1至约9：1、约1：1至约8：1、约1：1至约7：1、约1：1至约6：1、约1：1至约5：1、约1：1至约4：1、约1：1至约3：1、约1：1至约2：1、约1：1至约1：1。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含上述特性中的一个或多个。
本文描述的纳米颗粒可以以干燥制剂(例如冻干的组合物)存在或悬浮在生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但不限于水、缓冲水性介质、盐水、缓冲盐水、氨基酸的任选缓冲溶液、蛋白质的任选缓冲溶液、糖的任选缓冲溶液、维生素的任选缓冲溶液、合成聚合物的任选缓冲溶液、含脂质乳液等。
在一些实施方式中，药学上可接受的载体包含人血清白蛋白。人血清白蛋白(HSA)是Mr 65K的高度可溶球状蛋白质并且由585个氨基酸组成。HAS是血浆中最丰富的蛋白质，并且占人血浆的胶体渗透压的70-80％。HAS的氨基酸序列含有总计17个二硫桥、一个游离的硫醇(Cys 34)和单个色氨酸(Trp 214)。已经指示HAS溶液的静脉内使用用于预防和治疗低血容性休克(参见，如，Tullis,JAMA,237,355-360,460-463,(1977))和Houser et al.,Surgery,Gynecology and Obstetrics,150,811-816(1980))和在治疗新生儿高胆红素血症中结合换血疗法(参见，如，Finlayson,Seminars in Thrombossi and Hemostasis,6,85-120,(1980))。考虑了其他白蛋白，诸如牛血清白蛋白。例如，在非人哺乳动物中使用这些组合物的背景下——诸如兽医(包括家养宠物和农业背景)，使用这类非人白蛋白可以是适合的。
人血清白蛋白(HSA)具有多个疏水结合位点(对于脂肪酸HAS的内源性配体总计八个)并结合各种各样的紫杉烷，尤其是天然和带负电的疏水化合物(Goodman et al.,ThePharmacological Basis of Therapeutics,9th ed,McGraw-Hill New York(1996))。在HAS的子结构域IIA和IIIA中已经提出了两个高亲和力结合位点，其是在表面附近具有带电赖氨酸和精氨酸残基的高度伸长的疏水口袋，该带电赖氨酸和精氨酸残基起到用于极性配体特征的附接点的作用(参见如，Fehske et al.,Biochem.Pharmcol.,30,687-92(198a),Vorum,Dan.Med.Bull.,46,379-99(1999),Kragh-Hansen,Dan.Med.Bull.,1441,131-40(1990),Curry et al.,Nat.Struct.Biol.,5,827-35(1998),Sugio et al.,Protein.Eng.,12,439-46(1999),He et al.,Nature,358,209-15(199b)，和Carter etal.,Adv.Protein.Chem.,45,153-203(1994))。太平洋紫杉醇和异丙酚已经显示了结合HSA(参见，如，Paal et al.,Eur.J.Biochem.,268(7),2187-91(200a),Purcell et al.,Biochim.Biophys.Acta,1478(a),61-8(2000),Altmayer et al.,Arzneimittelforschung,45,1053-6(1995)，和Garrido et al.,Rev.Esp.Anestestiol.Reanim.,41,308-12(1994))。另外，多西紫杉醇已经显示结合人血浆蛋白质(参见，如，Urien et al.,Invest.New Drugs,14(b),147-51(1996))。
组合物中的白蛋白(诸如，人血清白蛋白)一般作为紫杉烷的载体，即，与不包含白蛋白的组合物相比，组合物中的白蛋白使得紫杉烷更容易悬浮在水性介质中或帮助保持悬浮。这可以避免使用有毒溶剂(或表面活性剂)增溶紫杉烷，并由此可以降低施用紫杉烷至个体(诸如人)中的一种或多种副作用。因此，在一些实施方式中，本文描述的组合物基本上不含(诸如不含)表面活性剂，诸如Cremophor(包括Cremophor(BASF))。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物基本上不含(诸如不含)表面活性剂。如果当将纳米颗粒组合物施用至个体时，组合物中的Cremophor或表面活性剂的量不足以在个体中引起一种或多种副作用，则组合物“基本上不含Cremophor”或“基本上不含表面活性剂”。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物含有小于约20％、15％、10％、7.5％、5％、2.5％、或1％中的任一个的有机溶剂或表面活性剂。
本文描述的组合物中的白蛋白的量将根据组合物中其他的组分而改变。在一些实施方式中，组合物以足以在水性悬浮液中(例如，以稳定的胶体悬浮液的形式(诸如纳米颗粒的稳定悬浮液))稳定紫杉烷的量包含白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白的量降低紫杉烷在水性介质中的沉降速率。对于含有颗粒的组合物，白蛋白的量还取决于紫杉烷的纳米颗粒的大小和密度。
如果紫杉烷在水性介质中保持悬浮(诸如不具有可见沉淀或沉降)持续延长的时间段，诸如持续至少约0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、60、或72小时中的任一个，那么紫杉烷在水性悬浮液中是“稳定的”。悬浮液一般但不必须适合施用至个体(诸如人)。悬浮液的稳定性一般(但不必须)在存储温度(诸如室温(诸如20-25℃)或冷藏条件(诸如4℃))下评估。例如，如果在制备悬浮液后约十五分钟，悬浮液没有展现肉眼或在1000倍光学显微镜下观察时可见的絮凝或颗粒团聚，则该悬浮液在储存温度下是稳定的。稳定性也可以在加速测试条件下进行评估，例如在高于约40℃的温度下。
在一些实施方式中，白蛋白以足以使紫杉烷在水性悬浮液中以某一浓度稳定的量存在。例如，组合物中紫杉烷的浓度为约0.1至约100mg/ml，包括例如约0.1至约50mg/ml、约0.1至约20mg/ml、约1至约10mg/ml、约2mg/ml至约8mg/ml、约4至约6mg/ml、约5mg/ml中的任一个。在一些实施方式中，紫杉烷的浓度为至少约1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、和50mg/ml中的任一个。在一些实施方式中，白蛋白以避免使用表面活性剂(诸如Cremophor)的量存在，以便组合物不含或基本上不含表面活性剂(诸如Cremophor)。
在一些实施方式中，液体形式的组合物包含约0.1％至约50％(w/v)(如约0.5％(w/v)、约5％(w/v)、约10％(w/v)、约15％(w/v)、约20％(w/v)、约30％(w/v)、约40％(w/v)或约50％(w/v))的白蛋白。在一些实施方式中，液体形式的组合物包含约0.5％至约5％(w/v)的白蛋白。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中的白蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷的重量比使得足够量的紫杉烷与细胞结合或被细胞运输。虽然对于不同的白蛋白和紫杉烷组合必须优化白蛋白与紫杉烷的重量比，但是一般地白蛋白(如白蛋白)与紫杉烷的重量比(w/w)为约0.01：1至约100：1、约0.02：1至约50：1、约0.05：1至约20：1、约0.1：1至约20：1、约1：1至约18：1、约2：1至约15：1、约3：1至约12：1、约4：1至约10：1、约5：1至约9：1、或约9：1。在一些实施方式中，白蛋白与紫杉烷重量比为约18：1或更小、15：1或更小、14：1或更小、13：1或更小、12：1或更小、11：1或更小、10：1或更小、9：1或更小、8：1或更小、7：1或更小、6：1或更小、5：1或更小、4：1或更小、和3：1或更小中的任一个。在一些实施方式中，组合物中的白蛋白(诸如，人血清白蛋白)和紫杉烷是以下中的任一个：约1：1至约18：1、约1：1至约15：1、约1：1至约12：1、约1：1至约10：1、约1：1至约9：1、约1：1至约8：1、约1：1至约7：1、约1：1至约6：1、约1：1至约5：1、约1：1至约4：1、约1：1至约3：1、约1：1至约2：1、约1：1至约1：1。
在一些实施方式中，白蛋白允许组合物施用至个体(诸如人)，而没有显著的副作用。在一些实施方式中，白蛋白(诸如，人血清白蛋白)的量有效降低施用紫杉烷至人的一种或多种副作用。术语“降低施用紫杉烷的一种或多种副作用”是指减少、减轻、消除或避免紫杉烷引起的一种或多种不期望的作用，以及由用于递送紫杉烷的递送媒介物(诸如使紫杉烷适合注射的溶剂)引起的副作用。这样的副作用包括例如骨髓抑制、神经毒性、超敏反应、炎症、静脉刺激、静脉炎、疼痛、皮肤刺激、外周神经病、中性粒细胞减少热、过敏反应、静脉血栓形成、外渗及其组合。然而，这些副作用仅仅是示例性的，并且也可以降低与紫杉烷相关的其他副作用或副作用的组合。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含(Nab-太平洋紫杉醇)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物是(Nab-太平洋紫杉醇)。是通过人白蛋白USP稳定的太平洋紫杉醇的制剂，其可以在可直接注射的生理溶液中分散。当在合适的水性介质(诸如0.9％氯化钠注射液或5％右旋糖注射液)中分散时，形成太平洋紫杉醇的稳定胶体悬浮液。胶体悬浮液中纳米颗粒的平均粒径为约130纳米。由于HAS在水中是自由溶解的，可以以范围从稀(0.1mg/ml太平洋紫杉醇)至浓(20mg/ml太平洋紫杉醇)的宽范围的浓度重构，其包括例如约2mg/ml至约8mg/ml、约5mg/ml。
制备纳米颗粒组合物的方法在本领域中是已知的。例如，可以在高剪切力的条件下(如，超声、高压均化等)制备含有紫杉烷(诸如太平洋紫杉醇)和白蛋白(诸如，人血清白蛋白)的纳米颗粒。这些方法公开在例如，美国专利号5,916,596；6,506,405；6,749,868；6,537,579、7,820,788中，并且还公开在美国专利公开号2007/0082838、2006/0263434和PCT申请WO08/137148中。
简言之，紫杉烷(诸如太平洋紫杉醇)被溶解在有机溶剂中，并且溶液可以被添加至白蛋白溶液。使混合物经历高压均化。然后可以通过蒸发去除有机溶剂。获得的分散体可以进一步进行冻干。适合的有机溶剂包括，例如，酮、酯、醚、氯化溶剂和本领域已知的其他溶剂。例如，有机溶剂可以是二氯甲烷或氯仿/乙醇(例如，具有1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、或9：1的比。
制备方法
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的方法，其包含使CPP与一种或多种mRNA组合，由此形成mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。
因此，在一些实施方式中，提供了制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的方法，其包含使CPP与一种或多种mRNA组合。
例如,在一些实施方式中，提供了制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的方法，其包含a)使包含一种或多种mRNA的第一组合物与包含细胞穿透肽的第二组合物在水性介质中组合以形成混合物；和b)培育混合物以形成包含与一种或多种mRNA缔合的细胞穿透肽的复合物，由此产生mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，水性介质是缓冲液，包括例如PBS、Tris或本领域已知用于稳定核蛋白复合物的任何缓冲液。在一些实施方式中，包含一种或多种mRNA的第一组合物是包含冻干形式的一种或多种mRNA和合适的载体的固体。在一些实施方式中，包含细胞穿透肽的第二组合物是包含如下浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(诸如约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，包含细胞穿透肽的第二组合物是包含冻干形式的细胞穿透肽和适合载体的固体。在一些实施方式中，在水中配制溶液。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，在缓冲液中配制溶液。在一些实施方式中，缓冲液是本领域内已知用于存储mRNA或多肽的任何缓冲液。在一些实施方式中，混合物中的细胞穿透肽和与细胞穿透肽缔合的mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间、或约1：1和约50：1之间、或约20：1。在一些实施方式中，在约2℃至约50℃(包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃)的温度下培育混合物持续约10min至60min(包括例如约20min、30min、40min、和50min中的任一个)以形成包含与一种或多种mRNA缔合的细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒，由此导致包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的溶液。在一些实施方式中，在4℃下，包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的溶液保持稳定至少约三周，包括例如，至少约6周、2个月、3个月、4个月、5个月、和6个月中的任一个。在一些实施方式中，在存在载体的情况中，包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的溶液被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和其组合，并且以每体积约1％至约20％(包括例如约1％至约10％、约10％至15％、约15％至约20％)的重量存在于包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的溶液中。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，诸如，人血清白蛋白。在一些实施方式中，细胞穿透肽是PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽，如本文所描述。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:75-80中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了制备本文描述的包含核和至少一个另外的层的纳米颗粒的方法，其包含a)使包含一种或多种mRNA的组合物与包含第一细胞穿透肽的组合物在水性介质中组合以形成第一混合物；b)培育第一混合物以形成包含与一种或多种mRNA缔合的第一细胞穿透肽的纳米颗粒的核；c)使包含纳米颗粒的核的组合物(诸如b)的混合物)与包含第二细胞穿透肽的组合物在水性介质中组合以形成第二混合物，和d)培育第二混合物以形成包含核和至少一个另外的层的纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包含e)使包含含有核与至少一个另外的层的纳米颗粒的组合物与包含第三细胞穿透肽的组合物在水性介质中组合，以形成第三混合物，和f)培育第三混合物以形成包含核和至少两个另外的层的纳米颗粒。应当认识到，该方法可以适于形成包含增加数目的层的纳米颗粒。在一些实施方式中，水性介质是缓冲液，包括例如PBS、Tris、或本领域已知用于稳定核蛋白复合物的任何缓冲液。在一些实施方式中，包含一种或多种mRNA的组合物是包含多种mRNA的溶液。在一些实施方式中，包含一种或多种mRNA的组合物是进一步包含RNAi(例如，siRNA)的溶液。在一些实施方式中，包含一种或多种mRNA的组合物是进一步包含多种RNAi(例如，靶向多个基因的多种siRNA)的溶液。在一些实施方式中，包含一种或多种mRNA的组合物是包含冻干形式的一种或多种mRNA和合适载体的固体。在一些实施方式中，包含第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物每个是包含如下浓度的细胞穿透肽的溶液：约1nM至约200μM(诸如约2nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、或200μM中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，包含第一、第二和/或第三细胞穿透肽的组合物每个是包含冻干形式的细胞穿透肽和合适载体的固体。在一些实施方式中，在水中配制溶液。在一些实施方式中，水是蒸馏水。在一些实施方式中，在缓冲液中配制溶液。在一些实施方式中，缓冲液是本领域已知用于存储mRNA或多肽的任何缓冲液。在一些实施方式中，第一混合物中的第一细胞穿透肽与mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间、或约1：1和约50：1之间、或约20：1。在一些实施方式中，在约2℃至约50℃(包括例如约2℃至约5℃、约5℃至约10℃、约10℃至约15℃、约15℃至约20℃、约20℃至约25℃、约25℃至约30℃、约30℃至约35℃、约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、和约45℃至约50℃)的温度下单独培育第一、第二和/或第三混合物约10min至60min，其包括例如约20min、30min、40min和50min中的任一个。在一些实施方式中，在4℃下，包含纳米颗粒的溶液保持稳定至少约三周，其包括例如，至少6周、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月中的任一个。在一些实施方式中，在存在载体的情况中，包含纳米颗粒的溶液被冻干。在一些实施方式中，载体是糖，包括例如，蔗糖、葡萄糖，甘露醇和其组合，并且以每体积约5％至约20％(包括例如约7.5％至约17.5％、约10％至约15％、和约12.5％)的重量存在于包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的溶液中。在一些实施方式中，载体是蛋白质，包括例如白蛋白，诸如，人血清白蛋白。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽单独是PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽，如本文所描述。在一些实施方式中，第一、第二和/或第三细胞穿透肽单独包含SEQID NO:75、76、77、78、79、或80的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文描述的制备复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含向包含复合物或纳米颗粒的组合物中添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体(诸如，盐、糖、化学缓冲剂、缓冲溶液、细胞培养基或载体蛋白)，或调整组合物中药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的量的步骤。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体影响组合物中mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集水平和/或通过组合物中的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒介导的细胞内递送的效率。在一些实施方式中，影响聚集和/或通过药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体介导的递送效率的程度和/或方向取决于组合物中药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的相对量。
例如，在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物以达到药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不大于约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，或调整组合物，以达到组合物中的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是盐，包括但不限于NaCl。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是糖，包括但不限于蔗糖、葡萄糖和甘露醇。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是化学缓冲剂，包括但不限于HEPES。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是缓冲溶液，包括但不限于PBS。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是细胞培养基，包括但不限于DMEM。可以使用本领域中已知的用于测量粒径的任何手段来确定粒径，例如通过动态光散射(DLS)。例如，在一些实施方式中，通过DLS测量的聚集体的Z-平均值大于通过DLS测量的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的Z-平均值10％，该聚集体大于mRNA递送复合物或纳米颗粒10％。
在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物以达到组合物中盐的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％(诸如不超过约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物，以达到组合物中的盐(如，NaCl)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物，以达到组合物中的盐(如，NaCl)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物，以达到组合物中的盐(如，NaCl)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物，以达到组合物中的盐(如，NaCl)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加盐(如，NaCl)，或调整组合物，以达到组合物中的盐(如，NaCl)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中盐的浓度不大于约100mM(诸如不大于约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1mM中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，盐是NaCl。
在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物以达到组合物中糖的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％(诸如不超过约24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物，以达到组合物中的糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物，以达到组合物中的糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物，以达到组合物中的糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物，以达到组合物中的糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，或调整组合物，以达到组合物中的糖(如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中糖的浓度不大于约20％(诸如不大于约18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，糖是葡萄糖。在一些实施方式中，糖是甘露醇。
在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物以达到组合物中化学缓冲剂的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％(诸如不超过约9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物，以达到组合物中的化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约7.5％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物，以达到组合物中的化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约5％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物，以达到组合物中的化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约3％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物，以达到组合物中的化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约1％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)，或调整组合物，以达到组合物中的化学缓冲剂(如，HEPES或磷酸盐)的浓度为不促进和/或不助于形成mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，化学缓冲剂是HEPES。在一些实施方式中，HEPES以包含HEPES的缓冲液的形式添加到组合物。在一些实施方式中，包含HEPES的溶液的pH为约5和约9之间(诸如，约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，组合物以不大于约75mM(诸如不大于约70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10mM中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包含HEPES。在一些实施方式中，化学缓冲剂是磷酸盐。在一些实施方式中，磷酸盐以包含磷酸盐的缓冲液的形式添加至组合物。在一些实施方式中，组合物不包含PBS。
在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物以达到组合物中细胞培养基的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物，以达到组合物中的细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物，以达到组合物中的细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物，以达到组合物中的细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物，以达到组合物中的细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)，或调整组合物，以达到组合物中的细胞培养基(如，DMEM或Opti-MEM)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以不大于约70％(诸如不大于65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10％中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包含细胞培养基。在一些实施方式中，细胞培养基是DMEM。在一些实施方式中，细胞培养基是Opti-MEM。
在一些实施方式中，制备本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物、纳米颗粒或组合物的方法进一步包含如下步骤：向包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物以达到组合物中载体蛋白的浓度为不促进和/或不助于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(诸如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物，以达到组合物中的载体蛋白(如，白蛋白)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物，以达到组合物中的载体蛋白(如，白蛋白)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物，以达到组合物中的载体蛋白(如，白蛋白)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物，以达到组合物中的载体蛋白(如，白蛋白)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，向组合物添加载体蛋白(如，白蛋白)，或调整组合物，以达到组合物中的载体蛋白(如，白蛋白)的浓度为促进和/或助于形成大小不超过大于mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，载体蛋白是白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。
在一些实施方式中，对于本发明的包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的稳定组合物，复合物或纳米颗粒的平均直径改变不超过约10％，并且多分散指数改变不超过约10％。
使用方法
疾病治疗方法
在一个方面中，本发明提供了治疗个体的疾病或病症的方法，包括向个体递送mRNA和/或RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，提供的是治疗个体的疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文描述的用于细胞内递送mRNA的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒包含可用于治疗疾病或病症的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一种修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。在一些实施方式中，mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒包含含有PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列的CPP。在一些实施方式中，药物组合物中mRNA的最低有效量小于其中mRNA不在本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒中的类似药物组合物(如，包含游离mRNA的药物组合物)中mRNA的最低有效量。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白，例如，肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，如本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒进一步包含抑制性RNA(RNAi)，诸如靶向内源性基因(如，疾病相关内源性基因)的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA，其包含编码第一治疗性蛋白的第一mRNA和编码第二治疗性蛋白的第二mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含多种RNAi(例如，siRNA和/或微小RNA)，其中多种RNAi靶向参与疾病或病症的多种内源性基因。在一些实施方式中，纳米颗粒的复合物包含治疗性mRNA和治疗性RNAi，其中治疗性mRNA编码治疗性蛋白，和其中治疗性RNAi靶向参与疾病或病症的内源性基因。在一些实施方式中，治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)，和mRNA是内源性基因的治疗形式(如，第二转基因编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或第二转基因导致蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码第一治疗性蛋白的第一mRNA和编码第二治疗性mRNA的第二mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码多种蛋白质的单一mRNA。在一些实施方式中，待治疗的疾病或病症包括但不限于癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、老化和退行性疾病、和特征在于胆固醇水平异常的疾病。在一些实施方式中，mRNA能够调谐一种或多种基因的表达。在一些实施方式中，一种或多种基因编码蛋白质，其包括但不限于生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其他转录调谐子、蛋白质表达和修饰的调节剂、肿瘤阻抑蛋白、和凋亡和转移的调节剂。在一些实施方式中，药物组合物进一步包含本文所描述的一种或多种另外的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包含向个体施用有效量的包含本文所描述的一种或多种另外的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒的一种或多种另外的药物组合物。
本文使用的“调谐”活性或表达意思是调节或改变基因或mRNA的状态或拷贝数或改变基因产物比如产生的蛋白质的量。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi增加靶基因的表达。在一些实施方式中，mRNA增加基因或基因产物的表达至少约0％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中的任一个。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi抑制靶基因的表达。在一些实施方式中，mRNA抑制基因或基因产物的表达至少约0％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中的任一个。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文描述的用于细胞内递送mRNA的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒包含可用于治疗疾病或病症的一种或多种mRNA和包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列的细胞穿透肽。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，待治疗的疾病或病症包括但不限于癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、老化和退行性疾病和胆固醇水平异常。在一些实施方式中，药物组合物中mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒包含用于调谐个体中一种或多种基因的表达的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，一种或多种基因编码蛋白质，其包括但不限于生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其他转录调谐子、蛋白质表达和修饰的调节剂、肿瘤阻抑蛋白、和凋亡和转移的调节剂。在一些实施方式中，药物组合物进一步包含如本文所描述的一种或多种另外的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，方法进一步包含向个体施用有效量的一种或多种另外的药物组合物，其包含本文描述的一种或多种另外的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒。
在本文描述的方法的一些实施方式中，mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒包含编码一种或多种蛋白质诸如一种或多种治疗性蛋白的一种或多种mRNA。在一些实施方式中，一种或多种mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒进一步包含抑制性RNA(RNAi)，诸如治疗性RNAi。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中疾病或病症的方法，其包括向个体施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中方法包括多次施用药物组合物。在一些实施方式中，重复施用药物组合物不引发个体对药物组合物的不利免疫应答，或与重复施用单独包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒中含有的一种或多种mRNA的类似药物组合物相比，引发个体中基本上降低的免疫应答。在一些实施方式中，重复施用药物组合物导致强度不大于通过对应重复施用单独包含mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒中含有的一种或多种mRNA的类似药物组合物的约99％(诸如不大于约95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2、1％或更小中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，药物组合物包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中复合物或纳米颗粒递送至局部组织、器官或细胞。在一些实施方式中，提供的是治疗个体中疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，药物组合物包含本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体，其中复合物或纳米颗粒递送至血管或血管周围的组织。
疾病和病症
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤，和药物组合物包含含有编码蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，蛋白质包括但不限于生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其他转录调谐子、蛋白质表达和修饰的调节剂、肿瘤阻抑蛋白、和凋亡和转移的调节剂。在一些实施方式中，生长因子或细胞因子包括但不限于EGF、VEGF、FGF、HGF、HDGF、IGF、PDGF、TGF-α、TGF-β、TNF-α、和wnt，包括其突变体。在一些实施方式中，细胞表面受体包括但不限于ER、PR、Her2、Her3、血管生成素受体、EGFR、FGFR、HGFR、HDGFR、IGFR、KGFR、MSFR、PDGFR、TGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Frizzled家族受体(FZD-1至10)、smoothened、patched和CXCR4，包括其突变体。在一些实施方式中，信号传导分子或激酶包括但不限于KRAS、NRAS、RAF、MEK、MEKK、MAPK、MKK、ERK、JNK、JAK、PKA、PKC、PI3K、Akt、mTOR、Raptor、Rictor、MLST8、PRAS40、DEPTOR、MSIN1、S6激酶、PDK1、BRAF、FAK、Src、Fyn、Shc、GSK、IKK、PLK-1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk1至13)、CDK-活化激酶、ALK/Met、Syk、BTK、Bcr-Abl、RET、β-联蛋白、Mcl-1和PKN3，包括其突变体。在一些实施方式中，转录因子或其他转录调谐子包括但不限于AR、ATF1、CEBPA、CREB1、ESR1、EWSR1、FOXO1、GATA1、GATA3、HNF1A、HNF1B、IKZF1、IRF1、IRF4、KLF6、LMO1、LYL1、MYC、NR4A3、PAX3、PAX5、PAX7、PBX1、PHOX2B、PML、RUNX1、SMAD4、SMAD7、STAT5B、TAL1、TP53、WT1、ZBTB16、ATF-2、Chop、c-Jun、c-Myc、DPC4、Elk-1、Ets1、Max、MEF2C、NFAT4、Sap1a、STATs、Tal、p53、CREB、NF-κB、HDACs、HIF-1α和RRM2，包括其突变体。在一些实施方式中，蛋白质表达或修饰的调节子包括但不限于泛素连接酶、LMP2、LMP7和MECL-1，包括其突变体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白包括但不限于APC、BRCA1、BRCA2、DPC4、INK4、MADR2、MLH1、MSH2、MSH6、NF1、NF2、p53、PTC、PTEN、Rb、VHL、WT1、WT2、和SWI/SNF染色质重塑复合物的成分，包括其突变体。在一些实施方式中，凋亡或转移的调节子包括但不限于XIAP、Bcl-2、骨桥蛋白、SPARC、MMP-2、MMP-9、uPAR，包括其突变体。
在一些实施方式中，实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫滑膜肉瘤(uterine sacronomasynovioma)、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、杆细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒进一步包含靶向内源性基因的RNAi(诸如siRNA)，内源性基因如癌症相关内源性基因，例如癌基因。在一些实施方式中，癌基因是rasK。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是实体瘤，和药物组合物包含含有编码参与肿瘤发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，mRNA编码参与肿瘤发展和/或进展的蛋白质，其包括但不限于IL-2、IL-12、干扰素-γ、GM-CSF、B7-1、胱天蛋白酶-9、p53、MUC-1、MDR-1、HLA-B7/Β2-微球蛋白、Her2、Hsp27、胸苷激酶和MDA-7，包括其突变体。在一些实施方式中，mRNA编码蛋白质，诸如治疗性蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码CAR。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码多种蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码单一蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码第一蛋白质和第二蛋白质的单一mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi，诸如siRNA，诸如靶向内源性基因(如，疾病相关内源性基因)的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi，和蛋白质是可用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含治疗性mRNA和治疗性RNAi，其中治疗性RNAi靶向内源性基因(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)的疾病相关形式，和治疗性mRNA与内源性基因的治疗形式对应(如，第二转基因编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或第二转基因导致蛋白质的正常表达)。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是肝癌，和药物组合物包含含有编码参与肝癌发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肝癌发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肝癌发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，肝癌是肝细胞癌、胆管癌、肝血管肉癌(angiosarcoma of the liver)、或肝血管内皮瘤(hemangiosarcoma of the liver)。在一些实施方式中，参与肝癌发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于CCND2、RAD23B、GRP78、CEP164、MDM2和ALDH2，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据本文描述的任意方法，癌症是肝细胞癌(HCC)。在一些实施方式中，HCC是早期HCC、非转移性HCC、原发性HCC、晚期HCC、局部晚期HCC、转移性HCC、缓解期HCC或复发性HCC。在一些实施方式中，HCC是局部化可切除的(即，局限于肝的一部分、允许完全外科切除的肿瘤)、局部化不可切除的(即，局部化的肿瘤可能是不可切除的，因为涉及重要的血管结构或因为肝受损)、或不可切除的(即，肿瘤涉及全部肝叶和/或已扩散以涉及其它器官(例如，肺、淋巴结、骨)。在一些实施方式中，根据TNM分类，HCC是阶段I肿瘤(无血管侵入的单个肿瘤)、阶段II肿瘤(有血管侵入的单个肿瘤、或均不大于5cm的多个肿瘤)、阶段III肿瘤(任一个大于5cm的多个肿瘤、或涉及门静脉或肝静脉的主要分支的肿瘤)、阶段IV肿瘤(直接侵入胆囊以外的相邻器官或脏层腹膜穿孔的肿瘤)、N1肿瘤(区域性淋巴结转移)、或M1肿瘤(远距离转移)。在一些实施方式中，根据AJCC(American JointCommission onCancer)分阶标准，HCC为阶段T1、T2、T3、或T4 HCC。在一些实施方式中，HCC是肝细胞癌、HCC的纤维板层变体、和混合肝细胞胆管癌中的任一种。在一些实施方式中，个体可以是具有与肝细胞癌相关的基因、遗传突变或多态现象(例如，CCND2、RAD23B、GRP78、CEP164、MDM2和/或ALDH2的突变或多态现象)或具有一个或多个额外拷贝的与肝细胞癌相关的基因的人。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗疾病是癌症，其中癌症是肺癌，并且药物组合物包括含有编码参与肺癌发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肺癌发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肺癌发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与肺癌发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1，XPD、IL8RA、EGFR、Ot1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS和AKT，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何本文所述方法，癌症是肺癌。在一些实施方式中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC的实例包括但不限于，大细胞癌(如，大细胞神经内分泌癌、组合型大细胞神经内分泌癌、类基底细胞癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、和具有杆状表型的大细胞癌)、腺癌(如，腺泡、乳头状(如，细支气管肺泡癌、非粘蛋白性、粘蛋白性、混合粘蛋白性和非粘蛋白性和不确定细胞类型)、带有粘蛋白的实体腺癌、带有混合亚型的腺癌、分化良好的胎儿腺癌、粘蛋白性(胶样)腺癌、粘蛋白性囊腺癌、印戒腺癌和透明细胞腺癌)、神经内分泌肺肿瘤和鳞状细胞癌(如，乳头状、透明细胞、小细胞和类基底细胞)。在一些实施方式中，根据TNM分类，NSCLC是阶段T肿瘤(原发性肿瘤)、阶段N肿瘤(区域性淋巴结)、或阶段M肿瘤(远距离转移)。在一些实施方式中，肺癌是类癌(典型或非典型)、腺鳞癌、圆柱瘤、或唾液腺癌(如，腺样囊性癌或粘液表皮样癌)。在一些实施方式中，肺癌是带有多形性、肉瘤样、或肉瘤元素的癌(如，带有梭形细胞和/或巨细胞的癌、梭形细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤、或肺胚细胞瘤)。在一些实施方式中，癌症是小细胞肺癌(SCLC；也被称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可以是有限阶段(limited-stage)、扩散阶段(extensive stage)或复发性小细胞肺癌。在一些实施方式中，个体可以是具有怀疑或显示与肺癌相关的基因、遗传突变、或多态现象(例如，SASH1、LATS1、IGF2R、PARK2、KRAS、PTEN、Kras2、Krag、Pas1、ERCC1、XPD、IL8RA、EGFR、Ot1-AD、EPHX、MMP1、MMP2、MMP3、MMP12、IL1β、RAS、和/或AKT的突变或多态现象)或具有一个或多个额外拷贝的与肺癌相关基因的人。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是肾细胞癌(RCC)，并且药物组合物包括含有编码参与RCC发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与RCC发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与RCC发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与RCC发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于VHL、TSCl、TSC2、CUL2、MSH2、MLHl、INK4a/ARF、MET、TGF-α、TGF-βl、IGF-I、IGF-IR、AKT和PTEN，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何上述方法，癌症是肾细胞癌。在一些实施方式中，肾细胞癌是腺癌。在一些实施方式中，肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌(也被称为嗜染肾细胞癌)、嫌染肾细胞癌、集合管肾细胞癌、粒状肾细胞癌、混合粒状肾细胞癌、肾血管肌脂瘤或梭形肾细胞癌。在一些实施方式中，个体可以是具有与肾细胞癌相关的基因、遗传突变或多态现象(例如，VHL、TSCl、TSC2、CUL2、MSH2、MLHl、INK4a/ARF、MET、TGF-α、TGF-βl、IGF-I、IGF-IR、AKT、和/或PTEN的突变或多态现象)或具有一个或多个额加拷贝的与肾细胞癌相关基因的人。在一些实施方式中，肾细胞癌与下列相关：(1)von Hippel-Lindau(VHL)综合征、(2)遗传性乳头状肾癌(HPRC)、(3)与Birt-Hogg-Dube综合征(BHDS)相关的家族性肾嗜酸细胞瘤(FRO)、或(4)遗传性肾癌(HRC)。在一些实施方式中，肾细胞癌处于根据American Joint Committee on Cancer(AJCC)分阶组的阶段I、II、III、或IV中的任一阶段。在一些实施方式中，肾细胞癌是阶段IV肾细胞癌。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是中枢神经系统(CNS)肿瘤，并且药物组合物包括含有编码参与CNS肿瘤发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与CNS肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与CNS肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，药物组合物在对CNS肿瘤的外科程序期间或之后(诸如紧随其后)被施用。在一些实施方式中，外科程序是CNS肿瘤的切除。在一些实施方式中，药物组合物被施用到由外科程序产生的外科腔(surgicalcavity)中。在一些实施方式中，参与CNS肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于NF1、NF2、SMARCB1、pVHL、TSC1、TSC2、p53、CHK2、MLH1、PMS2、PTCH、SUFU和XRCC7，包括其突变体。
在一些实施方式中，根据任何本文所述方法，癌症是CNS肿瘤。在一些实施方式中，CNS肿瘤是神经胶质瘤(如，脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(还被称为成多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤(诸如高级星形细胞瘤)、儿童神经胶质瘤或成胶质细胞瘤(诸如儿童高级神经胶质瘤(HGG)和弥漫性内在脑桥神经胶质瘤(DIPG))、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤或脑转移。在一些实施方式中，个体可以是具有怀疑或显示与CNS肿瘤相关的基因、遗传突变、或多态现象(如，NF1、NF2、SMARCB1、pVHL、TSC1、TSC2、p53、CHK2、MLH1、PMS2、PTCH、SUFU和XRCC7的突变或多态现象)或具有一个或多个额外拷贝的与CNS肿瘤相关基因的人。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗疾病是血液疾病，并且药物组合物包括含有编码参与血液疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与血液疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与血液疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，血液疾病是血红蛋白病，诸如镰状细胞病、地中海贫血、或高铁血红蛋白血症、贫血诸如巨幼细胞性贫血、溶血性贫血(如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞性贫血、先天性红细胞生成障碍性贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症、免疫介导性溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血、温抗体自身免疫性溶血性贫血、系统性红斑狼疮、Evans综合征、冷性自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素疾病、阵发性冷性血红蛋白尿症、传染性单核细胞增多症、同种免疫性溶血性贫血、新生儿溶血性疾病、或阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、再生障碍性贫血(如，Fanconi贫血、Diamond-Blackfan贫血或获得性纯红细胞再生障碍性贫血)、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、中性白细胞减少症、粒细胞缺乏症、Glanzmann血小板机能不全、血小板减少症、骨髓增生性障碍、诸如真性红细胞增多症(polycethemia vera)、红细胞增多症、白细胞增多症、或血小板增多症、或凝血紊乱、诸如复发性血栓症、弥散性血管内凝血、血友病(如、血友病A、血友病B、或血友病C)、Von Willebrand病、蛋白质S缺乏症、抗磷脂综合征、或Wiskott-Aldrich综合征。在一些实施方式中，参与血液疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于HBA1、HBA2、HBB、PROC、ALAS2、ABCB7、SLC25A38、MTTP、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1(BRCA2)、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ(BRIP1)、FANCL、FANCM、FANCN(PALB2)、FANCP(SLX4)、FANCS(BRCA1)、RAD51C，XPF、ANK1、SPTB、SPTA、SLC4A1、EPB42和TPI1，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是基于器官的疾病，并且药物组合物包括含有编码参与基于器官的疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与基于器官的疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与基于器官的疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，基于器官的疾病是眼、肝、肺、肾、心脏、神经系统、肌肉、或皮肤的疾病。在一些实施方式中，疾病是心血管疾病，诸如冠状心脏病、高血压、心房颤动、外周动脉疾病、Marfan综合征、长QT综合征或先天性心脏缺陷。在一些实施方式中，疾病是消化系统疾病，诸如肠道易激综合征、溃疡性结肠炎、克罗恩病、腹部疾病、消化性溃疡疾病、胃食管反流病或慢性胰腺炎。在一些实施方式中，疾病是泌尿系统疾病，诸如慢性前列腺炎、良性前列腺增生症或间质性膀胱炎。在一些实施方式中，疾病是肌肉骨骼疾病，诸如骨性关节炎、骨质疏松、成骨不全或Paget骨疾病。在一些实施方式中，疾病是皮肤疾病，诸如湿疹、银屑病、粉刺、酒渣鼻或皮炎。在一些实施方式中，疾病是牙齿或颅面障碍，诸如牙周疾病或颞下颌关节和肌肉障碍(TMJD)。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是眼部疾病，并且药物组合物包括含有编码参与眼部疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与眼部疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与眼部疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，眼部疾病是年龄相关性黄斑变性或类似疾病、早产儿视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、缺血性增生性视网膜病变、色素性视网膜炎、视锥细胞营养不良、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、角膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、Leber病、视网膜脱离、视网膜色素上皮脱离、新生血管性青光眼、角膜新生血管形成、视网膜脉络膜新生血管形成或遗传性视网膜疾病(诸如RPE65介导的IRD、脉络膜炎、视紫红质联结的常染色体显性视网膜色素变性(RHO-adRP)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、或Leber先天性黑蒙症。在一些实施方式中，参与眼部疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于Rho、PDE6β、ABCA4、RPE65、LRAT、RDS/Peripherin、MERTK、CNGA1、RPGR、IMPDH1、ChR2、GUCY2D、RDS/Peripherin、AIPL1、ABCA4、RPGRIP1、IMPDH1、AIPL1、GUCY2D、LRAT、MERTK、RPGRIP1、RPE65、CEP290、ABCA4、DFNB31、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH1G、CLRN1、GNAT2、CNGA3、CNGB3、Rs1、OA1、MT-ND4、(OCA1)、酪氨酸酶、p21 WAF-1/OCipl、REP-1、PDGF、内皮抑制素(Endostatin)、血管抑制素(Angiostatin)、VEGF抑制剂、视蛋白(Opsin)、OPN1LW、芳基硫酸酯酶B、和β-葡糖苷酸酶，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是肝病，并且药物组合物包括含有编码参与肝病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肝病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肝病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，肝病是肝炎、脂肪肝病(酒精性和非酒精性)、血色病、Wilson病、进行性家族性肝内胆汁郁积3型、遗传性果糖不耐症、糖原贮积病IV型、酪氨酸血症I型、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬素缺乏症(CTLN2、NICCD)、胆固醇酯贮积病、囊性纤维化、综合征、先天性肝纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病II型、甲状腺素运载蛋白质相关性遗传性淀粉样变性、Gilbert综合征、硬化、原发性胆汁性硬化、原发性硬化性胆管炎、血友病(诸如血友病A或血友病B)、或甲基丙二酸血症(MMA)。在一些实施方式中，参与肝病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于ATP7B、ABCB4、ALDOB、GBE1、FAH、ASL、SLC25A13、LIPA、CFTR、ALMS1、HFE、HFE2、HFDE2B、HFE3、SLC11A3/SLC40A1、血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、转铁蛋白、A1AT、BCS1L、B3GAT1、B3GAT2、B3GAT3、UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A5、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2A1、UGT2A2、UGT2A3、UGT2B4、UGT2B7、GT2B10、UGT2B11、UGT2B15、UGT2B17、UGT2B28、因子IX、因子VIII、和MUT(CoA变位酶)，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是肺病，并且药物组合物包括含有编码参与肺病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肺癌发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肺病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，肺病是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、肺纤维化、Birt Hogg Dube综合征、结节性硬化症、Kartagener综合征、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、肺毛细血管瘤病(PCH)、或遗传性出血性毛细血管扩张症。在一些实施方式中，参与肺病发生和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于EIF2AK4、IREB2、HHIP、FAM13A、IL1RL1、TSLP、IL33、IL25、CFTR、DNAI1、DNAH5、TXNDC3、DNAH11、DNAI2、KTU、RSPH4A、RSPH9、LRRC50、TERC、TERT、SFTPC、SFTPA2、FLCN、TSC1、TSC2、A1AT、ENG、ACVRL1和MADH4，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是肾病，并且药物组合物包括含有编码参与肾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，肾病是囊性肾病(如，常染色体显性多囊肾病、常染色体隐性多囊肾病、肾结核(nephronophthisis)、或髓质海绵肾)、Alport综合征、Bartter综合征、先天性肾病综合征、指甲-髌骨综合征、原发性免疫性肾小球肾炎、反流性肾病或溶血性尿毒综合征。在一些实施方式中，参与肾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于PKD1、PKD2、PKD3、fibrocystin、NPHP1、NPHP2、NPHP3、NPHP4、NPHP5、NPHP6、NPHP7、NPHP8、NPHP9、NPHP11、NPHP11、NPHPL1、GDNF、COL4A5、COL4A3、COL4A4、SLC12A2(NKCC2)、ROMK/KCNJ1、CLCNKB、BSND、CASR、SLC12A3(NCCT)和ADAMTS13，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是肌肉疾病，并且药物组合物包括含有编码参与肌肉疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与肌肉疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与肌肉疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，肌肉疾病是肌病(如，线粒体肌病)、肌营养不良症(如，Duchenne、Becker、Emery-Dreifuss、面肩肱型、肌强直性、先天性、远端、肢带型、和眼咽型)、脑瘫、进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressiva)、皮肌炎、隔室综合症、重症肌无力、肌萎缩侧索硬化、横纹肌溶解症、多肌炎、纤维肌痛、肌强直、肌筋膜疼痛综合征。在一些实施方式中，参与肌肉疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于DMD、LAMA2、胶原蛋白质VI(COL6A1、COL6A2、或COL6A3)、POMT1、POMT2、FKTN、FKRP、LARGE1、POMGNT1、ISPD、SEPN1、LMNA、DYSF、EMD、DUX4、DMPK、ZNF9、PABPN1、CAV3、CAPN3、SGCA、SGCB、SGCG、SGCD、TTN、ANO5、DNAJB6、HNRNPDL、MYOT、TCAP、TNPO3、TRAPPC11、和TRIM32，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是神经系统疾病(诸如中枢神经系统疾病)，并且药物组合物包括含有编码参与神经系统疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与神经系统发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与神经系统发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，神经系统疾病是肾上腺脑白质营养不良、Angelman综合征、共济失调毛细血管扩张症、Charcot-Marie-Tooth综合征、Cockayne综合征、特发性震颤、脆性X综合征、Friedreich共济失调、Gaucher病、Lesch-Nyhan综合征、枫糖尿病、Menkes综合征、嗜眠发作(narcolepsy)、神经纤维瘤病、Niemann-Pick病、苯丙酮尿症、Prader-Willi综合征、Refsum病、Rett综合征、脊髓性肌萎缩症、脊髓小脑性共济失调、Tangier病、Tay-Sachs病、结节性硬化症、Von Hippel-Lindau综合征、Williams综合征、Wilson病、Zellweger综合征、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、自闭症、双相障碍、抑郁、癫痫、偏头痛、多发性硬化症、脊髓病、阿尔茨海默氏症、杭廷顿症、帕金森症、或妥瑞氏症、CLN2病(诸如由TPP1缺陷引起的CLN2)、或粘多糖贮积病(诸如粘多糖贮积病I型(MPS I)或粘多糖贮积病II型(MPS II))。在一些实施方式中，参与神经系统疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于ALD、PS1(AD3)、PS2(AD4)、SOD1、UBE3A、ATM、PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、MFN2、KIF1B、RAB7A、LMNA、TRPV4、BSCL2、GARS、NEFL、HSPB1、GDAP1、HSPB8、MTMR2、SBF2、SH3TC2、NDRG1、PRX、FGD4、FIG4、DNM2、YARS、GJB1、PRPS1、CSA、CSB、Cx26、EPM2A、ETM1(FET1)、ETM2、FMR1、共济蛋白、GBA、HTT、HPRT1、BCKDH、ATP7A、ATP7B、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DRB1、NF1、NF2、SMPD1、NPC1、NPC2、LRRK2、PARK7、PINK1、PRKN、SNCA、UCHL1、PAH、PHYH、PEX7、MeCP2、SMN1、ATXN基因(如，ATXN1、ATXN2、等等)、ABC1、HEXA、TSC1、TSC2、VHL、CLIP2、ELN、GTF2I、GTF2IRD1、LIMK1、PXR1、TPP1、IDUA、和IDS，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是血液系统恶性肿瘤，并且药物组合物包括含有编码参与血液系统恶性肿瘤发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与血液系统恶性肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与血液系统恶性肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与血液系统恶性肿瘤发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于GLI1、CTNNB1、eIF5A、突变体DDX3X、Hexo激酶II、组蛋白甲基转移酶ΕZΗ2、ARK5、ALK、MUC1、HMGA2、IRF1、RPN13、HDAC11、Rad51、Spry2、mir-146a、mir-146b、存活蛋白(surviving)、MDM2、MCL1、CMYC，XBP1(剪接型和未剪接型)、SLAMF7、CS1、Erbb4、Cxcr4(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstroms macroglobulinemia))、Myc、Bcl2、Prdx1和Prdx2(伯基特淋巴瘤)、Bcl6、Idh1、Idh2、Smad、Ccnd2、细胞周期蛋白d1-2、B7-h1(pdl-1)和Pyk2，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是血液系统恶性肿瘤，其包括但不限于白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性髓细胞性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性骨髓性(粒细胞)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、B细胞淋巴瘤(诸如脾缘区淋巴瘤、结外边缘带B细胞淋巴瘤、节点边缘带B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、血浆淋巴瘤、原发性渗出淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)、T细胞和/或NK细胞淋巴瘤(诸如，成人T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤(blastic NK cell lymphoma)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、周围T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、和间变性大细胞淋巴瘤)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛性和高级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是病毒感染疾病，并且药物组合物包括含有编码参与病毒感染疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与病毒感染疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与病毒感染疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，病毒感染疾病的特征在于感染肝炎mRNA、人免疫缺陷mRNA(HIV)、小核糖核酸mRNA、脊髓灰质炎mRNA、肠道mRNA、人柯萨奇mRNA、流感mRNA、鼻mRNA、echomRNA、风疹mRNA(rubellan mRNA)、脑炎mRNA、狂犬病mRNA、疱疹mRNA、乳头瘤mRNA、多瘤mRNA、RSV、腺mRNA、黄热病mRNA、登革热mRNA、副流感mRNA、出血性mRNA、痘mRNA、水痘带状疱疹mRNA、副流感mRNA、呼肠孤mRNA、环状mRNA、轮状mRNA、细小mRNA、非洲猪瘟mRNA、麻疹、腮腺炎或Norwalk病毒。在一些实施方式中，病毒感染疾病的特征在于感染致癌病毒，该致癌病毒包括但不限于CMV、EBV、HBV、KSHV、HPV、MCV、HTLV-1、HIV-1和HCV。在一些实施方式中，编码病毒感染疾病发展和/或进展的一种或多种基因包括但不限于编码下列的基因：RSV核衣壳、Pre-gen/Pre-C、Pre-S1、Pre-S2/S,X、HBV保守序列、HIVGag多蛋白(p55)、HIV Pol多蛋白、HIV Gag-Pol前体(p160)、HIV基质蛋白(MA、p17)、HIV衣壳蛋白(CA、p24)、HIV间隔肽1(SP1、p2)、HIV核衣壳蛋白(NC、p9)、HIV间隔肽2(SP2、p1)、HIVP6蛋白质、HIV逆转录酶(RT、p50)、HIV RNA酶H(p15)、HIV整合酶(IN、p31)、HIV蛋白酶(PR、p10)、HIV Env(gp160)、gp120、gp41、HIV反式活化因子(Tat)、病毒体蛋白质表达的HIV调节子(Rev)、HIV慢病毒蛋白质R(Vpr)、HIV Vif、HIV阴性因子(Nef)、HIVmRNA蛋白质U(Vpu)、人CCR5、miR-122、EBOV聚合酶L、VP24、VP40、GP/sGP、VP30、VP35、NPC1、和TIM-1，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是自身免疫或炎性疾病或病症，并且药物组合物包括含有编码参与自身免疫或炎性疾病或病症发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与自身免疫或炎性疾病或病症发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与自身免疫或炎性疾病或病症发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，自身免疫或炎性疾病或病症是粉刺、过敏症(allergies)、过敏性反应(anaphylaxis)、哮喘、腹部疾病、憩室炎、肾小球肾炎、炎性肠道疾病、间质性膀胱炎、狼疮、耳炎、盆腔炎性疾病、类风湿性关节炎、结节病或脉管炎。在一些实施方式中，编码自身免疫或炎性疾病或病症发展和/或进展的蛋白质的一种或多种基因包括但不限于编码补体系统的分子(CD46、CD59、CFB、CFD、CFH、CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4、CFHR5、CFI、CFP、CR1、CR1L、CR2、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C8G、C9、ITGAM、ITGAX、和ITGB2)的基因，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是溶酶体贮积病，并且药物组合物包括含有编码参与溶酶体贮积病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与溶酶体贮积病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与溶酶体贮积病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，溶酶体贮积病是鞘脂类代谢障碍(Sphingolipidoses)(如，Farber病、Krabbe病(婴儿发作性、迟发性)、半乳糖唾液酸沉积症(galactosialidosis)、神经节苷脂沉积症(gangliosidoses)(如，Fabry病、Schindler病、GM1神经节苷脂沉积症(婴儿、幼年、成年/慢性)、GM2神经节苷脂沉积症(如，Sandhoff病(婴儿、幼年、成年发作)、Tay–Sachs))、Gaucher病(I型、II型、III型)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症(早发性、迟发性)、Niemann–Pick病(A型、B型)、硫脂类病(如，异染性脑白质营养不良(MLD)、多发性硫酸酯酶缺乏症))、粘多糖贮积症(如，MPS I Hurler综合征、MPS I SScheie综合征、MPS I H-S Hurler–Scheie综合征、II型(Hunter综合征)、III型(Sanfilippo综合征)、IV型(Morquio)、VI型(Maroteaux–Lamy综合征)、VII型(Sly综合征)、IX型(透明质酸酶缺乏症))、粘脂糖症(如、I型(唾液酸贮积病)、II型(I-细胞疾病)、III型(Pseudo-Hurler多营养不良/磷酸转移酶缺乏症)、IV型(Mucolipidin 1缺乏症))、脂质沉积症(如、Niemann–Pick病(C型、D型)、神经元蜡样脂褐质沉积症、Wolman病)、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰基葡糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、溶酶体运输疾病(如，胱氨酸贮积症、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、Salla病/唾液酸贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD))、胆固醇酯贮积病。在一些实施方式中，编码溶酶体贮积病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种基因包括但不限于编码下列的基因：神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶(A、B)、β-半乳糖苷酶、己糖胺酶A、鞘磷脂酶、溶酶体酸脂肪酶、鞘脂活化蛋白B(SaposinB)、硫酸酯酶、透明质酸酶、磷酸转移酶、Mucolipidin 1、天冬氨酰基氨基葡萄糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、胱氨酸病蛋白(cystinosin)、组织蛋白酶K(cathepsin K)、唾液酸转运蛋白(sialin)、SLC17A5、酸性α-葡萄糖苷酶、LAMP2，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是糖原贮积病，并且药物组合物包括含有编码参与糖原贮积病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与糖原贮积病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与糖原贮积病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，糖原贮积病是von Gierke病、Pompe病、Cori病或Forbes病、Andersen病、McArdle病、Hers病、Tarui病、Fanconi-Bickel综合征、或红细胞醛缩酶缺乏症。在一些实施方式中，编码参与糖原贮积病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种基因包括但不限于编码下列的基因：糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌肉糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白、GLUT2、醛缩酶A、和β-烯醇酶，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的病症特征在于异常胆固醇水平(诸如，异常高的LDL水平，如，约100mg/dL以上的LDL，和/或异常低的HDL水平，如，约40-50mg/dL以下的HDL)，包括如，家族性高胆固醇血症(诸如，纯合子家族性高胆固醇血症(HoFH))，和药物组合物包含含有编码参与胆固醇运输和/或代谢的蛋白质的一种或多种mRNA，其中蛋白质与参与胆固醇运输和/或代谢的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与胆固醇运输和/或代谢的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与胆固醇运输和/或代谢的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)、脱脂载脂蛋白B(ApoB)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)和PCSK9，包括其突变体。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒被用于活化或增加LDLR表达。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒被用于活化或增加ApoB表达。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒被用于活化或增加LDLRAP1表达。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi(诸如siRNA)，其中RNAi阻抑PCSK9表达。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是遗传疾病(诸如遗传性疾病)，并且药物组合物包括含有编码参与遗传疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与遗传疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与遗传疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，遗传疾病包括但不限于22q11.2缺失综合征、软骨发育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、Angelman综合征、常染色体显性多囊肾病、乳腺癌、Canavan病、Charcot–Marie–Tooth病、癌症、色盲、囊性纤维化、Duchenne肌营养不良症、Leiden因子V血栓形成倾向、家族性地中海热病、脆性X综合征、Gaucher病、血色素沉着症、血友病、杭廷顿氏舞蹈病、Marfan综合征、肌强直性营养不良、成骨不全、帕金森症疾病、苯丙酮尿症、多囊肾病、卟啉症、Prader–Willi综合征、早衰症、SCID、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、Tay–Sachs病、地中海贫血、三甲胺(Trimethylamine)和Wilson病。在一些实施方式中，参与遗传疾病发展和/或进展的基因包括但不限于AAT、ADA、ALAD、ALAS2、APC、ASPM、ATP7B、BDNF、BRCA1、BRCA2、CFTR、COL1A1、COL1A2、COMT、CNBP、CPOX、CREBBP、CRH、CRTAP、CXCR4、DHFR、DMD、DMPK、F5、FBN1、FECHFGFR3、FGR3、FIX、FVIII、FMO3、FMR1、GARS、GBA、HBB、HEXA、HFE、HMBS、HTT、IL2RG、KRT14、KRT5、LMNA、LRRK2、MEFV、MLH1、MSH2、MSH6、PAH、PARK2、PARK3、PARK7、PGL2、PHF8、PINK1、PKD1、PKD2、PMS1、PMS2、PPOX、RHO、SDHB、SDHC、SDHD、SMNI、SNCA、SRY、TSC1、TSC2、UCHL1、UROD、UROS、MEFV、APP、GAST、INS、LCK、LEP、LIF、MCM6、MYH7、MYOD1、NPPB、OSM、PKC、PIP、SLC18A2、TBX1、运甲状腺素蛋白、MDS1-EVI1、PRDM16、SETBP1、β-球蛋白质、和LPL，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是老化或退行性疾病，并且药物组合物包括含有编码参与老化或退行性疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与老化或退行性疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与老化或退行性疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与老化或退行性疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质包括但不限于角蛋白K6A、角蛋白K6B、角蛋白16、角蛋白17、p53、β-2肾上腺素受体(ADRB2)、TRPV1、VEGF、VEGFR、HIF-1、和胱天蛋白酶-2，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是纤维变性或炎性疾病，并且药物组合物包括含有编码参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒，其中蛋白质与参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的一种或多种基因对应。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含靶向参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的一种或多种基因的一种或多种RNAi。在一些实施方式中，参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的一种或多种基因编码蛋白质选自SPARC、CTGF、TGFβ1、TGFβ受体1、TGFβ受体2、TGFβ受体3、VEGF、血管紧张素II、TIMP、HSP47、血小板反应蛋白、CCN1、LOXL2、MMP2、MMP9、CCL2、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B、腺苷酰环化酶、Smad 3、Smad 4、Smad 7、SOX9、抑制蛋白、PDCD4、PAI-1、NF-κB、和PARP-1，包括其突变体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，药物组合物包含含有一种或多种mRNA和/或RNAi(诸如siRNA)的mRNA递送复合物或纳米颗粒，一种或多种mRNA和/或RNAi(诸如siRNA)调谐参与疾病或病症的一种或多种miRNA的表达。在一些实施方式中，mRNA递送复合物或纳米颗粒包含一种或多种miRNA，或将与一种或多种miRNA组合使用。在一些实施方式中，疾病或病症包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、多囊性肝和肾病、癌症、心血管疾病、心脏衰竭、心脏肥大、神经发育疾病、脆性X综合征、Rett综合征、Down综合征、阿尔茨海默氏症、杭廷顿氏舞蹈病、精神分裂症、炎性疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、和骨骼肌疾病。在一些实施方式中，一种或多种miRNA包括但不限于has-mir-126*、Has-miR-191、has-mir-205、has-mir-21、hsa-let-7a-2、let-7家族、let-7c、let-7f-1、miR-1、miR-100、miR-103、miR-103-1、miR-106b-25、miR-107、miR-10b、miR-112、miR-122、miR-125b、miR-125b-2、miR125bl、miR-126、miR-128a、mIR-132、miR-133、miR-133b、miR135、miR-140、miR-141、miR-142-3p、miR143、miR-143、miR145、miR-145、miR-146、miR-146b、miR150、miR-155、miR-15a、miR-15b、miR16、miR-16、miR-17-19家族、miR-173p、miR17-5p、miR-17-5p、miR-17-92、miR-181a、miR-181b、miR-184、miR-185、miR-189、miR-18a、miR-191、miR-192、miR-193a、miR-193b、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199、miR-199a、miR-19a、miR-19b-1、miR200a、miR-200a、miR-200b、miR200c、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-208、miR-20a、miR-21、miR-214、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-23、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-26a、miR-26b、miR-27b、miR-29、miR-298、miR-299-3p、miR-29c、miR-30a-5p、miR-30c、miR-30d、miR-30e-5p、miR31、miR-34、miR342、miR-381、miR-382、miR-383、miR-409-3p、miR-45、miR-61、miR-78、miR-802、miR-9、miR-92a-1、miR-99a、miR-let7、miR-let7a和miR-let7g。
在本文描述的方法的一些实施方式中，药物组合物通过静脉内、肿瘤内、动脉内、外部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内、或口服施用中任一种施用至个体。在一些实施方式中，药物组合物通过对流增强递送施用至个体。在一些实施方式中，药物组合物通过输液泵施用至个体。在一些实施方式中，药物组合物通过渗透泵施用至个体。在一些实施方式中，药物组合物是通过导管，诸如带有针的导管施用至个体。在一些实施方式中，药物组合物通过冠状动脉内局部药物递送导管施用至个体。
在本文描述的方法的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
细胞递送的方法
在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至细胞内的方法，包括：使细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含含有PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列的CPP。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触离体进行。在一些实施方式中，细胞与复合物或纳米颗粒的接触在体外进行。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞或天然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是源自外周血的T细胞、中央记忆T细胞、源自脐带血的T细胞、或造血干细胞或其它前体细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是T细胞，并且接触在活化T细胞后进行。在一些实施方式中，细胞是T细胞，并且接触在活化T细胞后进行至少12小时(如至少约12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、或更多中的任一个)。在一些实施方式中，T细胞使用抗CD3/CD28试剂(如微珠)活化。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，诸如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肌细胞。在一些实施方式中，细胞是心脏细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，诸如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗的疾病(如，癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、和老化和退行性疾病)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种RNAi。在一些实施方式中，RNAi可用于治疗疾病。
因此，在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至细胞内的方法，包括：使细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA和含有PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列的CPP。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白，例如，肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码CAR。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码多种蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码单一蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码第一蛋白质和第二蛋白质的单一mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi，诸如siRNA，诸如靶向内源性基因(如，疾病相关内源性基因)的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi，和蛋白质是可用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含治疗性mRNA和治疗性RNAi，其中治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)，和治疗性mRNA与内源性基因的治疗性形式对应(如，第二转基因编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或第二转基因导致蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是离体进行的。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体外进行的。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，诸如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，诸如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，诸如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，诸如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，诸如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，诸如，个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肌细胞。在一些实施方式中，细胞是心脏细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，诸如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗的疾病(如，癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、和老化和退行性疾病)。在一些实施方式中，mRNA可用于调谐参与疾病的蛋白质，如本文描述的任何待治疗的疾病(如，癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、和老化和退行性疾病)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或AGDN-106肽。
在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至T细胞内的方法，包括：使细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA和选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，使T细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，使T细胞与复合物或纳米颗粒接触是离体进行的。在一些实施方式中，使T细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体外进行的。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，诸如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，诸如个体的T细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，诸如本文描述的任何待治疗的疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种RNAi。在一些实施方式中，RNAi可用于治疗疾病。
在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至成纤维细胞内的方法，包括：使成纤维细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA和选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，使成纤维细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，使成纤维细胞与复合物或纳米颗粒接触是离体进行的。在一些实施方式中，使成纤维细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体外进行的。在一些实施方式中，成纤维细胞是永生化成纤维细胞，诸如来自成纤维细胞系的成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，诸如个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，诸如本文描述的任何待治疗的疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种RNAi。在一些实施方式中，RNAi可用于治疗疾病。
在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至肝细胞内的方法，包括：使肝细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA和选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，使肝细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，使肝细胞与复合物或纳米颗粒接触是离体进行的。在一些实施方式中，使肝细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体外进行的。在一些实施方式中，肝细胞是永生化肝细胞，诸如来自肝细胞系的肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，诸如个体的肝细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，诸如本文描述的任何待治疗的疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括一种或多种RNAi。在一些实施方式中，RNAi可用于治疗疾病。
在一些实施方式中，提供的是将一种或多种mRNA递送至个体的细胞内的方法，其包括向个体施用包含本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒的组合物，其中复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA和选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽的CPP。在一些实施方式中，组合物通过静脉内、动脉内、腹膜内、囊泡内、皮下、鞘内、颅内、脑内、脑室内、肺内、肌内、气管内、眼内、眼科、门静脉内、经皮、皮内、口服、舌下、外部、或吸入途径施用至个体。在一些实施方式中，组合物通过静脉内途径施用至个体。在一些实施方式中，组合物通过皮下途径施用至个体。在一些实施方式中，细胞存在于器官或组织中，该器官或组织包括肺、肝、脑、肾、心脏、脾、血液、胰腺、肌肉、骨髓和肠。在一些实施方式中，细胞存在于个体的肺、肝、肾或脾中。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，诸如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肌细胞。在一些实施方式中，细胞是心脏细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，个体具有或处于发生疾病的风险，和mRNA可用于治疗疾病。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi可用于治疗疾病。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是将转基因递送至细胞内的方法，其包括使细胞与本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒接触，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含包装在mRNA中的转基因和包含PEP-1肽、PEP-2肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽的氨基酸序列的CPP。在一些实施方式中，VEPEP-3肽包含SEQ ID NO:1-14、75和76中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-6肽包含SEQ ID NO:15-40和77中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，VEPEP-9肽包含SEQ ID NO:41-52和78中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，ADGN-100肽包含SEQ ID NO:53-70、79和80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，mRNA编码蛋白质，诸如治疗性蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码CAR。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码多种蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码单一蛋白质的多种mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含编码第一蛋白质和第二蛋白质的单一mRNA。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi，诸如siRNA，诸如靶向内源性基因(如，疾病相关内源性基因)的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，RNAi是靶向参与疾病或病症的内源性基因的治疗性RNAi，和蛋白质是可用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含治疗性mRNA和治疗性RNAi，其中治疗性RNAi靶向内源性基因的疾病相关形式(如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)，和治疗性mRNA与内源性基因的治疗性形式对应(如，第二转基因编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或第二转基因导致蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体内进行的。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是离体进行的。在一些实施方式中，使细胞与复合物或纳米颗粒接触是在体外进行的。在一些实施方式中，细胞是永生化细胞，诸如来自细胞系的细胞。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，诸如来自个体的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，诸如粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、或自然杀伤细胞。在一些实施方式中，T细胞是永生化T细胞，诸如来自T细胞系的T细胞。在一些实施方式中，T细胞是原代T细胞，诸如个体的T细胞。在一些实施方式中，细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞是原代成纤维细胞，诸如，个体的成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞是肌细胞。在一些实施方式中，细胞是心脏细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞是原代肝细胞，诸如个体的肝细胞。在一些实施方式中，细胞是人肺祖细胞(LPC)。在一些实施方式中，细胞是神经元细胞。在一些实施方式中，mRNA可用于治疗疾病，如本文描述的任何待治疗的疾病(如，癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、和老化和退行性疾病)。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi可用于调谐参与疾病的蛋白质，如本文描述的任何待治疗的疾病(如，癌症、糖尿病、自身免疫疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、和老化和退行性疾病)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是ADGN-100肽或VEPEP-3肽。
在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至对象内的方法，其中复合物或纳米颗粒靶向局部组织、器官或细胞。在一些实施方式中，局部组织、器官或细胞是疾病区域。在一些实施方式中，局部组织、器官或细胞不是疾病区域。在一些实施方式中，局部递送经由靶向部分介导。在一些实施方式中，局部递送经由细胞穿透肽介导。在一些实施方式中，局部递送经由局部施用介导。在一些实施方式中，局部递送经由本文描述的具体装置介导。在一些实施方式中，局部递送经由本文描述的机制组合介导。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体内，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白与肿瘤-阻抑基因对应。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL。在一些实施方式中，肿瘤阻抑基因选自PB1、TSC1、TSC2、BRCA1、BRCA2、PTEN和TP53。在一些实施方式中，一种或多种mRNA利用本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒进行递送。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白PTEN。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白PTEN通过人PTEN序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank如下登录号的序列：BC005821、JF268690、U92436、CR450306、AK024986、AK313581、U96180、和U93051和NM_000314。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA通过静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体内时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白p53。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白p53通过人TP53序列编码。在一些实施方式中，mRNA包括如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank如下登录号的序列：AF052180、NM_000546、AY429684、BT019622、AK223026、DQ186652、DQ186651、DQ186650、DQ186649、DQ186648、DQ263704、DQ286964、DQ191317、DQ401704、AF307851、AM076972、AM076971、AM076970、DQ485152、BC003596、DQ648887、DQ648886、DQ648885、DQ648884、AK225838、M14694、M14695、EF101869、EF101868、EF101867、X01405、AK312568、NM_001126117、NM_001126116、NM_001126115、NM_001126114、NM_001126113、NM_001126112、FJ207420、X60020、X60019、X60018、X60017、X60016、X60015、X60014、X60013、X60011、X60012、X60010、X02469、S66666、AB082923、NM_001126118、JN900492、NM_001276699、NM_001276698、NM_001276697、NM_001276761、NM_001276760、NM_001276696和NM_001276695。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白BRCA1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA1通过人BRCA1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：NM_007294、NM_007297、NM_007298、NM_007304、NM_007299、NM_007300、BC046142、BC062429、BC072418、AY354539、AY751490、BC085615、BC106746、BC106745、BC114511、BC115037、U14680、AK293762、U68041、BC030969、BC012577、AK316200、DQ363751、DQ333387、DQ333386、Y08864、JN686490、AB621825、BC038947、U64805和AF005068。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白BRCA2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白BRCA2通过人BRCA2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBIGenBank中如下登录号的序列：BC047568、NM_000059、DQ897648、BC026160。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白TSC1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC1通过人TSC1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC047772、NM_000368、BC070032、AB190910、BC108668、BC121000、NM_001162427、NM_001162426、D87683和AF013168。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白TSC2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白TSC2通过人TSC2序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC046929、BX647816、AK125096、NM_000548、AB210000、NM_001077183、BC150300、BC025364、NM_001114382、AK094152、AK299343、AK295728、AK295672、AK294548和X75621。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白视网膜母细胞瘤1(RB1)。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白RB1通过人RB1序列编码。在一些实施方式中，mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_000321、AY429568、AB208788、M19701、AK291258、L41870、AK307730、AK307125、AK300284、AK299179、M33647、M15400、M28419、BC039060、BC040540和AF043224。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的癌症的方法，包括将一种或多种RNAi(如，siRNA)施用至个体，其中RNAi(如，siRNA)包括靶向KRAS的RNAi(如，siRNA)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向KRAS的突变体形式。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)特异性地靶向KRAS的突变体形式，但是不靶向KRAS的野生型。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含以下中的一个或多个序列：5’-GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:83)、5’-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3(反义)(SEQ ID NO:84)、5’-GAAGUGCAUACACCGAGACTT-3’(有义)(SEQ ID NO:86)、5’-GUCUCGGUGUAGCACUUCTT-3’(反义)(SEQ ID NO:87)、5’-GUUGGAGCUGUUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:88)和/或5'-CUACGCCAACAGCUCCAACTT-3’(反义)(SEQ ID NO:89)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含选自具有SEQ ID NO:83,84,86-89的序列的核酸序列。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，RNAi静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体内时，RNAi与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，RNAi约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的RNAi的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的RNAi的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体的疾病或病症的方法，包括将一种或多种mRNA施用至个体内，其中mRNA编码治疗性蛋白或其重组体形式。在一些实施方式中，治疗性蛋白选自α1抗胰蛋白酶、共济蛋白、胰岛素、生长激素(促生长素)、生长因子、激素、肌养蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF1)、因子VIII、因子IX、抗凝血酶III、蛋白质C、β-葡糖脑苷脂酶、葡萄糖苷酶-α、α-l-艾杜糖苷酸梅、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶、人α-半乳糖苷酶A、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰酶(包括脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)、腺苷脱氨酶和白蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白是因子VIII。在一些实施方式中，治疗性蛋白静脉内或皮下施用。在一些实施方式中，mRNA静脉内或皮下递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA以约或小于一周一次、每两周一次、每三周一次或一个月一次的频率递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
靶向部分
在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至对象内的方法，其中复合物或纳米颗粒经由靶向部分靶向局部组织、器官或细胞。在一些实施方式中，本文描述的mRNA递送复合物或纳米颗粒包含细胞穿透肽，其中细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，本文描述的靶向部分将mRNA递送复合物靶向至组织或具体的细胞类型。在一些实施方式中，组织是需要治疗的组织。在一些实施方式中，靶向部分将mRNA递送复合物靶向可以通过mRNA治疗的组织或细胞。在一些实施方式中，表面层中的至少一些周围细胞穿透肽与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，共价键通过化学偶联。在一些实施方式中，共价键通过遗传方法。
细胞穿透肽
在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包含细胞穿透肽，其中细胞穿透肽优先靶向对象中的具体组织、器官或细胞。
局部施用
在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至对象内的方法，其中复合物或纳米颗粒经由选自以下的途径施用至对象：腹膜内、囊泡内、皮下、鞘内、颅内、冠状动脉内、脑内、脑室内、肺内、肌内、气管内(如，经由非外科气管内，如，经由雾化或滴注)、眼内、眼科、门静脉内、经皮、皮内、口服、舌下、外部或吸入途径。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至对象内的方法，其中复合物或纳米颗粒经由外部途径施用至个体。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至对象内的方法，其中复合物或纳米颗粒经由全身途径施用至个体(如，静脉内)。
在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒通过具有针(诸如，可展开的针)的导管施用至对象中，其中针含有复合物或纳米颗粒。例如，携带能够将治疗剂和其他药剂深递送至血管腔周围的外膜层的针的导管已经在美国专利号6,547,303、6,860,867和美国专利申请公开号2007/0106257、201010305546和200910142306中描述，其中这些中每篇的内容通过引用以其全部具体地并入本文。在一些实施方式中，针是可展开的。导管可血管内推进至血管内的目标注射部位(其可能是或可能不是疾病区域)。导管中的针被推进通过血管壁，以便在期望的区域(例如，血管周围区域)中定位针上的孔，并且可以通过针的孔将复合物或纳米颗粒组合物注射至期望的区域。
例如，在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至血管，其中方法包括将有效量的包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒(例如，经由具有针的导管)注射至血管壁周围的组织内。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白，例如，肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送至血管，其中方法包括将有效量的包含mRNA和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒(例如，经由具有针的导管)注射至血管壁周围的组织内，其中复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因，例如，疾病相关内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，在疾病部位处注射复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，在疾病部位远端注射复合物或纳米颗粒(诸如，远离疾病部位至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10cm中的任一个)。
在一些实施方式中，将复合物或纳米颗粒注射至血管的外膜组织中。外膜组织是血管周围的组织，例如，动脉外弹性层以外或静脉中膜以外的组织。外膜具有高浓度的脂质。在一些实施方式中，将复合物或纳米颗粒注射到外膜血管滋养管区域中。在一些实施方式中，在注射后，复合物或纳米颗粒可以相对于被注射复合物或纳米颗粒的血管的轴线从注射部位沿周向、纵向和/或透壁地分散通过外膜(本文以下称为“体积分布”)。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒在不超过60分钟的时间段内从注射部位纵向分布跨越至少约1cm的距离(例如至少约2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、或更多中的任一个)和/或径向分布跨越至少1cm(例如至少约2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、或更多中的任一个)。在一些实施方式中，在距离递送部位至少2cm的所有位置处测量的复合物或纳米颗粒的浓度为递送部位处浓度的至少10％(诸如至少约20％、30％、40％、或50％中的任一个)，例如在60分钟的时间段后。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒透壁分布在整个血管、介质和肌肉层的内皮和内膜层。
因此，在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含含有mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒的组合物(例如经由具有针的导管)注射至血管壁的外膜组织中。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒(例如经由具有针的导管)注射至血管的外膜组织中，其中复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因，例如，疾病相关内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含含有mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒的组合物(例如经由具有针的导管)注射至血管壁的外膜组织中，其中纳米颗粒的平均大小小于200nm。在一些实施方式中，在疾病部位处或附近(诸如，远离疾病部位不大于约2、1或0.5cm)注射复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，从疾病部位远程注射复合物或纳米颗粒(诸如远离疾病部位至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10cm中的任一个)。在一些实施方式中，注射后，纳米颗粒组合物实现体积分布。
在一些实施方式中描述的血管是动脉，诸如冠状动脉或周围动脉。在一些实施方式中，动脉选自肾动脉、脑动脉、肺动脉和腿中的动脉。在一些实施方式中，血管是膝盖以上的动脉或静脉。在一些实施方式中，血管是膝盖以下的动脉或静脉。在一些实施方式中，血管是股动脉。在一些实施方式中，血管是球囊损伤动脉。
在一些实施方式中，血管是选自以下中任一个的动脉：腹主动脉、胫前动脉、主动脉弓、弓状动脉、腋动脉、肱动脉、颈动脉、腹腔动脉、旋腓骨动脉、肝总动脉、髂总动脉、股深动脉、深掌动脉弓、指背动脉、跖背动脉、颈外动脉、髂外动脉、面动脉、股动脉、肠系膜下动脉、髂内动脉、肠动脉、膝下外侧动脉、膝上外侧动脉、掌指动脉、腓动脉、腘动脉、胫后动脉、股深动脉、肺动脉、桡动脉、肾动脉、脾动脉、锁骨下动脉、掌浅动脉弓、肠系膜上动脉、尺侧上副动脉和尺动脉。
在一些实施方式中，血管是静脉。在一些实施方式中，血管是选自以下中任一个的静脉：副头静脉、腋静脉、贵要静脉、臂静脉、头静脉、髂总静脉、指背静脉、跖背静脉、髂外静脉、面静脉、股静脉、大隐静脉、肝静脉、肠系膜下静脉、下腔静脉、前臂中静脉、髂内静脉、肠静脉，颈静脉、旋股外侧静脉、左下肺静脉、左上肺静脉、掌指静脉、门静脉、胫后静脉、肾静脉、下颌后静脉、隐静脉、小隐静脉、脾静脉、锁骨下静脉、肠系膜上静脉和上腔静脉。
在一些实施方式中，血管是冠状血管(包括动脉和静脉血管)、脑血管、肝血管、周围血管以及其他器官和组织室的血管系统的一部分。
在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒(例如，经由具有针的导管)外膜周围地注射(即，注射入外模周围组织)至股动脉。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒(例如，经由具有针的导管)注射至血管的外模周围组织，其中复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因，例如，疾病相关内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，提供的是将包含mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒递送至血管的方法，其中方法包括将有效量的包含含有mRNA和CPP的复合物或纳米颗粒的组合物(例如，经由具有针的导管)注射至血管壁的外模周围组织，其中纳米颗粒的平均大小小于200nm。在一些实施方式中，在疾病部位处或附近(诸如，远离疾病部位不大于约2、1或0.5cm)注射复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，从疾病部位远程注射复合物或纳米颗粒(诸如远离疾病部位至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10cm中的任一个)。在一些实施方式中，注射后，纳米颗粒组合物实现体积分布。
本文描述的递送方法在抑制血管异常的一个或多个方面中有效，包括例如，负重塑、血管纤维化、再狭窄、血管中细胞的细胞增殖和迁移以及伤口愈合。在一些实施方式中，方法在促进血管的正重塑中有效。
细胞工程化的方法
在一些实施方式中，提供了生产工程化细胞(诸如工程化T细胞)的方法，包括本文描述的用于将一种或多种mRNA递送至细胞内的方法。在一些实施方式中，方法是对先前生产工程化细胞的方法(诸如涉及使用电穿孔或非CPP介导的病毒转染的方法)的改进。在一些实施方式中，改进包括但不限于提高方法的效率、降低与方法相关的成本、降低方法的细胞毒性和/或降低方法的复杂性。
应该理解，本文所描述的任何方法都可以组合。因此，例如，可以通过组合本文所描述的用于将多个mRNA分子递送到细胞中的任何方法，将第一组一种或多种mRNA和第二组一种或多种mRNA递送到细胞中。考虑的可能组合包括本文描述的任何方法中的两种或更多种的组合。
组合疗法
A.mRNA和RNAi(如，siRNA)的组合疗法
本文还提供的是用于治疗个体中本文讨论的疾病或病症的组合疗法，包括a)将本文描述的mRNA递送至个体，和b)将本文描述的RNAi(如，siRNA)递送至个体。例如，提供的是治疗个体中疾病或病症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，疾病或病症是癌症(如，胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、成胶质母细胞瘤)。在一些实施方式中，个体具有肿瘤阻抑蛋白和/或癌基因蛋白质中的畸变。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白选自PTEN(即，由PTEN基因编码的蛋白质)和p53(即，p53肿瘤-阻抑蛋白)。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，siRNA特异性靶向KRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式具有选自G12C、G12D和Q61K的KRAS畸变。在一些实施方式中，siRNA包括含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRASG12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选的实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，mRNA和/或siRNA与相同的细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，mRNA和/或siRNA与不同的细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，mRNA和/或siRNA单独与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRASG12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发(concurrently)递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRASG12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，mRNA包括如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中的如下登录号的序列BC005821、JF268690、U92436、CR450306、AK024986、AK313581、U96180、和U93051和NM_000314。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是p53，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是p53，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是抑制个体中癌症转移的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRASG12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是抑制个体中癌症转移的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，提供的是抑制个体中癌症转移的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，提供的是抑制个体中癌症转移的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是抑制个体中胰腺癌转移的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中肿瘤阻抑蛋白是PTEN，和其中癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRASG12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白PTEN的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包括如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中的如下登录号的序列：BC005821、JF268690、U92436、CR450306、AK024986、AK313581、U96180、和U93051和NM_000314。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRASG12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白p53的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包括如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中的如下登录号的序列：AF052180、NM_000546、AY429684、BT019622、AK223026、DQ186652、DQ186651、DQ186650、DQ186649、DQ186648、DQ263704、DQ286964、DQ191317、DQ401704、AF307851、AM076972、AM076971、AM076970、DQ485152、BC003596、DQ648887、DQ648886、DQ648885、DQ648884、AK225838、M14694、M14695、EF101869、EF101868、EF101867、X01405、AK312568、NM_001126117、NM_001126116、NM_001126115、NM_001126114、NM_001126113、NM_001126112、FJ207420、X60020、X60019、X60018、X60017、X60016、X60015、X60014、X60013、X60011、X60012、X60010、X02469、S66666、AB082923、NM_001126118、JN900492、NM_001276699、NM_001276698、NM_001276697、NM_001276761、NM_001276760、NM_001276696和and NM_001276695。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白BRCA1的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_007294、NM_007297、NM_007298、NM_007304、NM_007299、NM_007300、BC046142、BC062429、BC072418、AY354539、AY751490、BC085615、BC106746、BC106745、BC114511、BC115037、U14680、AK293762、U68041、BC030969、BC012577、AK316200、DQ363751、DQ333387、DQ333386、Y08864、JN686490、AB621825、BC038947、U64805和AF005068。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白BRCA2的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC047568、NM_000059、DQ897648、BC026160。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白TSC1的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC047772、NM_000368、BC070032、AB190910、BC108668、BC121000、NM_001162427、NM_001162426、D87683和AF013168。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白TSC2的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：BC046929、BX647816、AK125096、NM_000548、AB210000、NM_001077183、BC150300、BC025364、NM_001114382、AK094152、AK299343、AK295728、AK295672、AK294548和X75621。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白视网膜母细胞瘤1(RB1)的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中mRNA包含如此序列，所述序列选自具有NCBI GenBank中如下登录号的序列：NM_000321、AY429568、AB208788、M19701、AK291258、L41870、AK307730、AK307125、AK300284、AK299179、M33647、M15400、M28419、BC039060、BC040540和AF043224。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中胰腺癌的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中siRNA靶向KRAS的突变体形式。在一些实施方式中，siRNA特异性靶向KRAS的突变体形式但是不靶向KRAS的野生型形式。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变包含KRAS的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12S、G12V、G13C、G13S、G13R、G13A、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61E、Q61K、Q61L、Q61R、Q61P、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。在一些实施方式中，该突变体形式包含KRAS畸变，其中KRAS畸变选自KRAS G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P和Q61R。在一些实施方式中，KRAS畸变选自KRAS G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和G12D。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12D和Q61K。在一些实施方式中，KRAS畸变包含G12C、G12D和Q61K。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含以下的一个或多种序列：5’-GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:83)、5’-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3(反义)(SEQ ID NO:84)、5’-GAAGUGCAUACACCGAGACTT-3’(有义)(SEQ ID NO:86)、5’-GUCUCGGUGUAGCACUUCTT-3’(反义)(SEQ ID NO:87)、5’-GUUGGAGCUGUUGGCGUAGTT-3’(有义)(SEQ ID NO:88)和/或5'-CUACGCCAACAGCUCCAACTT-3’(反义)(SEQ ID NO:89)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)包含选自具有SEQ ID NO:83、84、86-89的序列的核酸序列。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)包含与第一细胞穿透肽复合的编码肿瘤阻抑基因的mRNA(如，编码PTEN或p53)的mRNA递送复合物和b)包含与第二细胞穿透肽复合的RNAi(如，靶向癌基因(诸如KRAS的突变体形式)的siRNA)的RNAi递送复合物递送至个体。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
B.两种或更多种mRNA的组合疗法
本文还提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的组合疗法，包括将a)第一mRNA(如，编码第一治疗性蛋白的第一mRNA)和b)第二mRNA(如，编码第二治疗性蛋白(如，第二肿瘤阻抑蛋白)的第二mRNA)递送至个体。在一些实施方式中，第一治疗性蛋白是肿瘤阻抑蛋白(如，PTEN，PTEN基因编码的蛋白质)。在一些实施方式中，第二治疗性蛋白是第二肿瘤阻抑蛋白(如，p53肿瘤-阻抑蛋白)。在一些实施方式中，个体具有第一或第二肿瘤阻抑蛋白中的畸变。在一些实施方式中，当被递送至个体时，第一mRNA和/或第二mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体时，第一mRNA和第二mRNA与相同的细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体时，第一mRNA和第二mRNA与不同的细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，当被递送至个体时，第一mRNA和第二mRNA分开地与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA被修饰(如，其中至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码第一肿瘤阻抑蛋白的第一mRNA和b)编码第二肿瘤阻抑蛋白的第二mRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA编码第一肿瘤阻抑蛋白和/或第二肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，个体具有第一和/或第二肿瘤阻抑蛋白中的畸变。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，第一mRNA和/或第二mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:15-40(如，SEQ ID NO:77)的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:53-70(如，SEQ ID NO 79或80)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或第二mRNA(如，编码TP53的mRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的第一mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA(如，编码TP53的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA(如，编码TP53的mRNA)的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA静脉内或皮下施用。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)编码PTEN的第一mRNA和b)编码p53的第二mRNA递送至个体。在一些实施方式中，当被递送至个体中时，第一mRNA和/或第二mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:15-40(如，SEQ ID NO:77)的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:53-70(如，SEQ ID NO 79或80)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的第一mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA静脉内或皮下施用。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)包含与第一细胞穿透肽复合的第一mRNA的第一mRNA递送复合物(其中第一mRNA编码PTEN)；和b)包含与第二细胞穿透肽复合的第二mRNA的第二mRNA递送复合物(其中第二mRNA编码p53)递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包含SEQ ID NO:15-40(如，SEQ ID NO:77)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一或第二细胞穿透肽包含SEQ ID NO:53-70(如，SEQ ID NO 79或80)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的第一mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA静脉内或皮下施用.
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将包括a)第一mRNA(其中第一mRNA编码PTEN)；b)第二mRNA(其中第二mRNA编码p53)；和c)细胞穿透肽的mRNA递送复合物递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括SEQ ID NO:15-40(如，SEQID NO:77)的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQ ID NO:53-70(如，SEQID NO 79或80)的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的第一mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约50mg/kg(如，约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约1mg/kg、约0.5mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的第二mRNA的剂量为约0.003mg/m2至约150mg/m2(如，约0.03mg/m2至约30mg/m2、约0.3mg/m2至约3mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，第一mRNA和/或第二mRNA静脉内或皮下施用。
C.mRNA和/或RNAi(如，siRNA)与另一药剂的组合疗法
本文还提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的组合疗法，包括将a)本文描述的mRNA和/或RNAi(如siRNA)、b)第二药剂递送至个体。在一些实施方式中，第二药剂包括本文描述的纳米颗粒组合物。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白，如，人血清白蛋白)。在一些实施方式中，紫杉烷是太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，另一种药剂是nab-太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，mTOR抑制剂是雷帕霉素。在一些实施方式中，另一种药剂是nab-雷帕霉素。在一些实施方式中，方法进一步包括施用化疗药剂(如，吉西他滨)。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，和b)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白与肿瘤肿瘤-阻抑基因对应。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL。在一些实施方式中，肿瘤阻抑基因选自PB1、TSC1、TSC2、BRCA1、BRCA2、PTEN和TP53。在一些实施方式中，癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中的紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)被载体蛋白(如，白蛋白)包被。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)靶向癌基因(如，KRAS)的RNAi(如，siRNA)，和b)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS的突变体形式包含G12D KRAS和/或G12C KRAS。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，当被递送至个体时，siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，b)靶向癌基因(如，KRAS)的RNAi(如，siRNA)和c)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白与肿瘤-阻抑基因对应。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL。在一些实施方式中，肿瘤阻抑基因选自PB1、TSC1、TSC2、BRCA1、BRCA2、PTEN和TP53。在一些实施方式中，癌症选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS的突变体形式包含G12D KRAS和/或G12C KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，和b)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN或p53。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)靶向癌基因(如，KRAS)的RNAi(如，siRNA)，和b)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS的突变体形式包含G12D KRAS和/或G12C KRAS。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，当被递送至个体时，siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，b)靶向癌基因(如，KRAS)的siRNA，和c)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN或p53。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS的突变体形式包含G12D KRAS和/或G12C KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，b)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物，和c)有效量的吉西他滨递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN或p53。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，mRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当递送至个体中时，mRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA约每周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，b)靶向癌基因(如，KRAS)的RNAi(如，siRNA)，c)包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物，和d)有效量的吉西他滨递送至个体。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN或p53。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，KRAS的突变体形式包含G12D KRAS和/或G12CKRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约40mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的纳米颗粒的平均直径不大于200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)包被有载体蛋白(如，白蛋白)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中载体蛋白(如，白蛋白)与紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的重量比为约9：1或更小。在一些实施方式中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量为约10mg/m2至约50mg/m2。
D.mRNA复合物/纳米颗粒与另一种药剂的组合疗法
还提供的是治疗疾病或病症的方法，包括将a)本文描述的包含mRNA和细胞穿透肽(CPP)的复合物或纳米颗粒，和b)另一种药剂递送至对象内。在一些实施方式中，mRNA编码治疗性蛋白，例如，肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码PTEN或p53。在一些实施方式中，CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包含RNAi(诸如siRNA)。在一些实施方式中，RNAi靶向内源性基因，如，疾病相关内源性基因。在一些实施方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，疾病相关内源性基因是KRAS。在一些实施方式中，另一种药剂是本文所描述的包含紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)和载体蛋白(如，白蛋白)的纳米颗粒组合物。在一些实施方式中，另一种药剂进一步包含化疗药剂(如，吉西他滨)。在一些实施方式中，另一种药剂是nab-太平洋紫杉醇。在一些实施方式中，疾病或病症是癌症。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，mRNA被修饰(如，其中至少一个修饰的核苷是5-甲氧基尿苷(5moU))。
还提供的是治疗疾病或病症的方法，包括将a)本文描述的包含mRNA(如，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，如，编码PTEN或p53的mRNA)和细胞穿透肽(CPP)的复合物或纳米颗粒，和b)本文描述的包含RNAi和CPP的复合物或纳米颗粒递送至对象内。在一些实施方式中，RNAi是siRNA或miRNA(如，靶向癌基因的siRNA，如，靶向KRAS的siRNA)。在一些实施方式中，RNAi是靶向疾病相关内源性基因或外源性基因的治疗性RNAi。在一些实施方式中，mRNA复合物或纳米颗粒与RNAi复合物或纳米颗粒同时递送。在一些实施方式中，mRNA复合物或纳米颗粒与RNAi复合物或纳米颗粒并发递送。在一些实施方式中，mRNA复合物或纳米颗粒与RNAi复合物或纳米颗粒顺序递送。在一些实施方式中，mRNA复合物或纳米颗粒多次递送至对象内。在一些实施方式中，RNAi复合物或纳米颗粒多次递送至对象内。
在一些实施方式中，提供的是治疗疾病或病症的方法，包括将本文描述的包含a)mRNA；b)RNAi和c)细胞穿透肽(CPP)的复合物或纳米颗粒递送至对象内。在一些实施方式中，RNAi是siRNA。在一些实施方式中，RNAi是miRNA。在一些实施方式中，RNAi靶向疾病相关内源性或外源性基因。
E.两种或更多种RNAi的组合疗法
还提供的是治疗疾病或病症的方法，包括将两种或更多种RNAi(如，两种或更多种siRNA)递送至对象内。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA与本文描述的细胞穿透肽(CPP)复合。在一些实施方式中，CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。在一些实施方式中，siRNA靶向一种或多种癌基因。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，siRNA特异性靶向kRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式具有选自G12C、G12D和Q61K的KRAS畸变。在一些实施方式中，siRNA包含含有两种或更多种siRNA的siRNA的混合物。在一些实施方式中，两种或更多种siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA。示例性两种或更多种siRNA包括但不限于a)靶向KRAS G12C和KRAS G12D的siRNA；b)靶向KRAS G12C和KRAS Q61K的siRNA；c)靶向KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA；和d)靶向KRAS G12C、KRAS G12D和KRAS Q61K的siRNA。在一个优选实施方式中，第一siRNA靶向KRAS G12C，和第二siRNA靶向KRAS G12D。在一些实施方式中，疾病或病症是癌症。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。
在一些实施方式中，提供的是治疗癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将包含a)靶向第一基因的第一RNAi(如，第一siRNA)，b)靶向第二基因的第二RNAi(如，第二siRNA)，和c)细胞穿透肽的RNAi递送复合物递送至对象内；其中第一RNAi和/或第二RNAi与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，对象包含第一基因和/或第二基因中的畸变。在一些实施方式中，第一基因和/或第二基因是癌基因(如，KRAS)。在一些实施方式中，CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。
在一些实施方式中，提供的是治疗癌症(如，胰腺癌)的方法，包括将包含a)靶向KRAS G12C的第一RNAi(如，第一siRNA)，b)靶向KRAS G12D的第二RNAi(如，第二siRNA)，和c)细胞穿透肽的RNAi递送复合物递送至对象内；其中第一RNAi和/或第二RNAi与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，对象包括KRAS中的一个或多个畸变。在一些实施方式中，CPP是VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽或ADGN-100肽。在一些实施方式中，RNAi递送复合物进一步包含靶向KRAS Q61K的第三RNAi(如，第三siRNA)。
施用组合疗法的给药和方法
在一些实施方式中，mRNA/RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂(如，吉西他滨)同时施用。在一些实施方式中，mRNA/RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂(如，吉西他滨)顺序施用。在一些实施方式中，mRNA/RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂(如，吉西他滨)并发施用。
基于主治医师的判断，可以在治疗过程中调整mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂的给药频率。当分开施用时，mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂可以以不同的给药频率或间隔施用。在一些实施方式中，可以使用mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂的持续释放制剂。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。也可以使用本文所描述的施用配置的组合。
可以使用相同的施用途径或不同的施用途径来施用mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂。
在一些实施方式中，本文描述的mRNA或RNAi(如，siRNA)或mRNA递送复合物或RNAi递送复合物配制用于全身或局部施用。在一些实施方式中，mRNA或RNAi(如，siRNA)或mRNA递送复合物或RNAi递送复合物配制用于静脉内、肿瘤内、动脉内、外部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内或口服施用。
在一些实施方式中，用于治疗人或哺乳动物对象的mRNA和/或RNAi(如，siRNA)的剂量范围为每次施用约0.001mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方式中，mRNA(如，PTEN mRNA和/或p53 mRNA)的示例性剂量为个体中每次施用约0.005mg/kg至约0.5mg/kg(如，约0.01mg/kg至约0.05mg/kg、约0.02mg/kg至约0.04mg/kg)。在一些实施方式中，RNAi(如，KRAS siRNA)的示例性剂量为个体中每次施用约0.005mg/kg至约0.5mg/kg(如，约0.01mg/kg至约0.1mg/kg，如，约0.3mg/kg至约0.5mg/kg、如，约0.04mg/kg)。在一些实施方式中，个体是人类。
在一些实施方式中，用于治疗人或哺乳动物对象的mRNA和/或RNAi(如，siRNA)的剂量范围为每次施用约0.03mg/m2至约4000mg/m2。在一些实施方式中，mRNA(如，PTEN mRNA和/或p53 mRNA)的示例性剂量为个体中每次施用约0.01mg/m2至约20mg/m2(如，约0.2mg/m2至约2mg/m2、约0.5mg/m2至约1.5mg/m2)。在一些实施方式中，RNAi(如，KRAS siRNA)的示例性剂量为个体中每次施用约0.2mg/m2至约20mg/m2(如，约0.4mg/m2至约4mg/m2，如，约1mg/m2至约20mg/m2，如，约1.5mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人类。
mRNA和/或RNAi的示例性给药频率包括但不限于每周一次不间断；每周一次，四周三次；每三周一次；每两周一次；每周一次，三周两次。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi(如，siRNA)被施用约每两周一次、每三周一次、每四周一次、每六周一次或每八周一次。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi(如，siRNA)被施用至少约1×、2×、3×、4×、5×、6×、或7×(即，每天)/周中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔大于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或12个月中的任一个。在一些实施方式中，给药进度方案中无间断。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔不长于约一周。在一些实施方式中，施用mRNA和/或RNAi(如，siRNA)至个体的进度方案的范围是从单次施用构成整个治疗至每日施用。mRNA和/或RNAi(如，siRNA)的施用可在延长时期内延续，如约1个月上至约7年。在一些实施方式中，mRNA和/或RNAi(如，siRNA)在至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72或84个月中的任一个的时段内被施用。
mRNA、RNAi、紫杉烷和/或化疗药剂所需的剂量可能(但不一定)低于单独施用每种药剂时通常所需的剂量。因此，在一些实施方式中，施用亚治疗量的mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂。“亚治疗量”或“亚治疗水平”是指小于治疗量的量，即小于当单独施用纳米颗粒组合物中的药物和/或另一种药剂时正常使用的量。降低可以在以给定施用下施用的量和/或在给定时间段内施用的量的方面反映(降低的频率)。
在一些实施方式中，与单独施用mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物中紫杉烷和/或化疗药剂的对应的正常剂量相比，每种的剂量都被降低。在一些实施方式中，mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂以亚治疗(即，降低的)水平施用。在一些实施方式中，mRNA、RNAi、纳米颗粒组合物和/或化疗药剂的剂量基本上小于既定的最大毒性剂量。例如，纳米颗粒组合物和/或另一种药剂的剂量小于MTD的约50％、40％、30％、20％或10％。
可以使用本文所描述的施用配置的组合。本文所描述的组合疗法可以单独进行或与另一种疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法、基因疗法、免疫疗法、化学免疫疗法、基于肝动脉的疗法、冷冻疗法、超声波疗法、肝脏移植、局部消融疗法、射频消融疗法、光动力疗法等组合进行。另外，具有发展癌症(如，胰腺癌)的更大风险的人可接受治疗以抑制或和/或延缓疾病发展。
纳米颗粒组合物
施用至个体(诸如人)的纳米颗粒组合物的剂量可以根据具体组合物、施用方式和被治疗的胰腺癌的类型改变。在一些实施方式中，组合物的量有效导致客观应答(诸如，部分应答、完全应答或稳定疾病)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物的量足以导致个体中的完全应答。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物的量足以导致个体中的部分应答。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物的量有效导致个体中的稳定疾病(即，胰腺癌)。在一些实施方式中，施用(例如当单独施用时)的纳米颗粒组合物的量足以产生利用纳米颗粒组合物治疗的个体群体中超过约25％、30％、32％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、65％或70％中任一个的总应答率。个体对本文描述的治疗方法的应答可以例如基于RECIST水平进行确定。
在一些实施方式中，组合物的量足以延长个体的无进展生存力。在一些实施方式中，组合物的量足以延长个体的总生存力。在一些实施方式中，(例如当单独施用时)组合物的量足以产生利用纳米颗粒组合物治疗的个体群体中超过约25％、30％、32％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、60％、65％或70％中任一个的临床益处。
在一些实施方式中，组合物、第一疗法、第二疗法或组合疗法的量为与治疗之前相同对象中对应的肿瘤大小、胰腺癌细胞的数目或肿瘤生长速率相比，或与未接受治疗的其他对象中的对应活性相比，足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中任一个的量。可以使用标准方法测量该效果的量级，诸如利用纯化酶的体外试验、基于细胞的试验、动物模型或人测试。
在一些实施方式中，组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的量低于诱导毒理作用(即，在临床可接受的毒性水平之上的作用)的水平，或处于当将组合物施用于个体时，可以控制或耐受潜在的副作用的水平。
在一些实施方式中，遵循相同的给药方案，组合物的量接近组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施方式中，组合物的量大于MTD的约80％、90％、95％或98％中的任一个。
纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的示例性有效量包括但不限于每次施用约1mg/m2至150mg/m2的紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)。
施用纳米颗粒组合物的示例性给药频率包括但不限于每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次不间断、四周三次、每三周一次、每两周一次或三周两次。在一些实施方式中，组合物被施用约每两周一次、每三周一次、每四周一次、每六周一次或每八周一次。在一些实施方式中，组合物被施用至少约1×、2×、3×、4×、5×、6×、或7×(即，每天)/周中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔小于约6个月、3个月、1个月、28天、20天、15天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天中的任一个。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔大于约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月或12个月中的任一个。在一些实施方式中，给药进度方案中无间断。在一些实施方式中，每次施用之间的间隔不长于约一周。
在一些实施方式中，给药频率为每两天一次，进行一次、进行两次、进行三次、进行四次、进行五次、进行六次、进行七次、进行八次、进行九次、进行十次和进行十一次。在一些实施方式中，给药频率是每两天一次，进行五次。在一些实施方式中，紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)在至少十天的时间段内施用，其中每次施用之间的间隔不超过约两天，和其中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)每次施用的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。
在一些实施方式中，紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)在28天周期的第1天、第8天和第15天施用，其中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)每次施用的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)在28天周期的第1天、第8天和第15天在30分钟内静脉内施用，其中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)每次施用的剂量为约1mg/m2至约150mg/m2。在一些实施方式中，紫杉烷是太平洋紫杉醇。
组合物的使用可以在延长时期内延续，诸如约1个月上至约7年。在一些实施方式中，组合物可以在至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72或84个月中的任一个的时间段内施用。
在一些实施方式中，当按照每周进度方案给予时，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)或mTOR抑制剂(如，雷帕霉素)的剂量范围可以为5-150mg/m2(诸如80-150mg/m2，例如100-120mg/m2)。
施用纳米颗粒组合物(如，太平洋紫杉醇/白蛋白纳米颗粒组合物)的其他示例性给药进度方案包括但不限于100mg/m2，每周一次无中断；75mg/m2，每周一次，四周三次；100mg/m2，每周一次，四周三次；125mg/m2，每周一次，四周三次；125mg/m2，每周一次，三周两次；130mg/m2，每周一次无中断；和20-150mg/m2，每周两次。组合物的给药频率可以基于主治医生的判断在治疗过程中进行调整。
在一些实施方式中，治疗个体持续至少约一、二、三、四、五、六、七、八、九、或十个治疗周期。
本文所描述的组合物允许在短于约24小时的输注时间内向个体输注组合物。例如，在一些实施方式中，该组合物在少于约24小时、12小时、8小时、5小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟、或10分钟中的任一个的输注期内施用。在一些实施方式中，组合物在约30分钟的输注期内施用。
纳米颗粒组合物中紫杉烷(在一些实施方式中太平洋紫杉醇)的其他示例性剂量包括但不限于约50mg/m2、60mg/m2、75mg/m2、80mg/m2、90mg/m2、100mg/m2、120mg/m2和150mg/m2中任一个。例如，当按照每周进度方案给予时，纳米颗粒组合物中太平洋紫杉醇的剂量范围可以为约50-150mg/m2。
纳米颗粒组合物可以通过各种途径施用给个体(例如人)，包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透粘膜和经皮。在一些实施方式中，可以使用组合物的持续连续释放制剂。在一些实施方式中，该组合物静脉内施用。在一些实施方式中，该组合物动脉内施用。在一些实施方式中，该组合物腹膜内施用。
化疗药剂(如，吉西他滨)
本文描述的化疗药剂(如，吉西他滨)可以经由多种途径(诸如肠胃外，包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内或经皮)施用至个体(诸如人)。在一些实施方式中，化疗药剂(如，吉西他滨)静脉内施用。
化疗药剂(如，吉西他滨)的给药频率可以与mRNA、RNAi或纳米颗粒组合物的给药频率相同或不同。示例性频率如上所提供。作为进一步实例，化疗药剂(如，吉西他滨)可以施用一天三次、一天两次、每天一次、一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、每周一次。在一些实施方式中，化疗药剂(如，吉西他滨)施用每天两次或每天三次。化疗药剂(如，吉西他滨)的示例性量包括但不限于以下范围中的任一个：约0.5至约5mg、约5至约10mg、约10至约15mg、约15至约20mg、约20至约25mg、约20至约50mg、约25至约50mg、约50至约75mg、约50至约100mg、约75至约100mg、约100至约125mg、约125至约150mg、约150至约175mg、约175至约200mg、约200至约225mg、约225至约250mg、约250至约300mg、约300至约350mg、约350至约400mg、约400至约450mg、或约450至约500mg。例如，化疗药剂(如，吉西他滨)可以以约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)的剂量施用。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约45mg/m2至约350mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约80mg/m2至约350mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约80mg/m2至约300mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约150mg/m2至约350mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约80mg/m2至约150mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)的有效量为约100mg/m2。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约170mg/m2至约200mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷的有效量为约200mg/m2至约350mg/m2之间，和其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约1mg/kg至约200mg/kg(包括例如约1mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约40mg/kg、约40mg/kg至约60mg/kg、约60mg/kg至约80mg/kg、约80mg/kg至约100mg/kg、约100mg/kg至约120mg/kg、约120mg/kg至约140mg/kg、约140mg/kg至约200mg/kg)。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)的有效量为约260mg/m2。在上述任意方法的一些实施方式中，其他化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约20-30mg/kg、约30-40mg/kg、约40-50mg/kg、约50-60mg/kg、约60-70mg/kg、约70-80mg/kg、约80-100mg/kg或约100-120mg/kg。
在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)的有效量为约30至约300mg/m2之间，和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约100至约5000mg/m2之间。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物中紫杉烷(如，太平洋紫杉醇)的有效量为约30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300mg/m2中的任一个，和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4750或5000mg/m2中的任一个。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物为约30至约300mg/m2，和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约100至约5000mg/m2，其中纳米颗粒组合物和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)均每周施用至先前治疗胰腺癌的个体。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物为约30至约300mg/m2，和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约100至约5000mg/m2，其中纳米颗粒组合物和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)均以小于每周一次的频率施用至先前治疗胰腺癌的个体。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物为约30至约300mg/m2，和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)的有效量为约100至约5000mg/m2，其中纳米颗粒组合物和另一种化疗药剂(如，吉西他滨)均在28天周期的第1天、第8天和第15天在30内静脉内施用至个体。
基于生物标记存在的治疗方法
在一个方面中，本发明提供治疗个体中疾病或病症的方法，包括基于一个或多个畸变的状态将mRNA和/或RNAi(如，siRNA)递送至个体。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的基因和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的蛋白质和/或与RNAi(如，siRNA)靶向的基因对应的蛋白质中。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括将a)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中个体包括编码肿瘤阻抑蛋白的基因和或癌基因中的畸变。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括a)评估编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因的畸变，和b)将i)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和b)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括a)评估编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因的畸变，和b)将i)编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和ii)靶向癌基因的siRNA递送至个体，其中基于具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因中的畸变，选择个体进行治疗。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括a)基于个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因中的畸变，选择(如，鉴定或推荐)个体进行治疗，和b)将i)编码的肿瘤阻抑蛋白mRNA和ii)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN 106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，提供的是治疗个体中癌症的方法，包括a)评估编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因的畸变，b)基于个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因中的畸变，选择(如，鉴定或推荐)个体进行治疗，和c)将i)编码的肿瘤阻抑蛋白mRNA和ii)靶向癌基因的siRNA递送至个体。在一些实施方式中，癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白是PTEN。在一些实施方式中，癌基因是KRAS。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有癌基因中的畸变。在一些实施方式中，个体具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和癌基因中的畸变。在一些实施方式中，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA和靶向癌基因的siRNA同时递送。在一些实施方式中，mRNA和siRNA并发递送。在一些实施方式中，mRNA和/或siRNA静脉内递送。在一些实施方式中，当被递送至个体时，mRNA和/或siRNA与细胞穿透肽复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自CADY、PEP-1、PEP-2、MPG、VEPEP-3肽(本文中与ADGN-103肽可互换地使用)、VEPEP-4肽(本文中与ADGN-104肽可互换地使用)、VEPEP-5肽(本文中与ADGN-105肽可互换地使用)、VEPEP-6肽(本文中与ADGN-106肽可互换地使用)、VEPEP-9肽(本文中与ADGN-109肽可互换地使用)和ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自ADGN106肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，mRNA(如，编码PTEN的mRNA)和/或siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)约一周一次或每五天一次递送。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.001mg/kg至约10mg/kg(如，约0.01mg/kg至约1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.1mg/kg)。在一些实施方式中，个体中每次施用的mRNA(如，编码PTEN的mRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体中每次施用的siRNA(如，靶向KRAS的siRNA)的剂量为约0.03mg/m2至约400mg/m2(如，约0.4mg/m2至约40mg/m2、约0.8mg/m2至约4mg/m2)。在一些实施方式中，个体是人。
在一些实施方式中，还提供的是基于个体具有畸变，辅助评估具有疾病或病症(诸如癌症)的个体是否将可能对治疗应答或适合治疗的方法，其中治疗包括将mRNA和/或RNAi(如，siRNA)递送至个体。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的基因和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的蛋白质和/或与RNAi(如，siRNA)靶向的基因对应的蛋白质中。在一些实施方式中，畸变的存在指示个体将可能对治疗应答，和畸变的不存在指示个体将不太可能对治疗应答。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白(如，PTEN或p53)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向癌基因(如，KRAS)。
在一些实施方式中，提供的是鉴定具有疾病或病症(诸如癌症)的个体可能对治疗应答的方法，包括a)基于个体具有畸变，鉴定个体；和b)将mRNA和/或RNAi(如，siRNA)递送至个体。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的基因和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的蛋白质和/或与RNAi(如，siRNA)靶向的基因对应的蛋白质中。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白(如，PTEN或p53)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向癌基因(如，KRAS)。
本文还提供的是调整接受mRNA和/或RNAi(如，siRNA)的具有疾病或病症(诸如癌症)的个体的疗法治疗的方法；方法包括评估畸变，和基于畸变的状态调整疗法治疗。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的基因和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的蛋白质和/或与RNAi(如，siRNA)靶向的基因对应的蛋白质中。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白(如，PTEN或p53)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向癌基因(如，KRAS)。
本文还提供的是市售用于个体群体中疾病或障碍的包含mRNA和/或RNAi(如，siRNA)的疗法的方法，方法包括告知目标受众关于治疗个体群体的疗法的用途，个体群体的特征在于这类群体的个体具有携带畸变的样品。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的基因和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中。在一些实施方式中，畸变处于与mRNA对应的蛋白质和/或与RNAi(如，siRNA)靶向的基因对应的蛋白质中。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白(如，PTEN或p53)。在一些实施方式中，RNAi(如，siRNA)靶向癌基因(如，KRAS)。
“畸变”是指基因畸变，基因的畸变(异常，aberrant)表达水平和/或畸变(异常，aberrant)活性水平与mRNA和/或由siRNA靶向的基因对应，其可导致与mRNA和/或由siRNA靶向的基因(如，癌基因)对应的蛋白质的异常表达和/或活性。在一些实施方式中，具有畸变的蛋白质具有增加的或降低的蛋白质或涉及蛋白质的信号传导途径的表达/活性，至参考活性水平或范围以上或以下，诸如高于或低于参考活性水平至少约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更高中任一个，或参考活性范围的中位数。在一些实施方式中，参考活性水平是标准化测试中临床公认的正常活性水平，或没有畸变的健康个体(或从个体分离的组织或细胞)的活性水平。
畸变的“状态”可以指基因中畸变的存在或不存在，或者畸变水平(表达或活性水平，包括蛋白质的磷酸化水平)。与对照相比，基因中存在基因畸变(诸如突变或拷贝数变异)表明(a)该个体更可能对治疗应答，或(b)该个体被选择进行治疗。在一些实施方式中，与对照相比，在与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中不存在基因畸变，表明(a)该个体较不可能对治疗应答；或(b)该个体未被选择进行治疗。在一些实施方式中，递送或待递送的与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因的畸变水平(诸如表达水平或活性水平，包括蛋白质的磷酸化水平)与个体对治疗应答的可能性相关。例如，递送或待递送的与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因的水平(诸如表达水平或活性水平，包括蛋白质的磷酸化水平)的较大偏差表明该个体更可能对治疗应答。在一些实施方式中，基于递送或待递送的与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因的水平(一种或多种)(诸如表达水平或活性水平，包括蛋白质的磷酸化水平)的预测模型被用于预测(a)个体对治疗应答的可能性，以及(b)是否选择个体进行治疗。可以使用临床试验数据通过统计分析如回归分析来获得包括例如每个水平的系数在内的预测模型。
递送或待递送的与mRNA对应的或RNAi(如，siRNA)靶向的基因编码的蛋白质的表达水平和/或活性水平，和/或存在或不存在递送或待递送的与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因可以用于确定以下任何一项：(a)个体最初接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的合适性；(b)个体最初接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的不合适性；(c)对治疗的应答性；(d)个体继续接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的合适性；I个体继续接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的不合适性；(f)调整剂量；(g)预测临床益处的可能性。
如本文所使用，“基于”包括评估、确定或测量本文描述的个体的特性(和优选地，选择适合接收治疗的个体)。当畸变的状态被“用作”选择、评估、测量或确定本文描述的治疗方法的“基础”时，在治疗之前和/或期间确定递送或待递送的与mRNA对应的基因或RNAi(如，siRNA)靶向的基因中的畸变，并且临床医生将获得的状态(包括畸变的存在、不存在、表达水平和/或活性水平)用于评估以下任何一项：(a)个体最初接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的合适性；(b)个体最初接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的不合适性；(c)对治疗的应答性；(d)个体继续接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的合适性；I个体继续接受治疗(一种或多种)的可能性的或可能的不合适性；(f)调整剂量；或(g)预测临床益处的可能性。
通过分析来自个体的样品可以评估或确定个体中的畸变。评估可以基于新鲜的组织样品或封存的组织样品。合适的样品包括但不限于癌组织、癌组织附近的正常组织，癌组织远端的正常组织或外周血淋巴细胞。在一些实施方式中，样品是含有癌细胞的活组织检查，诸如癌细胞的细针吸取或腹腔镜检查获得的癌细胞。在一些实施方式中，活组织检查的细胞被离心为沉淀、固定并包埋在石蜡中，然后分析。在一些实施方式中，活组织检查的细胞在分析之前进行速冻。在一些实施方式中，样品是血浆样品。
在一些实施方式中，样品包含循环转移的癌细胞。在一些实施方式中，通过从血液中分选循环肿瘤细胞(CTC)获得样品。在一些进一步实施方式中，CTC已经与原发性肿瘤脱离并在体液中循环。在一些进一步的实施方式中，CTC已经与原发性肿瘤脱离并在血流中循环。在一些实施方式中，CTC是转移的指示。
可以在治疗开始之前、在治疗期间的任何时间和/或在治疗结束时评估畸变。
I.畸变
可以通过多种方法鉴定候选畸变，例如，通过文献检索或通过本领域内已知的实验方法，其包括但不限于基因表达序型分析实验(如，RNA测序或微阵列实验)、定量蛋白质组学实验和基因测序实验。例如，与对照样品相比，对从具有癌症的个体收集的样品进行的基因表达序型分析实验和定量蛋白质组学实验可以提供以畸变水平存在的基因和基因产物(诸如RNA、蛋白质和磷酸化蛋白质)的列表。在一些情况下，与对照样品相比，对从具有癌症的个体收集的样品进行的基因测序(诸如外显子测序)实验可提供基因畸变的列表。统计关联研究(诸如全基因组关联研究)可以对从具有癌症的个体群体收集的实验数据进行，以将实验中鉴定的畸变(诸如畸变水平或基因畸变)与癌症相关联。在一些实施方式中，进行靶向测序实验(诸如ONCOPANELTM测试)以提供具有癌症的个体的基因畸变的列表。
ONCOPANELTM测试可以被用于调查癌症相关基因的外显子DNA序列和用于检测基因畸变的内含子区域，包括来自各种样品来源的DNA中的体细胞突变、拷贝数变异和结构重排(诸如，肿瘤活组织检查或血液样品)，由此提供基因畸变的候选列表。在一些实施方式中，基因畸变是选自ONCOPANELTM测试的基因中的基因畸变或畸变水平(诸如，表达水平或活性水平)(CLIA认证)。参见，例如，Wagle N.et al.Cancer discovery 2.1(2012)：82-93。
ONCOPANELTM测试的示例性版本包括300个癌症基因和跨35个基因的113个内含子。包括在示例性ONCOPANELTM测试中的300个基因是：ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALOX12B、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ASXL1、ATM、ATRX、AURKA、AURKB、AXL、B2M、BAP1、BCL2、BCL2L1、BCL2L12、BCL6、BCOR、BCORL1、BLM、BMPR1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BUB1B、CADM2、CARD11、CBL、CBLB、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD274、CD58、CD79B、CDC73、CDH1、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6、CDK9、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CHEK2、CIITA、CREBBP、CRKL、CRLF2、CRTC1、CRTC2、CSF1R、CSF3R、CTNNB1、CUX1、CYLD、DDB2、DDR2、DEPDC5、DICER1、DIS3、DMD、DNMT3A、EED、EGFR、EP300、EPHA3、EPHA5、EPHA7、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FAM46C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FAS、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FKBP9、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FUS、GATA3、GATA4、GATA6、GLI1、GLI2、GLI3、GNA11、GNAQ、GNAS、GNB2L1、GPC3、GSTM5、H3F3A、HNF1A、HRAS、ID3、IDH1、IDH2、IGF1R、IKZF1、IKZF3、INSIG1、JAK2、JAK3、KCNIP1、KDM5C、KDM6A、KDM6B、KDR、KEAP1、KIT、KRAS、LINC00894、LMO1、LMO2、LMO3、MAP2K1、MAP2K4、MAP3K1、MAPK1、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MEF2B、MEN1、MET、MITF、MLH1、MLL(KMT2A)、MLL2(KTM2D)、MPL、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYB、MYBL1、MYC、MYCL1(MYCL)、MYCN、MYD88、NBN、NEGR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NFKBIZ、NKX2-1、NOTCH1、NOTCH2、NPM1、NPRL2、NPRL3、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PALB2、PARK2、PAX5、PBRM1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PHOX2B、PIK3C2B、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PMS1、PMS2、PNRC1、PRAME、PRDM1、PRF1、PRKAR1A、PRKCI、PRKCZ、PRKDC、PRPF40B、PRPF8、PSMD13、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPRD、QKI、RAD21、RAF1、RARA、RB1、RBL2、RECQL4、REL、RET、RFWD2、RHEB、RHPN2、ROS1、RPL26、RUNX1、SBDS、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SETBP1、SETD2、SF1、SF3B1、SH2B3、SLITRK6、SMAD2、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMC1A、SMC3、SMO、SOCS1、SOX2、SOX9、SQSTM1、SRC、SRSF2、STAG1、STAG2、STAT3、STAT6、STK11、SUFU、SUZ12、SYK、TCF3、TCF7L1、TCF7L2、TERC、TERT、TET2、TLR4、TNFAIP3、TP53、TSC1、TSC2、U2AF1、VHL、WRN、WT1、XPA、XPC、XPO1、ZNF217、ZNF708、ZRSR2。在示例性ONCOPANELTM测试中调查的内含子区域被平铺在以下基因的特定内含子上：ABL1、AKT3、ALK、BCL2、BCL6、BRAF、CIITA、EGFR、ERG、ETV1、EWSR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FUS、IGH、IGL、JAK2、MLL、MYC、NPM1、NTRK1、PAX5、PDGFRA、PDGFRB、PPARG、RAF1、RARA、RET、ROS1、SS18、TRA、TRB、TRG、TMPRSS2。本申请考虑了包括在任意实施方式或ONCOPANELTM测试的版本中的任何基因的畸变(诸如，基因畸变和畸变水平)——其包括但不限于上述列举的基因和内含子区域，以作为选择个体进行用如上编码癌症基因的mRNA和/或如上靶向癌症基因的siRNA的治疗的基础。
II.基因畸变
递送或待递送至个体的与mRNA对应和/或RNAi(如，siRNA)靶向的基因(一种或多种)的基因畸变可以包括核酸(诸如DNA和RNA)或蛋白质序列的变化(即，突变)或与基因相关的外遗传特征，包括但不限于基因(一种或多种)的编码、非编码、调节、增强子、沉默子、启动子、内含子、外显子和非翻译区。
基因畸变可能是种系突变(包括染色体重排)或体细胞突变(包括染色体重排)。在一些实施方式中，基因畸变存在于个体的所有组织中，包括正常组织和癌组织。在一些实施方式中，基因畸变仅存在于个体的癌组织中。在一些实施方式中，基因畸变仅存在于癌组织的一部分中。
在一些实施方式中，畸变包含基因的突变，其包括但不限于缺失、移码、插入、插入/缺失(indel)、错义突变、无义突变、点突变、单核苷酸变异(SNV)、沉默突变、剪接位点突变、剪接变体和易位。在一些实施方式中，突变可能是涉及基因的信号传导路径的负调节子的功能突变丧失或信号传导途径的正调节子的功能突变获得。
在一些实施方式中，基因畸变包含基因的拷贝数变异。例如，如果每个基因组正常存在N个拷贝的基因。在一些实施方式中，基因的拷贝数通过基因畸变而被扩大，导致在基因组中至少约2、3、4、5、6、7、8、或更多个拷贝的基因。在一些实施方式中，基因的基因畸变导致基因组中的基因的一些拷贝丢失。在一些实施方式中，基因的拷贝数变异是基因的缺失。在一些实施方式中，基因的拷贝数变异由基因组的结构重排引起，包括染色体或其片段的缺失、重复、倒置和易位。
在一些实施方式中，基因畸变包含与基因相关的畸变外遗传特征，其包括但不限于DNA甲基化、羟甲基化、畸变组蛋白结合、染色质重塑等。在一些实施方式中，个体中基因的启动子被高甲基化，例如与对照水平(诸如标准化测试中临床上可接受的正常水平)相比达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高中的任一个。
在一些实施方式中，在上面描述的基因的任一个中存在基因畸变(诸如，突变或拷贝数变异)。
在各种人癌症中已经鉴定了基因中的基因畸变，包括遗传性癌症和散发性癌症。例如，TSC1/2中种系灭活突变导致结节性硬化症，和患有该病症的患者存在病变，其包括皮肤和脑错构瘤、肾血管平滑肌瘤和肾细胞癌(RCC)(Krymskaya VP et al.2011FASEBJournal25(6)：1922-1933)。PTEN错构瘤肿瘤综合征(PHTS)与灭活种系PTEN突变有关，并与一系列临床表现相关，包括乳腺癌、子宫内膜癌、滤泡性甲状腺癌、错构瘤和RCC(LegendreC.et al.2003Transplantation proceedings 35(3Suppl)：151S-153S)。另外，散发性肾癌也已经显示了在PI3K-Akt-mTOR途径的几个基因中包含体细胞突变(如AKT1、MTOR、PIK3CA、PTEN、RHEB、TSC1、TSC2)(Power LA,1990Am.J.Hosp.Pharm.475.5：1033-1049；Badesch DBet al.2010Chest 137(2)：376-387l；Kim JC&Steinberg GD,2001,The Journal ofurology,165(3)：745-756；McKiernan J.et al.2010,J.Urol.183(Suppl 4))。以下描述了一些基因中的示例性基因畸变，并且应当理解，本申请不限于本文描述的示例性基因畸变。
在一些实施方式中，畸变包含PTEN中的基因畸变。在一些实施方式中，基因畸变包含基因组中PTEN的缺失。在一些实施方式中，基因畸变包含PTEN中的功能突变丧失。在一些实施方式中，功能突变的丧失包含错义突变、无义突变或移码突变。在一些实施方式中，突变包含在PTEN中选自如下的位置：K125E、K125X、E150Q、D153Y D153 NK62R、Y65C、V217A和N323K。在一些实施方式中，基因畸变包含在PTEN基因座处杂合性的丧失(LOH)。
在一些实施方式中，畸变包含TP53中的基因畸变。在一些实施方式中，基因畸变包含TP53中的功能突变的丧失。在一些实施方式中，功能突变的丧失是TP53中的移码突变，诸如A39fs*5。
在一些实施方式中，畸变包含AKT中的基因畸变。在一些实施方式中，基因畸变包含AKT中的功能突变的丧失。在一些实施方式中，功能突变的丧失是AKT中的移码突变。
在一些实施方式中，畸变包含KRAS中的基因畸变。在一些实施方式中，基因畸变包含KRAS中的功能突变的丧失。在一些实施方式中，功能突变的丧失是KRAS中的移码突变。
基因的基因畸变可以根据样品进行评估，诸如来自个体的样品和/或参考样品。在一些实施方式中，样品是组织样品或从组织样品中提取的核酸。在一些实施方式中，样品是细胞样品(例如CTC样品)或从细胞样品中提取的核酸。在一些实施方式中，样品是肿瘤活组织检查。在一些实施方式中，样品是肿瘤样品或从肿瘤样品中提取的核酸。在一些实施方式中，样品是活组织检查样品或从活组织检查样品中提取的核酸。在一些实施方式中，样品是甲醛固定的石蜡包埋的(FFPE)样品或从FFPE样品中提取的核酸。在一些实施方式中，样品是血液样品。在一些实施方式中，从血液样品中分离出无细胞DNA。在一些实施方式中，生物样品为血浆样品或从血浆样品中提取的核酸。
通过本领域内已知的任意方法可以确定基因的基因突变。参见，例如，Dickson etal.Int.J.Cancer,2013,132(7)：1711-1717；Wagle N.Cancer Discovery,2014,4：546-553；和Cancer Genome Atlas Research Network.Nature 2013,499：43-49。示例性方法包括但不限于基因组DNA测序、亚硫酸氢盐测序、使用Sanger测序或下一代测序平台的其他基于DNA测序的方法；聚合酶链反应测定；原位杂交测定；以及DNA微阵列。可以将分离自个体的样品中一个或多个基因的外遗传特征(诸如，DNA甲基化、组蛋白结合或染色质修饰)与对照样品中一个或多个基因的外遗传特征进行比较。可以对从样品中提取的核酸分子进行测序或分析相对于参考序列诸如TP53、KRAS、AKT和PTEN的野生型序列基因畸变的存在。
在一些实施方式中，使用无细胞DNA测序方法评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，使用下一代测序评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，使用下一代测序评估从血液样品中分离的基因的基因畸变。在一些实施方式中，使用外显子测序评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，施用荧光原位杂交分析评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之前评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之后评估基因的基因畸变。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之前和之后评估基因的基因畸变。基因的畸变水平可以指畸变表达水平或畸变活性水平。
III.畸变水平
基因的畸变表达水平包括与对照水平相比，基因编码的分子水平的增加或减少。基因编码的分子可包括RNA转录物(一种或多种)(诸如mRNA)、蛋白质同种型(一种或多种)、蛋白质同种型(一种或多种)的磷酸化和/或去磷酸化状态、蛋白质同种型(一种或多种)的泛素化和/或去泛素化状态、蛋白质同种型(一种或多种)的膜局部化(如肉豆蔻酰化、棕榈酰化等)状态、蛋白质同种型(一种或多种)的其他翻译后修饰状态，或其任何组合。
基因的畸变活性水平包括基因的任何下游靶基因编码的分子的增强或抑制，其包括下游靶基因的外遗传调节、转录调节、翻译调节、翻译后调节或其任何组合。另外，基因的活性包括对畸变应答的下游细胞和/或生理效应，其包括但不限于蛋白质合成、细胞生长、增殖、信号转导、线粒体代谢、线粒体生物发生、应激应答、细胞周期停滞、自噬、微管组织和脂质代谢。
在一些实施方式中，畸变(如，畸变表达水平)包括畸变蛋白质磷酸化水平。在一些实施方式中，畸变磷酸化水平处于选自PTEN、KRAS、AKT和TP53的基因编码的蛋白质中。基因的示例性磷酸化物质可以作为相关的生物标记物。在一些实施方式中，如果个体中的蛋白质被磷酸化，则个体被选择进行治疗。在一些实施方式中，如果个体中的蛋白质没有被磷酸化，则个体被选择进行治疗。在一些实施方式中，蛋白质的磷酸化状态通过免疫组织化学确定。
基于样品(如，来自个体的样品或参考样品)确定个体中基因的水平(诸如，表达水平和/或活性水平)。在一些实施方式中，样品来自组织、器官、细胞或肿瘤。在一些实施方式中，样品是生物样品。在一些实施方式中，生物样品是生物流体样品或生物组织样品。在进一步的实施方式中，生物流体样品是体液。在一些实施方式中，样品是癌组织，所述癌组织附近的正常组织、所述癌组织远端的正常组织、血液样品或其他生物样品。在一些实施方式中，样品是固定样品。固定样品包括但不限于福尔马林固定样品、石蜡包埋样品或冷冻样品。在一些实施方式中，样品是含有癌细胞的活组织检查。在进一步实施方式中，活组织检查是癌细胞的细针吸取。在进一步实施方式中，活组织检查是腹腔镜检查获得的癌细胞。在一些实施方式中，活组织检查的细胞被离心为沉淀、固定并包埋在石蜡中。在一些实施方式中，活组织检查的细胞被速冻。在一些实施方式中，活组织检查的细胞与识别基因编码的分子的抗体混合。在一些实施方式中，至少一个基因包括基因的任何下游靶基因编码的分子的增强或抑制，包括下游靶基因的外遗传调节、转录调节、翻译调节、翻译后调节或其任何组合。另外，基因的活性包括对畸变应答的下游细胞和/或生理效应，其包括但不限于蛋白质合成、细胞生长、增殖、信号转导、线粒体代谢、线粒体生物发生、应激应答、细胞周期停滞、自噬、微管组织和脂质代谢。
在一些实施方式中，样品包含循环转移的癌细胞。在一些实施方式中，通过从血液中分选循环肿瘤细胞(CTC)获得样品。在进一步实施方式中，CTC已经与原发性肿瘤脱离并在体液中循环。在又进一步实施方式中，CTC已经与原发性肿瘤脱离并在血流中循环。在进一步实施方式中，CTC是转移的指示。
在一些实施方式中，确定基因编码的蛋白质水平，从而评估基因的畸变表达水平。在一些实施方式中，确定基因的下游靶基因编码的蛋白质水平，从而评估基因的畸变活性水平。在一些实施方式中，使用对个体蛋白质或其蛋白质水解片段的一个或多个表位特异性的一种或多种抗体确定蛋白质水平。适合用于实践本发明的检测方法包括但不限于免疫组织化学、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印记、质谱法和免疫PCR。在一些实施方式中，样品中基因和/或其下游靶基因(一种或多种)编码的蛋白质(一种或多种)的水平通过相同样品中的持家蛋白质(诸如，甘油醛3-磷酸脱氢酶或GAPDH)的水平归一化(诸如，相除)。
在一些实施方式中，确定基因编码的mRNA的水平，从而评估基因的畸变表达水平。在一些实施方式中，确定基因的下游靶基因编码的mRNA的水平，从而评估基因的畸变活性水平。在一些实施方式中，使用逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)试验(包括，定量RT-PCR试验)确定mRNA水平。在一些实施方式中，使用基因芯片或下一代测序方法(诸如RNA(cDNA)测序或外显子测序)确定基因和/或其下游靶基因编码的RNA(诸如mRNA)的水平。在一些实施方式中，样品中基因和/或其下游靶基因的mRNA水平通过相同样品中的持家基因(诸如，GAPDH)的水平归一化(诸如，相除)。
在一些实施方式中，比较个体中基因的水平与对照样品中基因的水平。在一些实施方式中，比较个体中基因的水平与多个对照样品中基因的水平。在一些实施方式中，多个对照样品被用于生成用于分类具有癌症的个体中基因水平的统计。
可以相对于对照水平的统计分布确定基因的水平(即，高或低)的分类或排名。在一些实施方式中，分类或排名相对于对照样品，诸如，从个体获得的正常组织(例如外周血单核细胞)或正常上皮细胞样品(例如颊交换(buccal swap)或皮肤穿孔(skin punch))。在一些实施方式中，基因的水平相对于对照水平的统计分布进行分类或排名。在一些实施方式中，基因的水平相对于从个体获得的对照样品的水平进行分类或排名。
可以使用与非对照样品相同的来源和方法获得对照样品。在一些实施方式中，从不同的个体(例如，没患有癌症的个体；具有与癌症相对应的良性或较不晚期形式疾病的个体；和/或具有相似种族、年龄和性别的个体)获得对照样品。在一些实施方式中，当样品是肿瘤组织样品时，对照样品可以是来自同一个体的非癌性样品。在一些实施方式中，多个对照样品(例如，来自不同个体)被用于确定具体组织、器官或细胞群体中基因的水平范围。
在一些实施方式中，对照样品是培养的组织或细胞，其已经被确定为合适的对照。在一些实施方式中，对照是没有畸变的细胞。在一些实施方式中，标准化测试中临床可接受的正常水平被用作确定基因畸变水平的对照水平。在一些实施方式中，个体中基因或其下游靶基因的水平根据评分系统诸如基于免疫组织化学的评分系统分类为高、中或低。
在一些实施方式中，基因的水平是通过测量个体的基因水平并与对照或参考(如，给定患者群体的中位数水平或第二个体的水平)进行比较而确定的。例如，如果确定单个个体的基因水平高于患者群体的中位数水平，则确定该个体具有高基因表达水平。可选地，如果确定单个个体的基因水平低于患者群体的中位数水平，则确定该个体具有低基因表达水平。在一些实施方式中，将个体与对治疗应答的第二个体和/或患者群体进行比较。在一些实施方式中，将个体与对治疗无应答的第二个体和/或患者群体进行比较。在一些实施方式中，水平是通过测量基因和/或其下游靶基因编码的核酸的水平来确定的。例如，如果确定单个个体的基因编码的分子(例如mRNA或蛋白质)的水平高于患者群体的中位数水平，则确定该个体具有高水平的基因编码的分子(例如mRNA或蛋白质)。可选地，如果确定单个个体的基因编码的分子(例如mRNA或蛋白质)的水平低于患者群体的中位数水平，则确定该个体具有低水平的基因编码的分子(例如mRNA或蛋白质)。
在一些实施方式中，基因的对照水平是通过获得基因水平的统计分布来确定的。在一些实施方式中，相对于对照水平或对照水平的统计分布对基因的水平进行分类或排名。
在一些实施方式中，生物信息学方法用于确定和分类基因的水平，包括基因下游靶基因的水平，作为基因活性水平的量度。已经开发出许多生物信息学方法来使用基因表达序型分析数据来评估基因组表达谱图。方法包括但不限于如下文献中描述的那些：Segal,E.et al.Nat.Genet.34：66-176(2003)；Segal,E.et al.Nat.Genet.36：1090-1098(2004)；Barry,W.T.et al.Bioinformatics 21：1943-1949(2005)；Tian,L.et al.ProcNat’l Acad Sci USA 102：13544-13549(2005)；Novak B A and Jain AN.Bioinformatics 22：233-41(2006)；Maglietta R et al.Bioinformatics 23：2063-72(2007)；Bussemaker H J,BMC Bioinformatics 8Suppl 6：S6(2007)。
在一些实施方式中，对照水平为预定的阈值水平。在一些实施方式中，mRNA水平被确定，并且低水平为小于被认为是临床正常的或从对照获得的水平的如下倍数的mRNA水平：约1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001或更少倍中的任一个。在一些实施方式中，高水平为大于被认为是临床正常的或从对照获得的水平的如下倍数的mRNA水平：约1.1、1.2、1.3、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、5、7、10、20、50、70、100、200、500、1000倍或超过1000倍。
在一些实施方式中，例如，通过蛋白质印记或酶联免疫吸附试验(ELISA)确定蛋白质表达水平。例如，基于蛋白质凝胶上带的总强度制定低或高水平的标准，蛋白质凝胶上的带与被特异性识别该基因编码的蛋白质的抗体印迹(blotted)的基因编码的蛋白质对应，并通过相同样品的相同蛋白质凝胶上的带归一化(诸如相除)，该蛋白质凝胶上的带与被特异性识别持家蛋白质(诸如GAPDH)的抗体印迹的持家蛋白质(诸如GAPDH)对应。在一些实施方式中，如果蛋白质水平小于被认为是临床正常的或从对照获得的水平的如下倍数：约1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001或更少倍中任一个，则蛋白质水平是低的。在一些实施方式中，如果蛋白质水平大于被认为是临床正常的或从对照获得的水平的如下倍数：约1.1、1.2、1.3、1.5、1.7、2、2.2、2.5、2.7、3、5、7、10、20、50或100倍被或超过100倍中的任一个，则蛋白质水平是高的。
在一些实施方式中，例如，通过免疫组织化学确定蛋白质表达水平。例如，可以基于阳性染色细胞的数目和/或染色的强度制定低或高水平的标准，例如，通过使用特异性识别基因编码的蛋白质的抗体。在一些实施方式中，如果小于约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％细胞具有阳性染色，则水平是低的。在一些实施方式中，如果染色强度比阳性对照染色低1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，则水平是低的。在一些实施方式中，如果大于约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％细胞具有阳性染色，则水平是高的。在一些实施方式中，如果染色强度与阳性对照染色一样，则水平是高的。在一些实施方式中，如果染色强度为阳性对照染色的80％、85％或90％，则水平是高的。
在一些实施方式中，评分基于美国专利公开号2013/0005678中描述的“H-分数”。通过式：3×强染色细胞的百分数+2×中度染色细胞的百分数+弱染色细胞的百分数，获得H-分数，给出0至300的范围。
在一些实施方式中，强染色、中度染色和弱染色为校正水平的染色，其中建立范围并且染色强度归类(bin)此范围内。在一些实施方式中，强染色为在强度范围的75％以上的染色，中度染色为强度范围的25％至75％的染色，和低染色为强度范围的25％以下的染色。在一些方面中，本领域和熟悉特定染色技术的技术人员调整归类的大小并限定染色类别。
在一些实施方式中，当大于50％的染色的细胞展示强反应性时，分配标签高染色，当在小于50％的染色细胞中没有观察到染色时，分配标签无染色，和对于所有其他情况，分配标签低染色。
在一些实施方式中，样品、患者等中的基因畸变或基因水平的评估和/或评分由一位或多位经验丰富的临床医生进行，即那些对基因表达和基因产物染色模式有经验的医生。例如，在一些实施方式中，临床医生(一个或多个)对被评估和评分的样品、患者等的临床特征和结果不了解。
在一些实施方式中，确定蛋白质磷酸化的水平。可以根据多种样品来源评估蛋白质的磷酸化状态。在一些实施方式中，样品是肿瘤活组织检查。经由多种方法评估蛋白质的磷酸化状态。在一些实施方式中，使用免疫组织化学评估磷酸化状态。蛋白质的磷酸化状态可以是位点特异性的。可以将蛋白质的磷酸化状态与对照样品进行比较。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之前，评估磷酸化状态。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之后，评估磷酸化状态。在一些实施方式中，在开始本文描述的治疗方法之前和之后，评估磷酸化状态。
试剂盒
本文还提供了可用于本文所述方法的试剂盒、试剂和制品。在一些实施方式中，试剂盒包含与包含一种或多种mRNA的小瓶分开的、包含CPP、组装分子和/或其它细胞穿透肽的小瓶。在患者治疗时，首先基于例如患者样品的基因表达分析或蛋白质组学或组织学分析确定所要治疗的具体病理。获得那些结果后，将CPP和任何任选的组装分子和/或细胞穿透肽相应地与适当的一种或多种mRNA组合，以产生可被施用至患者进行有效治疗的复合物或纳米颗粒。因此，在一些实施方式中，提供了试剂盒，其包括：1)CPP，和任选地2)一种或多种mRNA。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括组装分子和/或其它细胞穿透肽。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括用于确定基因表达谱图(profile)的药剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本文描述的试剂盒包含a)mRNA(如，编码肿瘤阻抑蛋白如PTEN和/或p53的mRNA)和b)RNAi(如，siRNA，如，靶向癌基因的siRNA，如，靶向KRAS的siRNA)。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含评估个体中畸变的药剂。在一些实施方式中，畸变包含基因突变。在一些实施方式中，基因是PTEN和/或KRAS。
本文描述的试剂盒可以进一步包括使用试剂盒的组分实践主题方法的说明书(例如制造本文描述的药物组合物和/或使用药物组合物的说明书)。实践主题方法的说明书通常被记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在基底上，比如纸或塑料等上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器的标签中或其组件中(即，与包装或分包装相关联)等。在一些实施方式中，说明书作为在合适的计算机可读存储介质——例如CD-ROM、磁盘等——上存在的电子存储数据文件存在。在又其它实施方式中，实际说明书不存在于试剂盒中，但是提供了用于从远端来源获得说明书的手段，例如，经由互联网。此实施方式的实例是如此试剂盒，其包括可以查看说明书和/或可以下载说明书的网址。与说明书一样，用于获得说明书的此手段被记录在合适的基底上。
试剂盒的多种组分可以在单独的容器中，其中容器可以被包含在单个外壳例如盒子内。
示例性实施方式
实施方式1.用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。
实施方式2.用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其通过包括如下步骤的方法制备：a)使包含mRNA的第一溶液与包含CPP的第二溶液混合以形成第三溶液，其中第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％DMEM，iv)约0-80mM NaCl，或v)约0-20％PBS；以及b)培育第三溶液以允许形成mRNA递送复合物。
实施方式3.实施方式2的mRNA递送复合物，其中第一溶液包含无菌水中的mRNA和/或其中第二溶液包含无菌水中的CPP。
实施方式4.实施方式2或3的mRNA递送复合物，其中在步骤b)的培育之后，第三溶液被调整以包含i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％DMEM，iv)约0-80mMNaCl，或v)约0-20％PBS、
实施方式5.用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA编码治疗性蛋白。
实施方式6.实施方式5的mRNA递送复合物，其中治疗性蛋白替换缺乏(有缺陷的，deficient)或异常的蛋白质、扩增现有途径、提供新的功能或活性或干扰分子或有机体。
实施方式7.用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA递送复合物进一步包含RNAi。
实施方式8.实施方式7的mRNA递送复合物，其中RNAi是siRNA、shRNA或miRNA。
实施方式9.实施方式7或8的mRNA递送复合物，其中mRNA编码用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白，和其中RNAi靶向RNA，其中RNA的表达与疾病或病症相关联。
实施方式10.实施方式1-9中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-3肽。
实施方式11.实施方式10的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含选自SEQ IDNO:1-14的氨基酸序列。
实施方式12.实施方式10的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列。
实施方式13.实施方式1-9中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-6肽。
实施方式14.实施方式13的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含选自SEQ IDNO:15-40的氨基酸序列。
实施方式15.实施方式13的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
实施方式16.实施方式1-9中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽是VEPEP-9肽。
实施方式17.实施方式16的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含选自SEQ IDNO:41-52的氨基酸序列。
实施方式18.实施方式16的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
实施方式19.实施方式1-9中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽是ADGN-100肽。
实施方式20.实施方式19的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含选自SEQ IDNO:53-70的氨基酸序列。
实施方式21.实施方式19的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含SEQ ID NO:79或80的氨基酸序列。
实施方式22.实施方式1-21中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽与mRNA共价连接。
实施方式23.实施方式1-22中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽进一步包含与细胞穿透肽的N-末端共价连接的一个或多个部分，和其中一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。
实施方式24.实施方式23的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含与其N-末端共价连接的乙酰基基团。
实施方式25.实施方式1-24中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽进一步包含与细胞穿透肽的C-末端共价连接的一个或多个部分，和其中一个或多个部分选自半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选取代的次氮基三乙酸、羧基、任选取代的直链或分支C1-C6烷基、伯或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。
实施方式26.实施方式25的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽包含与其C-末端共价连接的半胱酰胺基团。
实施方式27.实施方式1-26中任一项的mRNA递送复合物，其中mRNA递送复合物中的至少一些细胞穿透肽通过键连接至靶向部分。
实施方式28.实施方式27的mRNA递送复合物，其中键是共价的。
实施方式29.实施方式1-28中任一项的mRNA递送复合物，其中mRNA编码治疗性蛋白。
实施方式30.实施方式29的mRNA递送复合物，其中mRNA编码肿瘤阻抑蛋白。
实施方式31.实施方式1-30中任一项的mRNA递送复合物，其中mRNA递送复合物进一步包含RNAi。
实施方式32.实施方式31的mRNA递送复合物，其中RNAi靶向癌基因，进行下调。
实施方式33.实施方式1-32中任一项的mRNA递送复合物，其中细胞穿透肽与mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间。
实施方式34.实施方式1-33中任一项的mRNA递送复合物，其中mRNA递送复合物的平均直径为约20nm和约1000nm之间。
实施方式35.包含核的纳米颗粒，该核包含实施方式1-34中任一项的mRNA递送复合物。
实施方式36.实施方式35的纳米颗粒，其中核进一步包含根据实施方式1-34中任一项的一种或多种另外的mRNA递送复合物。
实施方式37.实施方式35或36的纳米颗粒，其中核进一步包含RNAi。
实施方式38.实施方式37的纳米颗粒，其中RNAi靶向癌基因，进行下调。
实施方式39.实施方式37或38的纳米颗粒，其中RNAi在包含细胞穿透肽(CPP)和RNAi的复合物中。
实施方式40.实施方式39的纳米颗粒，其中细胞穿透肽选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。
实施方式41.实施方式35-40中任一项的纳米颗粒，其中纳米颗粒中至少一些细胞穿透肽通过键连接至靶向部分。
实施方式42.实施方式35-41中任一项的纳米颗粒，其中核包被有壳，该壳包含周围细胞穿透肽。
实施方式43.实施方式42的纳米颗粒，其中周围细胞穿透肽选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。
实施方式44.实施方式43的纳米颗粒，其中周围细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:1-80的氨基酸序列。
实施方式45.实施方式42-44中任一项的纳米颗粒，其中壳中至少一些周围细胞穿透肽通过键连接至靶向部分。
实施方式46.实施方式41或45的纳米颗粒，其中键是共价的。
实施方式47.实施方式35-46中任一项的纳米颗粒，其中纳米颗粒的平均直径为约20nm和约1000nm之间。
实施方式48.药物组合物，其包含实施方式1-34中任一项的mRNA递送复合物或实施方式35-47中任一项的纳米颗粒，和药学上可接受的载体。
实施方式49.实施方式48的药物组合物，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码治疗性蛋白的mRNA。
实施方式50.实施方式48或49的药物组合物，其进一步包含抑制性RNA(RNAi)。
实施方式51.实施方式50的药物组合物，其中RNAi在mRNA递送复合物或纳米颗粒中。
实施方式52.实施方式48的药物组合物，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA。
实施方式53.制备实施方式1-34中任一项的mNRA递送复合物的方法，其包含使细胞穿透肽与一种或多种mRNA组合，由此形成mRNA递送复合物。
实施方式54.实施方式53的方法，其中细胞穿透肽和mRNA分别以约1：1至约100：1的摩尔比组合。
实施方式55.实施方式53或54的方法，其中组合包含使包含mRNA的第一溶液与包含CPP的第二溶液混合以形成第三溶液，其中第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％蔗糖、ii)约0-5％葡萄糖、iii)约0-50％DMEM、iv)约0-80mM NaCl或v)约0-20％PBS，和其中培育第三溶液以允许形成mRNA递送复合物。
实施方式56.实施方式55的方法，其中第一溶液包含无菌水中的mRNA和/或第二溶液包含无菌水中的CPP。
实施方式57.实施方式55或56的方法，其中在培育以形成mRNA递送复合物之后，第三溶液被调整以包含i)约0-5％蔗糖、ii)约0-5％葡萄糖、iii)约0-50％DMEM、iv)约0-80mMNaCl或v)约0-20％PBS。
实施方式58.将一种或多种mRNA递送至细胞内的方法，其包含使细胞与实施方式1-34中任一项的mRNA递送复合物或实施方式35-47中任一项的纳米颗粒接触，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含一种或多种mRNA。
实施方式59.实施方式58的方法，其中使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触在体内进行。
实施方式60.实施方式58的方法，其中使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触离体进行。
实施方式61.实施方式58的方法，其中使细胞与mRNA递送复合物或纳米颗粒接触在体外进行。
实施方式62.实施方式58-61中任一项的方法，其中细胞是干细胞、造血前体细胞、粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞、肌细胞、心脏细胞、肝细胞、肺祖细胞或神经元细胞。
实施方式63.实施方式62的方法，其中细胞是T细胞。
实施方式64.实施方式62或63的方法，其中mRNA编码能够调谐表达其的个体中的免疫应答的蛋白质。
实施方式65.实施方式58-64中任一项的方法，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码治疗性蛋白的mRNA。
实施方式66.实施方式58-65中任一项的方法，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒进一步包含抑制性RNA(RNAi)。
实施方式67.实施方式58-65中任一项的方法，进一步包含将RNAi递送至细胞内。
实施方式68.实施方式58-64中任一项的方法，其中mRNA递送复合物或纳米颗粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA。
实施方式69.治疗个体中疾病的方法，其包含向个体施用有效量的实施方式48-52中任一项的药物组合物。
实施方式70.实施方式69的方法，其中药物组合物经由如下方式进行施用：静脉内、肿瘤内、动脉内、外部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌内、鼻内、气管内、肺部、腔内或口服施用。
实施方式71.实施方式69的方法，其中药物组合物经由注射施用至血管壁或血管壁周围的组织中。
实施方式72.实施方式71的方法，其中注射通过具有针的导管。
实施方式73.实施方式69的方法，其中疾病选自癌症、糖尿病、自身免疫疾病、血液疾病、心脏疾病、血管疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染疾病、遗传性疾病、眼部疾病、肝病、肺病、肌肉疾病、蛋白质缺乏疾病、溶酶体贮积病、神经系统疾病、肾脏疾病、老化和退行性疾病、和特征在于胆固醇水平异常的疾病。
实施方式74.实施方式69的方法，其中疾病是蛋白质缺乏疾病。
实施方式75.实施方式74的方法，其中药物组合物包含含有编码贡献疾病的缺陷性蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式76.实施方式69的方法，其中疾病特征在于异常蛋白质。
实施方式77.实施方式76的方法，其中药物组合物包含含有编码贡献疾病的非功能蛋白的功能变体的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式78.实施方式73的方法，其中疾病是癌症。
实施方式79.实施方式78的方法，其中癌症是实体瘤，和其中药物组合物包含含有编码可用于治疗实体瘤的肿瘤阻抑蛋白的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式80.实施方式79的方法，其中癌症是肝、肺、肾、结肠直肠或胰腺的癌症。
实施方式81.实施方式78的方法，其中癌症是血液系统恶性肿瘤，和其中药物组合物包含含有可用于治疗血液系统恶性肿瘤的肿瘤阻抑蛋白的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式82.实施方式78-81中任一项的方法，其中药物组合物进一步包含靶向参与癌症发展和/或进展的癌基因的RNAi。
实施方式83.实施方式82的方法，其中RNAi在mRNA递送复合物或纳米颗粒中。
实施方式84.实施方式73的方法，其中疾病是病毒感染疾病，和其中药物组合物包含含有编码参与病毒感染疾病发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式85.实施方式73的方法，其中疾病是遗传性疾病，和其中药物组合物包含含有编码参与遗传性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式86.实施方式73的方法，其中疾病是老化或退行性疾病，和其中药物组合物包含含有编码参与老化或退行性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式87.实施方式73的方法，其中疾病是纤维变性或炎性疾病，和其中药物组合物包含含有编码参与纤维变性或炎性疾病发展和/或进展的一种或多种蛋白质的一种或多种mRNA的mRNA递送复合物或纳米颗粒。
实施方式88.实施方式69-87中任一项的方法，其中个体是人。
实施方式89.试剂盒，其包含实施方式1-34中任一项的mRNA递送复合物和/或实施方式35-47中任一项的纳米颗粒。
实施方式90.治疗个体中癌症的方法，其包含向个体施用有效量的编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA，其中肿瘤阻抑蛋白与选自如下的肿瘤阻抑基因对应：PTEN、视网膜母细胞瘤RB(或RB1)、TP53、TP63、TP73、CDKN2A(INK4A)、CDKN1B、CDKN1C、DLD/NP1、HEPACAM、SDHB、SDHD、SFRP1、TCF21、TIG1、MLH1、MSH2、MSH6、WT1、WT2、NF1、NF2N、VHL、KLF4、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、APC、MADR2、BRCA1、BRCA2、Patched、TSC1、TSC2、PALB2、ST14或VHL.
实施方式91.实施方式90的方法，进一步包含向个体施用有效量的靶向癌基因的siRNA。
实施方式92.实施方式91的方法，其中癌基因包括KRAS。
实施方式93.实施方式92的方法，其中siRNA靶向KRAS的突变体形式，其中KRAS的突变体形式包含KRAS的密码子12或61上的突变。
实施方式94.实施方式93的方法，其中KRAS的突变体形式包含G12D KRAS。
实施方式95.实施方式93或94的方法，其中siRNA包含靶向KRAS的第一突变体形式的第一siRNA，和靶向KRAS的第二突变体形式的第二siRNA，其中KRAS的第一突变体形式包含G12D KRAS，和其中KRAS的第二突变体形式包含G12C KRAS。
实施方式96.实施方式91-95中任一项的方法，其中siRNA包含选自具有SEQ IDNO:83、84、86-89的序列的核酸序列。
实施方式97.实施方式90-96中任一项的方法，其中肿瘤阻抑基因选自PTEN和TP53。
实施方式98.实施方式97的方法，其中肿瘤阻抑基因是PTEN。
实施方式99.实施方式90-98中任一项的方法，其中癌症选自胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和成胶质母细胞瘤。
实施方式100.实施方式90-99中任一项的方法，其中个体包含编码的肿瘤阻抑基因中的畸变。
实施方式101.实施方式91-100中任一项的方法，其中个体包含癌基因中的畸变。
实施方式102.实施方式100或101的方法，其中基于具有编码肿瘤阻抑蛋白的基因和/或癌基因中的畸变选择个体进行治疗。
实施方式103.实施方式101的方法，其中siRNA靶向癌基因的突变体形式，和其中突变体形式包含癌基因中的畸变。
实施方式104.治疗个体中疾病或病症的方法，其包含施用有效量的编码治疗性蛋白的mRNA或其重组体形式，其中治疗性蛋白选自α1抗胰蛋白酶、共济蛋白、胰岛素、生长激素(促生长素)、生长因子、激素、肌养蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF1)、因子VIII、因子IX、抗凝血酶III、蛋白质C、β-葡糖脑苷脂酶、葡萄糖苷酶-α、α-l-艾杜糖苷酸梅、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶、人α-半乳糖苷酶A、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰酶(包括脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)、腺苷脱氨酶和白蛋白。
实施方式105.实施方式104的方法，其中疾病或病症是特征在于治疗性蛋白缺乏的蛋白质缺乏疾病或病症。
实施方式106.实施方式104或105的方法，其中治疗性蛋白是因子VIII。
实施方式107.实施方式90-106中任一项的方法，其中mRNA静脉内或皮下施用。
实施例
本领域技术人员将认识到多种实施方式在本发明的范围和精神内是可能的。现将参考下文非限制性实施例对本发明进行更详细地描述。下文实施例进一步示例本发明，而当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
材料和方法
细胞穿透肽：
使用下面的肽：
PEP-1：KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:71)
PEP-2：KETWFETWFTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO:72)
VEPEP-3a：βAKWFERWFREWPRKRR(SEQ ID NO:75)
VEPEP-3b：βAKWWERWWREWPRKRR(SEQ ID NO:76)
VEPEP-6：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)
VEPEP-9：βALRWWLRWASRWFSRWAWWR(SEQ ID NO:78)
ADGN-100a：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)
ADGN-100b：βAKWRSALYRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:80)
肽原液在蒸馏水或5％DMSO中以2mg/mL制备，并在水浴超声波仪中超声处理10min，然后就在使用前刻稀释。
细胞系
使用几种细胞系，包括稳定EGFP表达细胞系(GFP-U2OS、EGFP-JURKAT T、EGFP-HEK)以及U2OS(HTB-96TM)、原代人成纤维细胞、Hep G2(HB-8065TM)、人胚胎肾(HEK293)(CRL-1573TM)、人骨髓性白血病K562细胞(CCL243TM)、Jurkat T细胞(TIB-152TM)、人ESC(H9)和小鼠ESC(ESF 158)。细胞得自American TypeCulture Collection[ATCC]。
实施例1：ADGN-肽/mRNA纳米颗粒和复合物制品、大小分布、体外和体内使用
材料
从Thermo Fisher lifeScience(法国)获得Lipofectamine 3000、TranscriptAidT7转录试剂盒和MEGAclear转录清理试剂盒、GeneArt Genomic Cleavage Detection试剂盒混合物。从New England Biolab获得HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit。从Thermo Fisherlife Science(法国)获得TranscriptAid T7转录试剂盒、MEGAclear转录清理试剂盒、GeneArt Genomic Cleavage Detection试剂盒和Platinum Green Hot Start PCR混合物。从Eurogentec(比利时)获得所有低聚核苷酸。
使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得荧光素酶mRNA。使用线性载体作为DNA模板(Luc2 pGL4-10)(Addgene)合成mRNA，并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。合成的mRNA通过LiCl沉淀、苯酚：氯仿萃取，随后乙醇沉淀进行纯化，然后通过UV光吸光度进行量化。通过测量260nm处紫外光吸光度确定RNA浓度。使用1μg的DNA模板获得18μg的加帽mRNA并在-20℃下储存。对于体内研究，从ThermoFisher获得CAS9 mRNA，作为聚腺苷酸化和加帽形式。
使用以下的肽序列。从GENEPEP Montpellier(法国)获得作为乙酸盐形式的所有的肽，从而促进溶解性和体内应用。
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)
HepG2细胞来自ATCC(CCL243TM)。
方法
肽原液制备
ADGN-100和ADGN-106肽以粉末储存在塑料管中。在室温下，肽粉末是稳定的，但是应当被储存在-20℃或-80℃下。打开管之前在室温下平衡肽粉末30分钟，以避免肽水合。首先通过添加纯DMSO(细胞培养级，SIGMA ref D2650-5X5ML)直接在管中溶解肽粉末，以获得20μl/mg浓度的肽。然后，根据所需的肽浓度，用合适体积的GIBCO无菌水(细胞培养级)稀释DMSO溶液。当前使用550μM的肽浓度。向DMSO溶液逐滴添加水体积。低速下利用涡流温和混合肽溶液2分钟并在水浴(Digital Ultrasonic Cleaning Bath BRANSON)中超声肽原液10分钟。
肽原液可在-80℃下储存1个月或在冷藏条件(2-8℃)下储存1周。肽原液等分为100μl样品并在-80℃储存。建议仅冻融一次。作为标准对照，根据使用的ADGN-100[ε280：27500]和ADGN106：[ε280：28400]肽，使用ε值基于在280nm下的UV吸光度验证肽浓度。
复合的最终肽的制备
肽原液在无菌水中稀释3.7倍，从而获得浓度为150μM的最终肽溶液，并在水浴(Digital Ultrasonic Cleaning Bath BRANSON)中超声10分钟。我们建议用270μl的GIBCO无菌水稀释100μl的肽原液，从而获得370μl体积的最终肽溶液。最终肽溶液在4℃下储存并在制备的10小时内使用。可以根据转染的数目调整体积。
与mRNA的复合物形成
报告以下方案进行在对应1孔(6孔板)的35mm皿中培养的2-5 106个细胞或约70-80％汇合下的细胞的转染。可以针对不同数目的细胞、较大体积制备和不同板格式调整方案。
在20:1摩尔比的ADGN-肽/mRNA下，制备ADGN肽/mRNA颗粒。在方案中描述了3个量的mRNA(0.1μg、0.5μg和2.0μg)。
首先，在室温下，在20μl的无菌水(GIBCO)中稀释mRNA(0.1、0.5或2.0μg)。2μl最终肽溶液添加0.1μg的mRNA，或10μl最终肽溶液添加0.5μg的mRNA，或40μl最终肽溶液添加2μg的mRNA以分别获得22μl、30μl或60μl的总体积。用无菌水调整体积至100μl。在低速下用涡流温和混合肽/mRNA溶液1分钟并在室温下培育30分钟，用于复合物形成。
就在转染前刻，通过添加含有5％蔗糖或5％葡萄糖的无菌水调整复合物的体积至200μl。发现PBS和高盐浓度导致颗粒聚集。因此，推荐避免它们。还发现，可以使用50％DMEM或OPTIMEM，这取决于细胞系或细胞类型的灵敏性。在体积调整后，在低速下用涡流温和混合复合物溶液1分钟，在37℃下培育5分钟，并用于细胞转染或体内施用。
转染方案
(i)黏着细胞系的方案：
以下方案用于24孔板格式。对于较大体积和不同的板格式，可以优化体积。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中培养细胞。转染之前那天接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为上至约70％汇合。
转染之前，用DMEM洗涤细胞两次。然后用0.2ml的复合物溶液覆盖细胞，温和混合，并在37℃下培育10分钟。添加0.4mL的新鲜OPTiMEM或DMEM并在37℃下培育细胞20分钟。然后添加2ml的含15％FCS的完全OPTiMEM(高葡萄糖)或DMEM，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/货物复合物的覆盖。将细胞返回至培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后72小时进行试验。
(ii)悬浮液中细胞系和T细胞的方案：
在转染时，在具有10％血清的高葡萄糖DMEM培养基中培养细胞至约70％的汇合。转染之前，通过离心收集细胞，然后用DMEM洗涤两次。然后将细胞重悬浮在0.2ml的复合物溶液中，温和混合并在37℃下培育10分钟。然后，添加0.4mL的新鲜OPTiMEM并在37℃下培育细胞30分钟。然后添加2mL的含12％FCS的完全OPTiMEM(高葡萄糖)，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/货物复合物的覆盖。将细胞返回至培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后72小时进行试验。
实施例1a：稀释剂对肽/mRNA复合物的纳米颗粒大小的影响。
出乎预料的发现，用PBS中制备的颗粒进行的转染(体外和体内)低于预期的。由于肽/mRNA复合物是中性的(ζ电势+10mv至-10Mv)，因此没有预期盐或缓冲液将显著影响颗粒。
因此，在不同缓冲液条件下分析ADGN 100和ADGN-106肽与mRNA形成稳定纳米颗粒的能力。评价以下缓冲液条件，包括无菌水、5％葡萄糖、5％蔗糖、20％PBS(20％和50％)、Hepes pH 7.4(50mM)、NaCl(40mM、80mM、160mM)、DMEM或OPTIMEM(20％和50％)。
使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得荧光素酶mRNA，使用质粒DNA模板(Luc2 pGL4-10)(Addgene)合成，并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。以20:1摩尔比的ADGN-肽/mRNA制备ADGN肽/mRNA颗粒。
在不同缓冲液条件下，以20：1摩尔比混合Luc mRNA与ADGN-100或ADGN-106。无菌水(GIBCO)中的Luc mRNA(0.5或1.0μg)与ADGN肽(无菌水)混合，用无菌水将每个样品的体积调整至100μl。以低速用涡流温和混合复合物1分钟并在室温下培育30分钟。就在开始测量前刻，通过添加不同的缓冲液将体积调整至200μl，并以低速用涡流温和混合复合物1分钟并在37℃下培育5分钟。在DLS NanoZS(Malvern Ltd)上测量颗粒大小和ζ电势。在25℃下每次测量3分钟确定ADGN/mRNA复合物的平均大小和多分散性，以及用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)测量ζ电势。
图1-4和表1中显示了3个单独实验平均值的数据。
表1
如图1A-1F和2A-2B所示，ADGN-100和ADGN-106肽都能够在水、葡萄糖(5％)、蔗糖(5％)和50mM Hepes pH 7.4中与mRNA形成稳定的纳米颗粒，其平均直径范围在98和130nm之间以及多分散性指数(PI)为0.25-0.27。在两种肽之间没有观察到主要的区别。通过ζ电势获得的颗粒电荷，对于ADGN-100和对于ADGN-106，平均值范围分别为-6.2mV至-7.2mV，和+5.3mV至+8.8mV。
在标准细胞培养基(诸如DMEM或OPTIMEM(20％和50％))中评价ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物的颗粒大小。如图2A-2B中所示，存在DMEM稍稍增加颗粒的大小。在培养基条件下，通过ζ电势获得的颗粒电荷类似于在蔗糖或水中获得的颗粒电荷，对于ADGN-100和对于ADGN-106，平均值分别为-12mV和+11mV。
相反，对于两种ADGN肽，存在高浓度的盐——在PBS或NaCl中的磷酸盐，导致较大的颗粒大小。如图3A-3B中所示，NaCl浓度从40mM增加至160mM，颗粒大小增加5至7倍，对于ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物，平均直径分别高达691nm和542nm。因此，对于ADGN-106和ADGN-100，存在50％PBS分别增加颗粒大小11和16倍。结果出乎预料地说明，对于ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物，水、蔗糖5％和葡萄糖5％导致最小的颗粒。相反，对于ADGN-100和ADGN-106两者，存在盐或磷酸盐出乎预料地导致形成更大的颗粒，这可以解释观察到的降低的转染潜能和潜在地也可增加颗粒毒性的风险。
血清(FCS)是细胞培养基中已经报道降低众多递送剂效率的主要成分。在众多敏感细胞类型的情况下，在转染期间存在血清或转染后即刻添加血清，以限制细胞死亡。因此，研究血清存在对颗粒大小和电荷的影响。在存在20％和50％FCS的情况下，评价ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA颗粒的平均大小和电荷。然后，在不同血清条件(20％和50％)下，培育水、蔗糖5％或葡萄糖5％中的ADGN-肽/mRNA颗粒30分钟。在25℃下每次测量3分钟用Zetasizer 4装置(Malvern Ltd)确定ADGN/mRNA复合物的平均大小和多分散性。图4A-4B和表2中显示了3个单独实验平均值的数据。
表2
如图4A-4B中所报告，游离血清特征在于在5±1nm和45±10nm处的两个不同的峰。当将蔗糖(5％)或葡萄糖(5％)溶液中的ADGN：mRNA纳米颗粒与血清(50％或20％最终浓度)混合时，获得大小约200nm的第三个峰。当将水中的ADGN：mRNA纳米颗粒与血清(50％或20％最终浓度)混合时，获得大小约450nm的第三个峰。这些结果说明颗粒的大小通过与血清蛋白或其他血清成分的相互作用而增加，并且由于血清蛋白在颗粒表面处的动态吸附，纳米颗粒被“蛋白冠”包围。在蔗糖或葡萄糖溶液中，纳米颗粒周围血清蛋白的缔合被限制。缔合进一步通过表面电荷测量的改性而确认，显示了在蔗糖溶液中，对于ADGN-106/mRNA纳米颗粒，在血清添加后，+7.3±2mV的正ζ电势至-10±3mV的负ζ电势之间的转变，以及对于ADGN-100/mRNA复合物，从-7.0±0.5mV至-15.2±0.5mV的增加。
结果证明，当在水中、葡萄糖或蔗糖溶液中储存时，ADGN-100和ADGN-106与mRNA形成稳定纳米颗粒。在葡萄糖或蔗糖中储存的纳米颗粒在纳米颗粒周围的血清蛋白的受限缔合的血清条件下是稳定的。相反，高盐浓度或PBS诱导颗粒大小增加。
实施例1b：ADGN-肽促进HepG2细胞中mRNA递送
评价ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA的HEPG2细胞中的荧光素酶mRNA的细胞内递送。
将无菌水(GIBCO)中Luc mRNA(0.5或1.0μg)与ADGN肽(无菌水)混合。用无菌水将每个样品的体积调整至100μl，并在低速下用涡流温和混合1分钟。室温下培育样品30分钟。就在开始转染前刻，通过添加不同的缓冲液将体积调整至200μl。评价以下缓冲液条件：包括无菌水、5％葡萄糖、5％蔗糖、20％PBS、50％PBS、Hepes pH 7.4(50mM)、NaCl(40mM、80mM、160mM)、DMEM(50％)。就在转染前刻，低速下用涡流温和混合样品1分钟并在37℃下培育5分钟。
在24孔板中培养HepG2细胞。在转染前那天接种100,000个HepG2细胞并生长至50-60％汇合。转染前，用DMEM洗涤细胞两次，并温和去除DMEM。然后用0.2ml的复合物溶液覆盖细胞、温和混合并在37℃下培育10分钟。添加没有血清和抗生素的0.4mL的新鲜DMEM并在37℃下培育细胞2小时。然后，在没有去除ADGN/mRNA复合物的覆盖的情况下，添加2mL的含有15％FCS的完全DMEM。将细胞返回培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后30小时测定荧光素酶表达。结果在图5中示出，其关于RLU(发光)相对于未处理细胞的百分数。
ADGN肽在蔗糖(5％)和葡萄糖(5％)中都观察到高水平的荧光素酶表达。荧光素酶表达效率在DMEM中降低20％并且当颗粒在水中时降低30-40％。在存在NaCl 40mM或80mM的情况中，颗粒的培育降低效率50％。最终，160mM NaCl或PBS的存在显著降低转染效率80-90％。该结果说明了，ADGN-100和ADGN-106促进mRNA在HepG2细胞中的有效递送。该结果还显示了，ADGN/mRNA颗粒在蔗糖和葡萄糖中导致高转染效率。相反，盐或磷酸盐的存在，增加了颗粒的大小并导致差的转染，可能阻止经由非内体途径进入细胞。
实施例1c：ADGN-肽促进体内mRNA递送
评价稳定ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA经由静脉内施用的荧光素酶mRNA的体内递送。
将无菌水(GIBCO)中Luc mRNA(10μg)与ADGN肽(无菌水)混合，用无菌水将每个样品的体积调整至100μl。在低速下用涡流温和混合样品1分钟并在室温下培育30分钟。就在注射前刻，通过添加不同的缓冲液(蔗糖5％、葡萄糖5％、NaCl 80mM或PBS 20％最终浓度)将体积调整至200μl。在低速下用涡流温和混合样品1分钟并在37℃下培育5分钟，然后立即注射入小鼠中。来自第1组和第2组的小鼠(每组3只动物)分别接受IV注射含有10μg LucmRNA的100μl ADGN-100/mRNA复合物或ADGN-106/mRNA溶液。作为对照，来自第3组的小鼠(每组2只动物)接受IV注射100μl盐水溶液。
通过生物发光监测mRNA Luc表达。在第3天和第6天进行生物发光成像。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素，用于非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。
使用制造商软件(Living Image；PerkinElmer)获得肝脏中荧光素酶信号的半定量数据。然后，结果表达为相对于第0天的值并示出在图6A和6B中。
如图6A-6B和7中所示，在第3天开始观察到在肝脏中ADGN-100和ADGN-106介导的体内mRNA递送和mRNA表达，以及在第6天观察到最佳值。对于两种肽，利用葡萄糖和蔗糖中的颗粒获得肝脏中较高的荧光素酶表达。相反，利用PBS中的颗粒获得了可忽略的荧光素酶表达，和利用NaCl 80mM中的颗粒获得仅5-10％表达，如图6A和6B中所示。
该结果确认了，葡萄糖和蔗糖对于体外和体内mRNA递送都是最好的稀释剂。由盐诱导的大聚集体不能够进入细胞和促进体内递送。
实施例2：肿瘤细胞中肽介导的PTEN肿瘤阻抑mRNA递送
在10号染色体(PTEN)上缺失的磷酸酶和张力蛋白同系物是众所周知的肿瘤阻抑蛋白，其具有磷酸酶依赖性和非依赖性作用。PTEN是癌症中最经常被破坏的肿瘤阻抑蛋白之一。通过阻抑磷酸肌醇3激酶(PI3K)–AKT–通过其脂质磷酸酶活性的雷帕霉素(mTOR)途径的哺乳动物靶标，PTEN控制大量的细胞过程，包括生存、增殖、能量代谢和细胞结构。因此，调节PTEN表达和功能的机制，包括转录调节、非编码RNA的转录后调节、翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用，都在癌症中改变。在大多数人类肿瘤亚型中，位于10q23号染色体上的PTEN基因中的病变以显著速率发生，并且该基因座被认为对人类中丧失具有最高的偏好。PTEN的灭活是肿瘤发生和肿瘤发展的关键事件，并且在P53基因之后，其在癌症中具有最高的突变频率。目前，PTEN基因的肿瘤阻抑机制可能涉及几种候选途径，包括FAK途径、MAPK途径和PI3K/AKT途径。
鉴于癌症亚型中高频率的PTEN缺乏，利用PTEN功能丧失的治疗性方法可提供有效的治疗策略。为了提出一种新的策略来恢复癌细胞中野生型PTEN的水平，我们评估了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在展示PTEN功能丧失的若干肿瘤细胞中递送PTEN mRNA的潜能，PTEN功能丧失与PTEN基因中的突变或PTEN中表达的丧失相关。
材料
使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得PTEN mRNA。使用线性载体PGL-PTEN作为DNA模板(Addgene13039)合成MRNA并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。通过LiCl沉淀、苯酚：氯仿萃取随后乙醇沉淀纯化合成的mRNA，然后通过UV光吸光度进行量化。通过测量260nm处紫外光吸光度确定RNA浓度。使用1μg的DNA模板获得18μg的加帽mRNA并在-20℃下储存。对于体内研究，从ThermoFisher获得CAS9mRNA，作为聚腺苷酸化和加帽形式。
使用以下的ADGN肽序列：
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)
胰腺癌细胞PANC-1、人胶质瘤细胞U25、前列腺癌细胞PC3、卵巢癌细胞SKOV3和人成纤维细胞HS69获得自ATCC。
方法
以下方案用于在24孔板中培养的2-5 106个细胞或约70-80％汇合下的细胞的转染。使用两个剂量的mRNA(0.5μg和1.0μg)，以20:1摩尔比的ADGN-肽/mRNA制备ADGN肽/mRNA颗粒。室温下在20μl的无菌水(GIBCO)中稀释PTEN mRNA(0.5或1.0μg)。10μl最终肽溶液添加0.5μg的mRNA或20μl最终肽溶液添加1μg的mRNA以分别获得30μl或40μl的总体积。用无菌水调整肽/mRNA溶液的体积至100μl。在低速下用涡流温和混合肽/mRNA溶液1分钟并在室温下培育30分钟。就转染前刻，通过添加含有5％蔗糖的无菌水补充体积至200μl。然后，在低速下用涡流温和混合溶液1分钟，并在37℃下培育5分钟。然后，溶液用于细胞转染或体内施用。
报告以下方案用于24孔板格式，并且对于较大体积和不同的板格式，可以优化体积。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM)中培养细胞。转染之前那天接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为上至约70％汇合。
转染之前，用DMEM洗涤细胞两次。然后用0.2ml的复合物溶液覆盖细胞，温和混合，并在37℃下培育10分钟。添加0.4mL的新鲜DMEM并在37℃下培育细胞20分钟。然后添加2ml的含15％FCS的完全OPTiMEM(高葡萄糖)或DMEM，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/货物复合物的覆盖。
将细胞返回至培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后72小时进行试验。使用PTEN单克隆抗体(A17 Thermofisher)通过蛋白质印记分析PTEN表达的水平。通过使用MTT试验的增值试验和使用流式细胞术试验的凋亡/细胞周期进展监测PTEN表达的影响。使用碘化丙啶(PI)染色试剂盒(Sigma-Aldrich)和APO BrDu试剂盒(Thermofisher)测量细胞凋亡率(表达为百分数)和细胞周期阶段。
结果
对于所有细胞类型，使用PTEN抗体(Thermofisher)通过蛋白质印记评价PTEN的水平。Image Lab 4.1软件被用于分析蛋白质带，并且相对蛋白质表达水平根据β-肌动蛋白(Abcam Inc.)进行归一化。
如图8A中所示，PTEN表达的水平依赖于细胞类型。在胶质瘤U25(10％)和PC3细胞(16％)中观察到非常低的PTEN表达。在PANC-1和SKOV3卵巢癌细胞中，PTEN的水平对应非转化细胞(HS-68)中水平的55％和63％。PTEN表达水平的差异与先前报道的研究一致；显示了PTEN活性的丧失主要与PTEN基因的突变相关(Min Sup Song et al,2013,Nature Rev MolCell Biol.Dillon&Tyler,Curr Drug Targets.2014 15(1)：65–79.)。
评价ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物在不同癌细胞类型中细胞内递送PTEN mRNA。用0.5和1μg与ADGN-100和ADGN-106复合的mRNA转染细胞，并在48小时后通过蛋白质印记分析PTEN表达的水平。如图8B中所示，在所有情况中，ADGN-100和ADGN-106促进PTEN mRNA的有效递送，这导致PTEN蛋白质表达。在U25和PC3中，与对照细胞类型相比，PTEN蛋白质的水平完全恢复。
然后通过监测6天时间段内的细胞增殖评价PTEN表达对癌细胞调节的影响。如图9和10中所示，在所有细胞类型中，PTEN mRNA的表达直接与细胞增殖的抑制相关联。在第6天标记癌细胞的生长曲线的降低。结果显示，野生型PTEN表达强烈降低细胞的生存力或减慢其增殖。
流式细胞术数据(图11)说明，与对照细胞相比，在表达野生型PTEN的细胞中，细胞凋亡率被显著地增强。在U25和PANC-1细胞中凋亡水平增加5倍和在SKOV-3和PC3细胞中增加2.5倍。
使用PI(碘化丙啶)染色试剂盒通过细胞计数测量细胞周期阶段。类似地，与对照细胞相比，在野生型PTEN转染的细胞中G0-G1期细胞的比例增加。G0-G1中细胞的数目从43-47％增加至72-74％(图12)。相反，在存在野生型PTEN的情况下，对于HS68没有观察到细胞周期进展的变化。
结果说明，ADGN-100和ADGN-106是在癌细胞中递送PTEN mRNA的有效药剂。ADGN肽介导的mRNA递送导致外源性野生型PTEN的大量表达，并通过彻底地抑制肿瘤细胞的生长、促进细胞凋亡并导致细胞周期停滞在G1期而拯救PTEN功能。
实施例3：在胰腺肿瘤异种移植模型中肽-介导的PTEN肿瘤阻抑mRNA体内递送
我们已经评价了ADGN肽(ADGN-100和ADGN-106)在胰腺肿瘤小鼠模型中体内递送PTEN mRNA的潜能。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μlPBS中20×106个细胞)。在22℃的恒温下具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。使用6组小鼠，包括2个对照组(G1&G2，每组2只动物)和4个处理组(G3-G6)(每组3只动物)。不同的组为：
G1-：对照未处理的小鼠(对照)(2只动物/组)
G2：裸mRNA 10ug(裸)(2只动物/组)
G3：ADGN-100/5μg PTEN mRNA剂量0.25mg/kg
G4：ADGN-100/10μg PTEN mRNA剂量0.5mg/kg
G5：ADGN-106/5μg PTEN mRNA剂量0.25mg/kg
G6：ADGN-106/10μg PTEN mRNA剂量0.5mg/kg
每7天为动物(G2-G6)注射裸mRNA或ADGN/mRNA复合物。小鼠接受IV尾静脉注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN/mRNA复合物。通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(Living Image；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达为光子/秒(光子/s)。在第0、7、14、20、26和33天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。在第33天，牺牲动物并收获肿瘤。
如图13和14A-14C中所示，在对照组和裸mRNA组中，肿瘤大小在33天的时间段内增加5.5至6倍。相反，使用ADGN-100或ADGN-106IV施用5μg的PTEN mRNA限制肿瘤生长至2.5和2.8倍。施用与ADGN-100或ADGN-106复合的10μg PTEN mRNA显著抑制肿瘤生长，大小增加仅1.5倍。结果说明了，ADGN肽介导有效的野生型PTEN mRNA递送，恢复PTEN功能并抑制胰腺肿瘤生长。
接下来，我们评价经由mRNA递送恢复PTEN功能可以抑制转移进展至何种程度。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中原位植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。在开始实验前，允许6周的时间段进行肿瘤和转移发展。6周后，在第0天和第3天，为动物注射对照盐水或ADGN/PTEN复合物。小鼠接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中100μlADGN-106/10μg PTEN mRNA(剂量0.5mg/kg)(G2组)复合物，和对照小鼠(G1)注射盐水缓冲液。在第0天和第7天通过生物发光成像评价肿瘤大小。
如图15A-15C中所示，ADGN-106介导的野生型PTEN mRNA递送显著限制转移进展。分析证明了在对照组中总发光在7天内增加2倍，具有若干转移进展。与对照组相比，注射ADGN/mRNA肽的小鼠相比第0天降低总发光12％至40％，并阻断转移建立。
实施例4：在胰腺肿瘤动物模型中肽-介导的PTEN(肿瘤阻抑)mRNA和KRAS(癌基因) siRNA的共同递送
已经评价了ADGN-106用于PTEN mRNA和KRAS siRNA的体内共同施用。正常KRAS蛋白质在正常组织信号传导中执行重要功能，并且KRAS基因的突变是许多癌症发展中的重要步骤。本文，我们组合了靶向KRAS癌基因的siRNA连同mRNA以恢复PTEN肿瘤阻抑蛋白功能并阻断KRAS癌基因的表达。这为抗癌靶向方法提供了新的希望。
我们已经首次验证了在培养的癌细胞系中递送KRAS siRNA的影响。我们选择了siRNA GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3′(有义)(SEQ ID NO:83)和5′-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3′(反义)(SEQ ID NO:84)来特异性靶向KRAS G12C突变。首次在培养的癌细胞上评价KRASsiRNA。KRAS siRNA(10nM和40nM)以20/1的肽摩尔比与ADGN-106缔合。利用ADGN-106：KRASsiRNA复合物转染胰腺癌细胞PANC-1、人胶质瘤细胞U25、前列腺癌细胞PC3、卵巢癌细胞SKOV3和人成纤维细胞HS68，然后在48小时和5天后测量KRAS表达水平和增殖。
如图16A中所示，使用小鼠单克隆抗-KRAS(Santa Cruz,Santa Cruz,CA)以及作为对照使用小鼠单克隆抗-肌动蛋白(Sigma,St.Louis,MO)的蛋白质印记分析揭示了，无论癌细胞类型如何，使用40mM siRNA浓度，kRAS水平降低超过80％。图16B显示了使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)转染后5天测量的细胞生存力。结果证明了，ADGN-106介导的KRAS siRNA诱导KRAS突变体的明显(marked)敲低，其直接与癌细胞增殖的显著降低相关联。相反，对于非转染的HS68成纤维细胞，没有获得增殖变化。
6周龄雌性裸小鼠注射人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。在22℃的恒温下具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。每7天对动物进行处理。在如下描述的组中，小鼠接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN复合物：
G1：对照未处理的小鼠(对照)
G2：ADGN-106/10μg PTEN mRNA剂量0.5mg/kg
G3：ADGN-106/10μg siRNA KRAS剂量0.5mg/kg
G4：ADGN-106/10μg siRNA KRAS剂量0.5mg/kg；ADGN-106/5μg PTEN mRNA剂量0.25mg/kg
通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(LivingImage；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达为光子/秒(光子/s)。在第0、7、14、20和26天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。在第26天，牺牲动物并收获肿瘤。
如图17A和17B中所示，在对照组中，在26天的时间段内，肿瘤大小增加4.6倍。使用ADGN-106IV施用10μg的PTEN mRNA减少肿瘤生长57％(2.0倍)。施用与ADGN-106复合的10μgKRAS siRNA抑制肿瘤生长35％(3.0倍增加)。组合mRNA PTEN(5μg)与KRAS siRNA(10μg)抑制肿瘤生长68％(1.5倍增加)。结果显示了，ADGN-106介导体内递送mRNA和siRNA，并说明了，在体内抑制胰腺肿瘤进展中mRNA PTEN和siRNA KRAS之间的协同作用。这些数据指示了，肿瘤阻抑基因和癌基因组合疗法可用于癌症治疗。
实施例5：体内ADGN介导的因子VIII mRNA递送评价
材料：
使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得因子VIII mRNA。施用线性载体PGL-因子VIII作为DNA模板(Addgene 13039)合成mRNA，并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。通过LiCl沉淀、苯酚：氯仿萃取随后乙醇沉淀纯化合成的mRNA，然后通过UV光吸光度进行量化。通过测量260nm处的紫外光吸光度确定RNA浓度。使用1μg的DNA模板获得18μg的加帽mRNA并在-20℃下储存。
从Thermo Fisher获得因子VIII siRNA，靶向小鼠因子VIII基因位置2912，siRNA(有义)GATGAGGCTATTCATGATGATT-3’(SEQ ID NO:85)。
使用以下的ADGN肽序列：
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)，和
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)。
结果
因子VIII(FVIII)是重要的血液凝集蛋白，也称为抗血友病因子(AHF)。在人体中，因子VIII由F8基因编码。该基因中的缺陷导致血友病A，一种隐性X连锁凝血障碍。因子VIII在肝窦细胞以及肝脏外部遍布身体的内皮细胞中产生。血友病A是罕见的X连锁隐性出血性障碍，其由FVIII缺乏或不存在引起。已经提出了几种方法来恢复血友病患者中的因子VIII水平，包括使用病毒载体。在本文中，我们研究了ADGN-100在肝脏中递送因子VIII mRNA从而恢复因子VIII水平的潜能。我们首先使用靶向FVIII的siRNA(siFVIII)通过在Balb C小鼠中靶向内源性肝细胞表达的凝血因子VIII(FVIII)建立了具有低因子VIII水平的小鼠。
为了获得肝脏中因子VIII表达的瞬时敲除，在第0天，来自G1组、G2组、G3组、G4组的小鼠接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN-100/siFVIII复合物(siFVIII剂量1.0mg/kg,10μg)。来自N1组的对照小鼠接受100μl含裸siRNA siFVIII 10μg的IV注射，以及来自C1组的未处理的对照小鼠接受100μl的盐水缓冲液。10天后，为动物注射ADGN-100/siFVIII，并按照如下进一步处理分为4个不同组的动物(每组3只动物)：
G1：未处理
G2：mRNA/ADGN-100(10μg)单次注射
G3：mRNA/ADGN-106(10μg)单次注射
G4：裸mRNA(10μg)单次注射
在从第0天至第50天的不同时间点使用因子VIIIELISA试剂盒对血液样品进行因子VIII水平监测。在第50天，向动物再注射siRNA复合物和在第60天向动物再注射mRNA复合物，如在G1至G4组中所描述的。然后，使用因子VIII Elisa试剂盒对血液样品进行因子VIII水平监测，直到第90天。每3至5天测量动物体重。
如图18中所示，ADGN-100介导的siRNA递送诱导血浆中因子VIII蛋白质水平的主要下调。在第2天开始观察到siRNA作用，并且在第10天达到72％敲低。ADGN-100和ADGN-106介导的FVIII mRNA递送导致快速肝脏表达和血浆中因子VIII水平的恢复。在mRNA施用后10至12天获得FVIII的总恢复。相反，在没有处理(G1组)的对照中或IV施用裸FVIIImRNA(G4组)，在第50天仅具有65％和72％的FVIII恢复。
所得的在50天用ADGN-siFVIII再治疗与第一次治疗类似的FVIII敲低。在60天用ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA再治疗显示了与初始治疗非常类似的FVIII水平恢复模式。我们证明了，治疗可以以相同的效率重复。
在动物体重中没有检测到ADGN相关毒性或修饰。而且，肝脏组织学分析(图19)显示了在两次连续治疗后在第90天没有炎性或慢性改变。因此，这些结果证明了，ADGN-100和ADGN-106肽可被用作体内施用mRNA的有效非毒性方法并且用于改正众多体内基因障碍。
实施例6：在PANC-1肿瘤模型中肽-介导的CRISPR复合物递送
材料：
Lipofectamine 2000、RNAiMAX、TranscriptAid T7转录试剂盒、MEGAclear转录清理试剂盒、GeneArt Genomic Cleavage Detection试剂盒和Platinum Green Hot StartPCR混合物获得自Thermo Fisher life Science(法国)。所有低聚核苷酸获得自Eurogentec(比利时)。
根据Hart,T.,et al.(2015).Cell,163(6),1515-1526使用sgRNA表达质粒(Addgene#74190，质粒pLCKO_Luciferase_sgRNA)通过体外转录获得荧光素酶gRNA。荧光素酶靶位点：ACAACTTTACCGACCGCGCC(SEQ ID NO:82)。通过体外转录获得RNA。使用含有T7启动子衔接序列的通用sgRNA表达质粒作为PCR产物的模板进行sgRNA的生成，其可以体外转录。按照制造商的说明书，使用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒(Thermo Fisher lifescience,法国)体外转录线性DNA片段，其含有T7启动子结合位点然后是20-bp sgRNA靶序列。体外转录的gRNA用乙醇沉淀并进一步使用MEGAclear转录清理试剂盒(Thermo Fisherlife Science)纯化。sgRNA原液在水中溶解，通过UV吸光度量化并在-80℃下储存。
从ThermoFisher获得CAS9 mRNA作为多腺苷酸化和加帽形式。
使用以下肽序列：
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)，和
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)。
细胞系诱导表达Luc2的PANC-1胰腺癌细胞和表达Luc2的卵巢癌细胞SKOV3。
以20：1摩尔比的ADGN-肽/核酸制备ADGN肽/mRNA/gRNA颗粒。使预混合的CAS9mRNA/gRNA(5μg/15μg)与ADGN-100以20：1摩尔比(肽与复合物)混合并在37℃下培育30分钟。在IV施用之前，在蔗糖5％溶液或盐水生理缓冲液(90mM NaCl最终浓度)中稀释复合物。
结果
我们评价了ADGN-100肽递送靶向表达荧光素酶的两种癌细胞类型上的荧光素酶的CRISPR复合物(mRNA CAS9/gRNA Luc)的潜能。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中培养细胞。转染之前那天接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为以上至约70％汇合。
转染之前，用DMEM洗涤细胞两次。然后用0.2ml的ADGN-100/CAS9 mRNA/gRNA Luc(0.2μg/2μg或0.5μg/5μg)覆盖细胞，温和混合，并在37℃下培育10分钟。添加0.4mL的新鲜DMEM并在37℃下培育细胞20分钟。然后添加2ml的含15％FCS的完全DMEM，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/货物复合物的覆盖。
将细胞返回培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后48小时测定荧光素酶表达。在图20中结果报告为RLU(发光)相对未处理细胞的百分数。对照包括用媒介物处理的细胞、用裸CAS9 mRNA/gRNA(0.5μg/5μg)处理的细胞，以及用RNAiMAX/CAS9 mRNA/gRNA(0.5μg/5μg)复合物处理的细胞。如图20中所示，在两个细胞系中，对于ADGN-100：CAS9mRNA/gRNA Luc 0.2μg/2μg和ADGN-100：CAS9 mRNA/gRNA Luc 0.5μg/5μg，ADGN-100介导CRISPR复合物的递送并诱导荧光素酶表达/KD中主要降低分别为80％和92％。相反，利用裸CAS9 mRNA/gRNA(0.5μg/5μg)没有观察到荧光素酶水平的变化。使用RNAiMAX——一种基于脂质的递送方法，获得约40％的KD。该数据建议了ADGN-100促进癌细胞中活性CRISPR复合物的递送。
我们接下来评价了在胰腺肿瘤小鼠模型中ADGN-100肽递送体内靶向荧光素酶的CRISPR复合物(mRNA CAS9/gRNA Luc)的潜能。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。在22℃的恒温下具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
使用两组小鼠(每组2只动物)：对照组，IV尾静脉注射盐水溶液；和ADGN/CRISPR组，注射ADGN-100/5μg CAS9 mRNA/15μg Luc gRNA。在第0天、第7天、第14天和第20天为动物进行注射。通过生物发光成像评价肿瘤大小和肿瘤中Luc表达的下调。在第0天、第7天、第14天、第20天和第28天进行生物发光成像。在第33天牺牲小鼠并收获肿瘤。
如图21A和21B中所示，IV施用靶向荧光素酶的ADGN-100/CRISPR复合物对肿瘤生长没有作用，因为在两组中肿瘤大小在33天的时间段内都增加了5.5倍(图21A)。相反，IV施用ADGN-100/CRISPR复合物明显降低肿瘤中荧光素酶表达的水平(图21B)。结果说明了，在3次施用复合物后，在肿瘤中ADGN肽介导有效的mRNA CAS9/gRNA递送，导致荧光素酶可忽略的水平。
实施例7：冠状动脉内局部药物递送
心肌梗塞后的梗塞康复可能会出现问题，并且心脏肌肉功能的恢复通常不完全。为了刺激梗塞的康复，局部施用VEGF可能会增加新血管至损伤部位的形成。直接向梗塞区域施用编码VEGF的mRNA可能是有益的。为了测试局部递送的能力，将编码β-半乳糖苷酶(β-gal)的mRNA与ADGN肽复合以形成肽/mRNA复合物。使用适合局部药物递送的导管，诸如多孔球囊导管(Scimed或Atrium)或微输液导管(例如，Bullfrog、Mercator Medsystems)，将肽/b-gal mRNA复合物(mRNA剂量10μg–100μg)与新西兰白兔或小型猪的冠状动脉壁接触或注射入新西兰白兔或小型猪的冠状动脉壁。输液实验后48小时，移出心脏和适当的动脉节段并固定在0.1M pH 7的磷酸缓冲盐水(PBS)中的CLSM或戊二醛(2.7％体积/体积)的福尔马林溶液中(4％体积/体积)，用于透射电子显微镜或适当制备用于可视化β-gal染色。染色的存在表明mRNA被有效转染并翻译为蛋白质。
使用目前可用的适当输注设备，可以在体内其他位置中实现所需mRNA的类似局部施用。
实施例8：在癌症治疗中同时体内PTEN拯救和KRAS沉默
方法：ADGN技术基于通过非共价键静电和疏水相互作用与众多核酸形成稳定中性纳米颗粒的短的两亲性肽。自组装的ADGN/核酸纳米颗粒随时间在血清和血浆条件下保持稳定。在胰腺(PANC1)、卵巢(SKOV3)、前列腺(PC3)和成胶质母细胞瘤(U25)细胞系上，评价具有野生型PTEN mRNA或靶向KRASG12D的SiRNA的ADGN肽复合物。通过蛋白质印记评价PTEN、KRAS和AKT磷酸化。通过流式细胞术和Tunel试验确定细胞增殖、细胞周期和凋亡活化。在PANC1-LUC小鼠异种移植物中测试与PTEN mRNA(0.25mg/kg)和/或KRAS siRNA(0.5mg/kg)复合的IV施用的ADGN-肽的体内效率。具体而言，6周龄裸小鼠注射人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)并允许肿瘤发展。然后在4周内每7天处理小鼠，如在表1中以下组中所描述。使用Luminex细胞因子20plex测量血液样品中对ADGN-核酸复合物的细胞因子应答。
表3.处理组
结果：在测试的细胞系中，ADGN-介导的野生型PTEN mRNA的递送拯救PTEN功能。用野生型PTEN mRNA转染的细胞恢复PTEN，其导致细胞增殖的90％降低、细胞凋亡的3-8倍活化、AKT磷酸化的降低以及细胞周期停滞在G1中。参见图22A-B、23和24。ADGN-介导的靶向KRAS的siRNA的递送诱导细胞系中KRAS表达60-70％的敲低并显著地降低生存力50-70％。参见图25A和25B。相比于其裸形式和盐水对照，ADGN/PTEN mRNA和ADGN/KRAS siRNA显示了显著的抗肿瘤作用。含有野生型PTEN mRNA的ADGN-纳米颗粒导致80％的肿瘤生长抑制(TGI)(p<0.0001ANOVA)。参见图26A和26B。含有siRNA KRAS的ADGN-纳米颗粒导致45-50％的TGI(p<0.0001ANOVA)。组合mRNA PTEN和siRNAs KRAS的ADGN纳米颗粒导致PANC1异种移植物中90％的TGI(p<0.0001,ANOVA)并也减慢远处转移的发展。参见图26A和26B，而未示出数据。耐受所有处理，任何组均无显著的体重减轻。参见图26C。在施用ADGN-核酸复合物后未观察到非特异性细胞因子应答。
结论：ADGN-肽纳米颗粒有效地促进体外和体内mRNA PTEN和/或siRNA KRAS递送。与mRNA和/或siRNA复合的ADGN-肽在体外和体内靶向突变的PTEN和KRAS中是有效的。此外，mRNA PTEN拯救与siRNA KRAS敲低的组合显著地抑制肿瘤生长。这建议了同时靶向肿瘤阻抑基因和癌基因的新的策略。
实施例9：肿瘤细胞中肽介导的p53肿瘤阻抑mRNA递送
材料
P53 mRNA：使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得P53mRNA。使用线性载体作为DNA模板(Addgene Plasmid#24859)合成mRNA，并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。合成的mRNA通过LiCl沉淀、苯酚：氯仿萃取，随后乙醇沉淀进行纯化，然后通过UV光吸光度进行量化。通过测量260nm处紫外光吸光度确定RNA浓度。使用1μg的DNA模板获得18μg的加帽mRNA并在-20℃下储存。对于体内研究，从ThermoFisher获得CAS9 mRNA，作为聚腺苷酸化和加帽形式。
ADGN肽：使用以下肽序列。
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)
细胞系：胰腺癌细胞PANC-1、前列腺癌细胞PC3、卵巢癌细胞SKOV3和人成纤维细胞HS68获得自ATCC。
方法
与mRNA的复合物形成。以下方案用于在24孔板中培养的2-5 106个细胞或约70-80％汇合下的细胞的转染。使用两个剂量的mRNA(0.5μg和1.0μg)，以20：1摩尔比的ADGN-肽/mRNA制备ADGN肽/mRNA颗粒。室温下在20μl的无菌水(GIBCO)中稀释P53 mRNA(0.5或1.0μg)。10μl最终肽溶液添加0.5μg的mRNA，或20μl最终肽溶液添加1μg的mRNA以分别获得30μl或40μl的总体积。用无菌水调整体积至100μl，并在低速下用涡流温和混合溶液1分钟并在室温下培育30分钟。就在转染前刻，通过添加含有5％蔗糖的无菌水补充体积至200μl，和在低速下用涡流温和混合溶液1分钟，并在37℃下培育5分钟，然后溶液进行细胞转染或体内施用。
转染方案。报告方案用于24孔板格式。对于较大体积和不同的板格式，可以优化体积。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM)中培养细胞。转染之前那天，接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为上至约70％汇合。
转染之前，用DMEM洗涤细胞两次，然后用0.2ml的复合物溶液覆盖细胞，温和混合，并在37℃下培育10分钟。添加0.4mL的新鲜DMEM并在37℃下培育细胞20分钟。然后添加2ml的含15％FCS的完全OPTiMEM(高葡萄糖)或DMEM，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/货物复合物的覆盖。
将细胞返回至培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后72小时进行试验。使用P53 WT单克隆抗体(p53抗体#9282细胞信号传导技术或DO SC126 Santa Cruz)通过蛋白质印记分析P53表达的水平，和通过使用MTT试验的增值试验和使用流式细胞术试验的凋亡/细胞周期进展监测P53 WT表达的影响。使用碘化丙啶(PI)染色试剂盒(Sigma-Aldrich)和APO BrDu试剂盒(Thermofisher)测量细胞凋亡率(表达为百分数)和细胞周期阶段。
结果
对于所有细胞类型，使用p53抗体(Thermofisher)通过蛋白质印记评价P53的水平。Image Lab 4.1软件被用于分析蛋白质带，并且相对蛋白质表达水平根据β-肌动蛋白(Abcam Inc.)进行归一化。
如图27A中所报告的，野生型P53表达的水平依赖于细胞类型。在PANC1(21％)和PC3细胞(20％)中观察到非常低的P53野生型表达。在SKOV3卵巢癌细胞中，野生型P53的水平对应非转化细胞(HS-68)水平的51％。P53野生型表达水平的差异与先前报道的研究一致；显示了P53野生型活性的丧失主要与P53基因中的突变相关。
评价ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物在不同癌细胞类型中细胞递送P53WTmRNA。用0.5和1μg与ADGN-100和ADGN-106复合的mRNA转染细胞，并在48小时后通过蛋白质印记分析P53表达的水平。如图27B中所报告的，在所有情况中，ADGN-100和ADGN-106促进P53 WT mRNA的有效递送，导致P53蛋白质表达。
然后通过监测6天时间段内的细胞增殖评价P53表达对癌细胞调节的影响。如图28中所示，在所有细胞类型中，P53野生型mRNA的表达直接与细胞增殖的抑制相关联。对于PANC1；PC3和SKOV3细胞，分别获得71％、63％和50％的细胞增殖抑制。在第6天标记癌细胞的生长曲线的降低，并指示，野生型P53表达强烈降低细胞的生存力或减慢其增殖。
图29中所示的流式细胞术数据证明了，与对照细胞相比，细胞凋亡率在表达野生型P53的细胞中显著增强。凋亡水平在PANC-1细胞中增加5倍以及在SKOV-3和PC3细胞中增加2.8倍。
结果说明了，ADGN-100和ADGN-106是用于在癌细胞中递送P53 mRNA的有效药剂。ADGN肽介导的mRNA递送导致外源性野生型P53的大量表达并通过通过彻底地抑制肿瘤细胞的生长和促进细胞凋亡以及细胞死亡拯救P53功能。
实施例10：在胰腺肿瘤异种移植模型中肽-介导的p53肿瘤阻抑mRNA体内递送
评价了在胰腺肿瘤小鼠模型中ADGN肽(ADGN-100)体内递送P53 mRNA的潜能。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20x106个细胞)。在22℃的恒温下具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。使用3组小鼠，包括2个对照组G1&G2(每组3只动物)和1个处理组(G3)(每组4只动物)。不同的组为：
G1：对照未处理的小鼠(对照)(3只动物/组)
G2：裸mRNA 10ug(NAKED)(3只动物/组)
G3：ADGN-100/10μg P53 mRNA剂量0.5mg/kg
每5天为动物进行注射。小鼠接受IV尾静脉注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN/mRNA复合物。通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(Living Image；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达光子/秒(光子/s)。在第0、7、14和21天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。
如图30中所报告的，在对照组和裸mRNA组中，肿瘤大小在21天的时间段内增加3.4至3.6倍。使用ADGN-100IV施用10μg P53 mRNA显著抑制肿瘤生长，大小增加仅2.3倍。结果说明了，ADGN肽介导有效的野生型P53 mRNA递送，恢复P53功能并抑制胰腺肿瘤生长。
实施例11：在肿瘤细胞中肽-介导的p53或PTEN mRNA和KRAS siRNA的共同递送
已经评价了ADGN-100和ADGN-106用于PTEN mRNA或P53 mRNA和靶向若干KRAS突变的siRNA混合物的共同递送。正常KRAS蛋白质在正常组织信号传导中执行重要功能，并且KRAS基因的突变是许多癌症发展中的重要步骤。本文，我们组合了靶向KRAS癌基因的siRNA连同mRNA以恢复PTEN或/和P53肿瘤阻抑蛋白功能。这可以为抗癌靶向方法提供了新的希望。
首次验证了在培养的癌细胞中递送有效抑制KRAS表达的不同KRAS siRNA的影响，而不论密码子12或61处特定错义突变。选择以下KRAS siRNA：
siRNA 5’-GUUGGAGCUUGUGGCGUAGTT-3′(有义)(SEQ ID NO:83)和5′-CUACGCCACCAGCUCCAACTT-3′(反义)(SEQ ID NO:84)，以特异性靶向KRAS G12C突变。
siRNA 5’-GAAGUGCAUACACCGAGACTT-3’′(有义)(SEQ ID NO:86)和5′-GUCUCGGUGUAGCACUUCTT-3′(反义)(SEQ ID NO:87)，以特异性靶向KRAS Q61K突变。
siRNA 5′-GUUGGAGCUGUUGGCGUAGTT-3′(有义)(SEQ ID NO:88)和5′-CUACGCCAACAGCUCCAACTT-3′(反义)(SEQ ID NO:89)，以特异性靶向KRAS G12D突变。
首次在培养的癌细胞上评价KRAS siRNA。单一的KRAS siRNA(10nM和40nM)或KRASsiRNA的组合(每种5nM或20nM)以20/1的肽摩尔比与ADGN-106缔合。
利用ADGN-106：KRAS siRNA复合物转染胰腺癌细胞PANC-1、前列腺癌细胞PC3、卵巢癌细胞SKOV3和人成纤维细胞HS68，然后在6天后的时间段内测量细胞增殖。
图31A和31B以及表4报告了使用CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay(Promega)转染后7天测量的细胞增殖。结果说明了，ADGN-106介导的KRAS siRNA诱导KRAS突变体的明显KD，其与癌细胞增殖的显著降低直接相关联。组合靶向G12D和G12C突变体的siRNA增加测试的所有癌细胞类型的增殖抑制。即使在低浓度下，组合G12D和G12CsiRNA也显示了明显的增强。相反，通过添加靶向Q61K KRAS突变的siRNA没有获得增强。对于非转染的HS68成纤维细胞，没有获得增殖变化。
表4.转染后7天测量的细胞增殖的抑制(以％计)。
已经评价了ADGN-100和ADGN-106用于共同递送PTEN mRNA或P53 mRNA和靶向若干KRAS突变的siRNA的混合物。PTEN和P53 mRNA与KRAS siRNA组合并在PANC1和SKOV-3癌细胞上进行评价。ADGN-100用于分别以0.25μg(5.7nM)和0.5μg(11.5nM)进行mRNA PTEN和P53递送。ADGN 106用于分别以5nM进行KRAS siRNA(G12D/G12C)递送。在图32和表5中报告了细胞增殖数据。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)转染后8天的时间段内测量细胞增殖。如图32和表5中所报告，组合mRNA连同siRNA KRAS存在重要的协同作用。组合KRAS G12D/G12C与PTEN或P53 mRNA显著地增加了癌细胞增殖的抑制。利用PTEN mRNA/KRAS siRNA或P53mRNA/KRAS siRNA获得了重要的增强。组合PTEN mRNA与P53mRNA导致对细胞增殖的中度影响而通过组合所有三种PTEN mRNA/P53 mRNA/KRAS siRNA没有获得显著的增强。这些数据指示了，肿瘤阻抑基因和癌基因组合疗法可以用于癌症治疗。
表5.转染后7天测量的细胞增殖抑制的抑制作用(以％计)
实施例12：在胰腺肿瘤异种移植物模型中肽介导的体内KRAS siRNA递送
评价了共同施用靶向密码子12处突变的KRAS siRNA的影响。6周龄雌性裸小鼠注射人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。在22℃的恒温下具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。每7天对动物进行处理。在如下的组中描述的，小鼠接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN复合物：
G1：对照未处理的小鼠(对照)
G2：5μg siRNA G12C/5μg siRNA G12D KRAS剂量0.5mg/kg
G3：ADGN-106/5μg siRNA G12C/5μg siRNA G12D KRAS剂量0.5mg/kg
通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(LivingImage；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达为光子/秒(光子/s)。在第0、7、14和21天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。
如图33中所报告的，在对照组和裸siNRA组中，在21天的时间段内，肿瘤大小增加3.6和3.4倍。使用ADGN-106IV施用5μg siRNA G12C/5μg siRNA G12D mRNA减少肿瘤生长77％(1.5倍)。结果显示了，ADGN-106介导体内递送KRAS G12C和G12D siRNA，并说明了在体内抑制胰腺肿瘤进展中，siRNA KRAS之间的协同作用。
实施例13：体内ADGN-介导的因子VIII mRNA递送评价
在IV或皮下(SQ)施用之后，评价了ADGN-100/ADGN 106在肝脏中递送因子VIIImRNA从而恢复因子III水平的潜能。首先使用靶向FVIII的CRISPR(CRISPR FVIII)通过在Balb C小鼠中靶向内源性肝细胞表达的凝血因子VIII(FVIII)建立了具有低因子VIII水平的小鼠。
设计因子VIII gRNA以通过引起因子VIII(小鼠)基因内的5'组成外显子I中的双链断链(DSB)来破坏基因表达。使用源自基因组规模的CRISPR Knock-Out(GeCKO)v2文库的sgRNA表达质粒体外转录获得因子VIII gRNA。因子VIII靶向位点：ATGAAGCACCTGAACACCGT(SEQ ID NO:90)。通过体外转录获得RNA。使用含有T7启动子衔接序列的通用sgRNA表达质粒作为PCR产物的模板进行sgRNA的传生成，其可以体外转录。按照制造商的说明书，使用TranscriptAid T7高产率转录试剂盒(Thermo Fisher life science,法国)体外转录线性DNA片段，其含有T7启动子结合位点然后是20-bp sgRNA靶序列。体外转录的gRNA用乙醇沉淀并进一步使用MEGAclear转录清理试剂盒(Thermo Fisher life Science)纯化。sgRNA原液在水中溶解，通过UV吸光度量化并在-80℃下储存。
从ThermoFisher获得CAS9 mRNA，作为聚腺苷酸化和加帽形式。在该实验中使用27只小鼠。来自G1组(3只小鼠)的对照小鼠接受IV注射100μl盐水缓冲液作为未处理的对照组。为了获得肝脏中因子VIII表达的永久敲除，在第0天，来自G2-G8组(每组3只小鼠)的剩余24只小鼠接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN-100/CRISPRmRNA/F VIIIgRNA复合物(CRISPR gRNA FVIII，剂量0.5mg/kg)。10天后，注射ADGN-100/CRISPR F VIII的动物被分为8个不同的组(每组3只动物)，如下：
G2：未处理
G3：mRNA/ADGN-100(20μg单次SQ注射)
G4：mRNA/ADGN-100(40μg单次SQ注射)
G5：mRNA/ADGN-100(50μg单次SQ注射)
G6：mRNA/ADGN-106(20μg单次SQ注射)
G7：mRNA/ADGN-106(40μg单次SQ注射)
G8：mRNA/ADGN-106(50μg单次SQ注射)
G9：mRNA/ADGN-100(10μg单次IV注射)
在从第0天至第45天的不同时间点使用因子VIII Elisa试剂盒对血液样品进行因子VIII水平监测。每3至5天测量动物体重。
如图34中所报告的，ADGN-100介导的CRISPR F VIII复合物递送诱导血浆中因子VIII蛋白质水平的主要下调。在第2天开始观察到CRISPR作用，在第10天达到75％敲低。ADGN-100和ADGN-106介导的FVIII mRNA递送导致mRNA剂量依赖的快速肝脏表达和血浆中因子VIII水平的恢复。分别在mRNA IV和SQ施用后10天和15天获得FVIII的恢复。如表6中所报告的，FVIII恢复的水平依赖于施用模式和注射的mRNA的剂量。在10天期间，mRNA水平保持，然后与因子VIII体内转换一致，快速降低。相反，在对照中，在第50天没有测量到FVIII恢复。
表6.mRNA施用后15天(实验第30天)FVIII恢复的水平(实验第30天)
处理
因子VIII恢复(％)
对照小鼠
100
无
0
mRNA/ADGN-100 10μg IV
81
mRNA/ADGN-100 20μg SQ
41
mRNA/ADGN-100 40μg SQ
58
mRNA/ADGN-100 50μg SQ
68
mRNA/ADGN-106 20μg SQ
36
mRNA/ADGN-106 40μg SQ
61
mRNA/ADGN-106 50μg SQ
64
在动物体重中没有检测到ADGN相关毒性或修饰。因此，ADGN-100和ADGN-106是用于体内IV和SQ施用mRNA的有效非毒性方法并且可以用于改正众多体内基因障碍。
接下来，评价了不同剂量的mRNA，其可以经由多次SQ施用以保持因子VIII表达水平高于60％用于治疗。为了获得肝脏中因子VIII表达的永久敲除，在第0天，一组新的BalbC小鼠(G2-G8组)(根据以下表7)接受IV注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN-100/CRISPR mRNA/F VIII gRNA复合物(CRISPR gRNA F VIII，剂量0.5mg/kg)。作为对照，来自G1组的小鼠接受IV注射100μl的盐水缓冲液，作为未处理组。10天后，注射ADGN-100/CRISPRF VIII的动物SQ注射初始mRNA/ADGN-100剂量(40μg单次SQ注射)，在2周时，将动物分为5个不同的组(每组4只动物)并通过SQ注射不同剂量的mRNA复合物进行处理(根据下表)。使用Elisa显色因子VIII活性试验监测因子VIII水平。一周一次测量动物体重。在3个月的时间段内进行处理。
表7.
如图35中所报告的，ADGN-100介导的CRISPR F VIII复合物递送诱导血浆中因子VIII蛋白质水平的主要下调，以在第10天达到75-78％敲低。ADGN-100介导的40μg FVIIImRNA SQ递送导致快速的肝脏表达和血浆中高达60％的因子VIII水平的恢复。在mRNA施用后10天获得FVIII的恢复。初始mRNA剂量注射后2周，SQ注射20μg、30μg和40μg的mRNA保持因子VIII表达水平在60％。相反，SQ注射10μg mRNA的小鼠显示因子VIII表达的降低。
实施例14：在胰腺和卵巢肿瘤中肽-介导的p53或PTEN mRNA和KRAS siRNA的共同 递送
已经评价了在胰腺和卵巢肿瘤小鼠模型中ADGN-100和ADGN-106用于PTEN mRNA或P53 mRNA和靶向若干KRAS突变的siRNA混合物的体内共同施用。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)或具有卵巢癌细胞(SKOV3-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。
在22℃的恒温下的具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
如表8中所示，使用15组小鼠(每组4只动物)。
表8.
每5天为动物进行注射。小鼠接受IV尾静脉注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN/mRNA或ADGN/siRNA复合物。通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(Living Image；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达为光子/秒(光子/s)。在第0、7、14和21天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。
A.在胰腺肿瘤中肽-介导的p53或PTEN mRNA和KRAS siRNA的共同递送
已经评价了在胰腺和卵巢肿瘤小鼠模型中ADGN-100和ADGN-106用于PTEN mRNA或P53 mRNA和靶向若干KRAS突变的siRNA混合物的体内共同递送。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
在22℃的恒温下的具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
鉴定了6组小鼠：对照未处理小鼠(G1)、注射ADGN-100/PTEN mRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G2)、注射ADGN-100/P53 mRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G3)、注射ADGN-100/PTEN mRNA(0.5mg/kg)/ADGN-106/KRAS SiRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G4)、注射ADGN-100/PTEN mRNA/P53mRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G5)以及注射ADGN-100/P53mRNA(0.5mg/kg)/ADGN-106/KRASsiRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G6)。每7天动物进行IV尾静脉注射。在第0、4、7、11、15、20、25、30、37天通过生物发光成像评价肿瘤大小。
如图42中所报告的，在对照组中，在25天的时间段内，肿瘤大小增加5.5倍。使用ADGN-100IV施用PTEN mRNA(0.5mg/kg)或P53 mRNA(0.5mg/kg)分别限制肿瘤生长至3.5和4.2倍。经由IV施用10μg的PTEN mRNA/ADGN-100和靶向KRAS(G12D、G12C)的siRNA混合物/ADGN-106(每种5μg)的共同递送在25天的时间段内限制肿瘤生长至2.9倍以及在38天的时间段至3.8倍，其对应肿瘤生长的47％抑制。经由IV施用10μg的P53mRNA/ADGN-100和靶向KRAS(G12D、G12C)的siRNA混合物/ADGN-106(每种5μg)的共同递送在25天的时间段内限制肿瘤生长至3.4倍以及在38天的时间段至4.4倍，其对应肿瘤生长的38％抑制。经由使用ADGN-100IV施用10μg的PTEN mRNA/P53 mRNA的共同递送在25天的时间段内限制肿瘤生长至2.4倍以及在38天的时间段至3.0倍，其对应肿瘤生长的59％抑制。
结果说明了，在体内抑制胰腺肿瘤进展方面中，恢复PTEN和P53功能之间以及恢复P53功能和抑制KRAS突变之间的协同作用。这些数据指示了，肿瘤阻抑基因和癌基因组合疗法可用于癌症治疗。
实施例15：组合Abraxane(nab-太平洋紫杉醇)和/或吉西他滨，在胰腺肿瘤中肽- 介导的PTEN mRNA和/或KRAS siRNA的共同递送
已经评价了在胰腺小鼠模型中ADGN-100和ADGN-106用于PTEN mRNA和靶向若干KRAS突变(G12D/G12C)的siRNA混合物的体内共同递送。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。
在22℃的恒温下的具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
如表9中所示，使用多组小鼠(每组4只动物)。
表9.
每5天为动物进行注射。小鼠接受IV尾静脉注射盐水缓冲液(90mM NaCl)中的100μl ADGN/mRNA或ADGN/siRNA复合物。通过生物发光成像评价肿瘤大小。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素进行非侵入生物发光成像(IVIS Kinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。使用制造商软件(Living Image；PerkinElmer)获得荧光素酶阳性肿瘤细胞信号的半定量数据。结果表达为光子/秒(光子/s)。在第0、7、14和21天进行生物发光成像。然后，结果表达为相对于第0天的值。
A.组合Abraxane(nab-太平洋紫杉醇)，在胰腺肿瘤中肽-介导的PTEN mRNA和/或 KRAS siRNA的共同递送
已经评价了在胰腺小鼠模型中ADGN-100和ADGN-106用于PTEN mRNA和靶向若干KRAS突变(G12D/G12C)的siRNA混合物的体内共同递送。6周龄雌性裸小鼠的胰腺中植入人胰腺癌细胞系(Panc1-Luc)(在200μl PBS中20×106个细胞)。
在22℃的恒温下的具有12h/12h亮/暗循环的专用房间中，在无病原体条件下保持动物并随意喂食和供水，每个笼中2至4只动物(符合推荐的表面积/动物)。在开始实验之前，允许3周的时间段进行肿瘤发展。
每周一次在第0、7、14、21、28和34天注射动物。小鼠接受IV注射100μl ADGN-100/PTEN mRNA(10μg,0.5mg/kg)或ADGN-106/KRAS SiRNA G12C&G12D(5ug/5μg)复合物和/或Abraxane(50μg太平洋紫杉醇,2.5mg/kg)。鉴定六组小鼠：对照未处理小鼠(G1)、注射ADGN/PTEN mRNA(0.5mg/kg)/ADGN/KRAS siRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G2)、注射Abraxane(2.5mg/kg)的小鼠(G3)、注射Abraxane(2.5mg/kg)ADGN/PTEN mRNA(0.5mg/kg)的小鼠(G4)、注射Abraxane(2.5mg/kg)ADGN-106/KRAS SiRNA G12C&G12D(0.5mg/kg)的小鼠(G5)或注射Abraxane(2.5mg/kg)/ADGN-100/PTEN mRNA(0.5mg/kg)/ADGN-106/KRAS SiRNA G12C&G12D(0.5mg/kg)的小鼠(G6)。每7天动物进行IV尾静脉注射。在第0、4、7、11、15、20、25、30、37天通过生物发光成像评价肿瘤大小。
在图43中报告了结果，在对照组中，肿瘤大小在25天的时间段内增加5.4倍。经由IV施用10μg的PTEN mRNA/ADGN-100和靶向KRAS(G12D,G12C)的siRNA混合物/ADGN-106(每种5μg)的共同递送在25天的时间段内限制肿瘤生长至2.9倍以及在38天的时间段至4.2倍，其对应肿瘤生长的47％抑制。施用Abraxane(50μg,2.5mg/kg)在25天的时间段内降低肿瘤生长至3.9倍和在38天的时间段内至5.2倍，对应于肿瘤生长的29％抑制。
组合Abraxane连同ADGN-100/PTEN mRNA或ADGN-106/KRAS SiRNA G12C&G12D分别显著地抑制肿瘤生长75％和70％。在两种情况中，在38天的时间段内，肿瘤大小仅增加1.8倍。最惊人地，与第0天相比，用Abraxane、ADGN-100/PTEN mRNA和ADGN-106/KRAS siRNAG12C&G12D的组合处理的小鼠具有收缩的肿瘤。
实施例16：在人骨肉瘤细胞中ADGN介导的p53肿瘤阻抑mRNA递送
所有成骨肉瘤(OS)中大部分都带有使p53灭活的p53改变。p53活性的丧失可能成为这些肿瘤的癌基因驱动因素。对改进的疗法的需求是这种青少年和年轻人的高侵袭性骨肿瘤在过去的20年中并未改变疗法和结果的事实所证明的。使用ADGN肽和p53 mRNA，我们可以在OS中重新表达p53。完全遗传表征的人类OS细胞系，例如G292、HOS、SaOS和MG63，都带有p53改变。这些细胞系中的每一种也将成长为小鼠异种移植物。
我们将使用实时成像测试野生型p53的重新表达对这些OS细胞系体外生长的影响。将每个细胞系进行一式四份测试，并且我们通过每4小时测定实时成像获得生长曲线，比较表达wtp53的细胞和对照感染的细胞。然后，我们在用ADGN-肽p53 mRNA复合物处理的小鼠异种移植物模型中进行这些研究。
实施例17：在人骨肉瘤细胞中ADGN介导的p53肿瘤阻抑mRNA或eGFP mRNA递送评价了在人骨肉瘤细胞G-292中ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物用于P53 WT mRNA或eGFP mRNA的细胞递送。
A.p53肿瘤阻抑mRNA或eGFP mRNA的递送
材料
mRNA.eGFP mRNA被用作转染的阳性对照。CleanCapTM EGFP mRNA(5moU)获得自Trilink Biotechnology(USA)。使用HiScribeTM T7 ARCA mRNA Kit(New England Biolab)获得P53 mRNA。使用线性载体作为DNA模板(Addgene Plasmid#24859)合成mRNA，并通过苯酚：氯仿萃取进行纯化。合成的mRNA通过LiCl沉淀，苯酚：氯仿萃取，随后乙醇沉淀进行纯化，然后通过UV光吸光度进行量化。不添加具体修饰来增强mRNA翻译或核酸酶稳定性。通过测量260nm处紫外光吸光度确定RNA浓度。使用1μg的DNA模板获得18μg的加帽mRNA并在-20℃下储存。
ADGN肽：使用以下肽序列。
ADGN-106：βALWRALWRLWRSLWRLLWKA(SEQ ID NO:77)
ADGN-100：βAKWRSAGWRWRLWRVRSWSR(SEQ ID NO:79)
细胞系：人骨肉瘤细胞G-292、克隆A141B1获得自ATCC。
方法。与mRNA的复合物形成。以下方案用于在24孔板中培养的2-5 106个细胞或约70-80％汇合下的细胞的转染。使用三个剂量的mRNA(0.25μg、0.5μg和1.0μg)，以20：1摩尔比的ADGN-肽/mRNA(ADGN-100或ADGN-106)制备ADGN肽/mRNA颗粒。室温下，在20μl的无菌水(GIBCO)中稀释P53 mRNA或eGFP mRNA(0.25、0.5和1μg)。5μl、10μl和20μl最终肽溶液分别添加0.25μg、0.5μg和1μg的mRNA以获得20μl或30μl的总体积。用无菌水调整体积至50μl，并在低速下用涡流温和混合溶液1分钟并在室温下培育30分钟。就在转染前刻，通过添加含有5％蔗糖的无菌水补充体积至100μl，和在低速下用涡流温和混合溶液1分钟，并在37℃下培育5分钟，然后溶液进行细胞转染。
转染方案。报告方案用于24孔板格式。在含有5％CO2的潮湿气氛中，在37℃下，补充有2mM谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/mL、青霉素10,000IU/mL)和10％(w/v)胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)中培养细胞。转染之前那天，接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为上至约70％汇合。转染之前，用DMEM洗涤细胞两次。然后用0.1ml的复合物溶液覆盖细胞，温和混合，并在37℃下培育10分钟。添加0.2mL的新鲜DMEM并在37℃下培育细胞20分钟。然后添加1mL的含15％FCS的完全DMEM，以便达到10％的最终FCS浓度，而不需要去除ADGN-肽/mRNA复合物的覆盖。
将细胞返回至培养箱(37℃，5％CO2)并在转染后2、4、5和7天进行试验。通过蛋白质印记和使用MTT试验的增值试验监测P53 WT的表达和影响并通过流式细胞术试验量化eGFP表达。
结果
通过流式细胞术评价eGFP表达的水平。如图36中所报告的，在所有情况中，ADGN-100和ADGN-106促进eGFP mRNA的有效递送，导致剂量依赖性方式的eGFP表达。使用ADGN100或ADGN106进行递送，在所有mRNA浓度下观察eGFP mRNA表达。在0.25μg和0.5μg mRNA浓度之间eGFP表达增加2倍而在0.5和1μg mRNA之间仅增加25％。在所有情况中，在第2天开始eGFP的表达，在第5天具有最大蛋白质表达，其在第7天依然稳定。
如图37中所报告的，使用具有ADGN-100和ADGN-106颗粒的0.5和1.0μg的mRNA显著增加P53 WT的表达。利用0.5和1.0μg mRNA分别增加P53的水平5倍和7-8倍。使用0.25μgmRNA，仅观察到P53水平的小变化(背景的1.2倍)。
如图38中所报告的，P53 WT mRNA的表达与细胞增殖的抑制直接相关联。使用与ADGN-106或ADGN-100复合的1.0μg mRNA分别获得59％和56％的细胞增殖抑制。使用与ADGN-106或ADGN-100复合的0.5μg mRNA分别获得31％和38％的细胞增殖抑制。相反，使用与ADGN-106或ADGN-100复合的0.25μg mRNA分别仅获得8％和11％的轻微细胞增殖抑制。在第7天标记G292细胞的生长曲线的降低，并指示野生型P53表达降低细胞的生存力或减慢其增殖。与ADGN-106或ADGN-100复合的eGFP mRNA被用作对照(0.5ug)并与非处理对象类似不显示细胞增殖的抑制。
结果说明了ADGN-100和ADGN-106是用于在人骨肉瘤细胞G-292中递送P53 mRNA的有效药剂。ADGN肽介导的mRNA递送通过抑制肿瘤细胞的生长导致拯救P53功能。
B.5moU修饰的eGFP mRNA的递送
评价了ADGN-100/mRNA和ADGN-106/mRNA复合物用于在人骨肉瘤细胞G-292中细胞递送5moU修饰的eGFP mRNA。我们评价了mRNA的5moU修饰对细胞表达水平和ADGN/mRNA复合物稳定性的影响。在24孔板中生长G292细胞。在细胞处理之前，未修饰的和5moU修饰的0.5μg和1μg的eGFP mRNA与ADGN-100和ADGN-106缔合，并在存在包含10％或25％胎牛血清(FCS)的完全培养基存在的情况下培育3小时后评价ADGN/mRNA复合物的稳定性。在第6天通过流式细胞术评价eGFP表达的水平。
如图41中所报告的，在所有情况中，ADGN-100和ADGN-106促进eGFP mRNA和eGFPmRNA 5moU的有效递送，导致eGFP表达。对于ADGN-100和ADGN-106两者，当使用包括5moU修饰的mRNA时，eGFP表达增加25％。在用10％血清培育之后，没有观察到对eGFP表达水平的改变。相反，25％血清的存在降低50-60％eGFP表达，无论使用何种mRNA。
实施例18：经由局部递送的ADGN介导的体内mRNA luc递送
评价了稳定的ADGN-106/mRNA用于经由雾化/非外科气管内施用体内递送荧光素酶mRNA。无菌水(GIBCO)中的5moU修饰的Luc mRNA(60μg)与ADGN肽(无菌水)混合，并用无菌水调整体积至500μl。在低速下用涡流温和混合样品1分钟并在室温下培育30分钟。就在注射前刻，用蔗糖20％调整体积至600μl以达到5％的最终蔗糖浓度。在低速下用涡流温和混合样品1分钟并施用至小鼠内。
来自1组的小鼠经由雾化/非手术气管内施用分别接受含有10μg的Luc mRNA的ADGN-106/mRNA溶液(每组6只动物)。作为对照，来自2组的小鼠(每组2只动物)接受雾化/非手术气管内施用100μl盐水溶液。通过生物发光监测mRNA Luc表达。在施用后6小时和24小时执行生物发光成像。小鼠接受i.p.注射150μg/g荧光素，用于非侵入生物发光成像(IVISKinetic；PerkinElmer,Waltham,MA,USA)。在24小时时牺牲动物并收获器官。通过生物发光监测不同器官中的mRNA表达。器官用荧光素(300μg/mL)培育，然后通过离体生物发光进行分析。
如图39中所报告的，ADGN-106介导经由雾化的体内mRNA递送。6小时后主要在肺中观察到高荧光素酶表达，并且在24小时保留。相反，在对照小鼠组中没有观察到荧光素酶信号。如图40中所示的，不同器官的分析说明了，在24小时后，荧光素酶表达主要在肺中。
结果说明了，ADGN-106是用于经由雾化/非手术气管内施用在肺中体内靶向递送mRNA的有效技术。
实施例19：纳米颗粒介导的体内递送功能性mRNA：对癌症疗法的意义
RNA是通用分子，其包含生命的所有生化功能，并构成所有细胞过程中的核心角色。因此，mRNA治疗具有无数的应用，并提供许多优点。癌症疗法中mRNA治疗的一个令人振奋的发展是拯救突变或丢失的蛋白质的功能形式。
然而，将功能完整的mRNA有效递送至细胞仍然是mRNA治疗领域中的关键挑战。mRNA分子无法穿过细胞/组织屏障，易于被核酸酶快速降解并激活先天免疫途径。本文中，我们报告了一个新的递送平台，其可以在哺乳动物细胞系和体内有效保护和递送功能性mRNA。
ADGN技术基于短的两亲性的肽，其通过非共价静电和疏水相互作用与核酸复合物形成稳定的中性纳米粒子。肽/mRNA纳米粒子的自组装随时间在血清和血浆条件下保持稳定。我们证明了ADGN纳米颗粒在包括原代T细胞的多个细胞系中和动物模型中复合、递送和释放mRNA的功效。当通过全身静脉内注射应用时，ADGN促进mRNA在靶组织中的递送而不会触发任何非特异性炎性应答。
我们研究了用于肿瘤阻抑基因拯救的ADGN-技术，其可以在癌症中具有治疗潜力。肿瘤阻抑基因PTEN和P53在肿瘤发生中扮演重要作用。P53和PTEN突变和得到的功能丧失在各种肿瘤中是常见的并且影响肿瘤细胞增殖。我们显示了在若干癌细胞系(包括胰腺(PANC1)、卵巢(SKOV3)、前列腺(PC3)、成胶质母细胞瘤(U25)和骨肉瘤(G292))中ADGN-介导的wt P53 mRNA或wt PTEN mRNA递送拯救肿瘤阻抑基因功能。恢复PTEN导致细胞增殖的降低、细胞凋亡的活化、AKT磷酸化的降低和细胞周期停滞在G1。在PANC1小鼠异种移植物中测试了IV-施用的ADGN/PTEN mRNA和ADGN/P53 mRNA的体内功效。含有wt p53 mRNA(0.5mg/kg)和wt PTEN mRNA(0.5mg/kg)的ADGN-纳米颗粒分别导致50％和80％的肿瘤生长抑制(TGI)。ADGN-PTEN mRNA纳米颗粒和ADGN-p53 mRNA纳米颗粒的组合导致PANC1异种移植物中90％的TGI，并且还减慢了远处转移的发展。在施用ADGN-核酸复合物后没有观察到非特异性细胞因子应答。
与mRNA复合的ADGN纳米颗粒在体外和体内均可有效拯救PTEN和P53。考虑到mRNA疗法的强大潜力，本研究揭示了ADGN介导的mRNA递送的潜能，以验证肿瘤阻抑基因作为癌症治疗中的治疗性靶标。
序列表
序列表
<110> 阿迪根有限公司
<120> 用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒
<130> 73737-20010.42
<140> 未转让
<141> 与此同时
<150> FR 1759645
<151> 2017-10-16
<150> FR 1853370
<151> 2018-04-17
<160> 92
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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Xaa
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Lys
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Arg
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Arg
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Arg
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Xaa Leu Trp Trp Ser Arg Trp Trp Arg Ser Trp Phe Arg Leu Trp Phe
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Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<221> 变体
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Xaa Lys Phe Trp Ser Arg Phe Trp Arg Ser Trp Phe Arg Leu Trp Arg
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Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<221> 变体
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<221> 变体
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<223> Xaa = 任何非天然氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> 5, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 14
Xaa Arg Trp Trp Xaa Leu Trp Trp Arg Ser Trp Xaa Arg Leu Trp Arg
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Arg
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<220>
<223> 合成构建体
<220>
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20
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<223> 合成构建体
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<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu, Trp, Cys或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser, Ala, Asn或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Leu或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> Xaa = Trp或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> Xaa = Ala 和可能不存在
<400> 16
Xaa Leu Xaa Leu Ala Arg Trp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Trp Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Phe或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 8, 11, 15
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu, Trp, Cys或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser, Ala, Asn或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Leu或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> Xaa = Trp或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> Xaa = Ala 和可能不存在
<400> 17
Xaa Leu Xaa Ala Arg Leu Trp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Trp Xaa Leu
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Phe或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu, Trp, Cys或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser, Ala, Asn或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Leu或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> Xaa = Trp或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> Xaa = Ala 和可能不存在
<400> 18
Xaa Leu Xaa Arg Ala Leu Trp Arg Leu Xaa Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = Phe或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 10, 17
<223> Xaa = Leu或Trp
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser, Ala或Asn
<220>
<221> 变体
<222> 18
<223> Xaa = Trp或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 20
<223> Xaa = Ala 和可能不存在
<400> 19
Xaa Leu Xaa Arg Ala Leu Trp Arg Leu Xaa Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Xaa Xaa Lys Xaa
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 20
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Xaa
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 21
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Trp Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Xaa Ala
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu, Cys或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 22
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Xaa Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Trp Arg Xaa Ala
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 23
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Trp Arg Xaa Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Trp Arg Xaa Ala
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 24
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Xaa Arg Ala Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Xaa Ala
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Leu, Cys或Ile
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 25
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Xaa Arg Asn Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Xaa Ala
20
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 26
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 27
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Trp Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys Ala
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 28
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Trp Arg Lys Ala
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 29
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Trp Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Trp Arg Lys Ala
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 30
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ala Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys Ala
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 31
Xaa Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Asn Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys Ala
20
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 32
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 33
Xaa Leu Phe Leu Ala Arg Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 34
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Ser Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 35
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 35
Xaa Leu Phe Leu Ala Arg Trp Ser Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 11, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 36
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Ser Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 11, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 37
Xaa Leu Phe Leu Ala Arg Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Ser Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 11, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 38
Xaa Leu Phe Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Ser Ser Leu Trp Ser Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 11, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 39
Xaa Leu Phe Leu Ala Arg Trp Arg Leu Leu Ser Ser Leu Trp Ser Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 5, 12
<223> 通过烃键连接
<400> 40
Xaa Leu Phe Ala Arg Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Leu 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 3, 11
<223> Xaa = Arg 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = Leu, Arg或Gly
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Arg, Trp或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Ser, Pro或Thr
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Trp或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> Xaa = Phe, Ala或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa = Ser, Leu, Pro或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> Xaa = Trp 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Ala或Arg, 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Trp或Phe
<220>
<221> 变体
<222> 3, 11, 2, 16, 17
<223> 其中如果3和11位不存在，那么2,16和17位也不存在
<400> 41
Xaa Xaa Xaa Trp Trp Xaa Xaa Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Trp Xaa Arg
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = Leu 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Ser或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 13
<223> Xaa = Phe或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 14
<223> Xaa = Ser, Leu或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Ala或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 19
<223> Xaa = Trp或Phe
<400> 42
Xaa Xaa Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Xaa Arg Trp Xaa Xaa Xaa Trp
1 5 10 15
Xaa Trp Xaa Arg
20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 43
Xaa Leu Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Phe Ser Arg Trp
1 5 10 15
Ala Trp Trp Arg
20
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 44
Xaa Leu Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Ala Ser Arg Trp
1 5 10 15
Ala Trp Phe Arg
20
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 45
Xaa Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Ala Leu Ser Trp Arg
1 5 10 15
Trp Trp Arg
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 46
Xaa Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Phe Leu Ser Trp Arg
1 5 10 15
Trp Trp Arg
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 47
Xaa Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Pro Arg Trp Phe Pro Ser Trp Arg
1 5 10 15
Trp Trp Arg
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 48
Xaa Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Ala Pro Ser Trp Arg
1 5 10 15
Trp Trp Arg
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = Arg或Gly
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> Xaa = Trp或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa = Ser, Thr或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> Xaa = Trp或Pro
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = Ala或Arg
<220>
<221> 变体
<222> 12
<223> Xaa = Ser或Arg
<400> 49
Xaa Trp Trp Xaa Xaa Trp Ala Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Trp Trp Arg
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 50
Xaa Trp Trp Arg Trp Trp Ala Ser Trp Ala Arg Ser Trp Trp Arg
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 51
Xaa Trp Trp Gly Ser Trp Ala Thr Pro Arg Arg Arg Trp Trp Arg
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser
<400> 52
Xaa Trp Trp Arg Trp Trp Ala Pro Trp Ala Arg Ser Trp Trp Arg
1 5 10 15
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = Any Amino Acid 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18
<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 53
Xaa Lys Trp Arg Ser Xaa Xaa Xaa Arg Trp Arg Leu Trp Arg Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Ser Arg
20
<210> 54
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> Xaa = β-Ala或Ser, 和可能不存在
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = Ala或Val
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = Gly或Leu
<220>
<221> 变体
<222> 8, 18
<223> Xaa = Trp或Tyr
<220>
<221> 变体
<222> 15
<223> Xaa = Val或Ser
<220>
<221> 变体
<222> 16
<223> Xaa = Arg, Val或Ala
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = Ser或Leu
<400> 54
Xaa Lys Trp Arg Ser Xaa Xaa Xaa Arg Trp Arg Leu Trp Arg Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Ser Arg
20
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Lys Trp Arg Ser Ala Gly Trp Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 58
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Arg
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 4, 8
<223> 通过烃键连接
<400> 59
Lys Trp Arg Ser Ala Gly Trp Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 10
<223> 通过烃键连接
<400> 60
Lys Trp Arg Ser Ala Gly Trp Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 61
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 8, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 61
Lys Trp Arg Ser Ala Gly Trp Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 4, 8
<223> 通过烃键连接
<400> 62
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 63
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 10
<223> 通过烃键连接
<400> 63
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 64
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 8, 15
<223> 通过烃键连接
<400> 64
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 10, 14
<223> 通过烃键连接
<400> 65
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 66
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 14, 18
<223> 通过烃键连接
<400> 66
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Arg Ser
1 5 10 15
Trp Ser Arg
<210> 67
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 3, 10
<223> 通过烃键连接
<400> 67
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Arg
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 4, 8
<223> 通过烃键连接
<400> 68
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Arg
<210> 69
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 10, 14
<223> 通过烃键连接
<400> 69
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Arg
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 14, 18
<223> 通过烃键连接
<400> 70
Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Ser Arg
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Lys Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Pro Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 74
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 75
Ala Lys Trp Phe Glu Arg Trp Phe Arg Glu Trp Pro Arg Lys Arg Arg
1 5 10 15
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 76
Ala Lys Trp Trp Glu Arg Trp Trp Arg Glu Trp Pro Arg Lys Arg Arg
1 5 10 15
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 77
Ala Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Trp Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys Ala
20
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 78
Ala Leu Arg Trp Trp Leu Arg Trp Ala Ser Arg Trp Phe Ser Arg Trp
1 5 10 15
Ala Trp Trp Arg
20
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 79
Ala Lys Trp Arg Ser Ala Gly Trp Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg
1 5 10 15
Ser Trp Ser Arg
20
<210> 80
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> β-Ala
<400> 80
Ala Lys Trp Arg Ser Ala Leu Tyr Arg Trp Arg Leu Trp Arg Val Arg
1 5 10 15
Ser Trp Ser Arg
20
<210> 81
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Lys Val
20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
acaactttac cgaccgcgcc 20
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
guuggagcuu guggcguagt t 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
cuacgccacc agcuccaact t 21
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
gatgaggcta ttcatgatga tt 22
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
gaagugcaua caccgagact t 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
gucucggugu agcacuuctt 20
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
guuggagcug uuggcguagt t 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
cuacgccaac agcuccaact t 21
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
atgaagcacc tgaacaccgt 20
<210> 91
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 3
<223> n = A或G
<400> 91
ccnccaugg 9
<210> 92
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 7
<223> n = A或G
<400> 92
gccgccncca ugg 13
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