阅读说明：本技术 代谢工程 (Metabolic engineering ) 是由 A·奥斯本 J·里德 于 2018-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明总体上涉及通过在宿主中表达异源核苷酸序列以在宿主中生物合成皂皮酸的材料和方法,所述异源核苷酸序列中的每一种编码一种多肽,所述多肽组合起来具有所述QA生物合成活性。示例性多肽包括(i)β-香树脂醇合酶；(ii)能够在C-28位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为羧酸的酶；(iii)能够在C-16α位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为醇的酶；和(iv)能够在C-23位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为醛的酶。优选的核苷酸序列从皂皮树(Q.saponaria)获得或衍生自皂皮树。(The present invention relates generally to materials and methods for the biosynthesis of quillajac acid in a host by expression of heterologous nucleotide sequences in the host, each of which encodes a polypeptide that in combination has the QA biosynthetic activity.exemplary polypeptides include (i) β -balsamic alcohol synthase, (ii) an enzyme capable of oxidizing β -balsamic alcohol or its oxidized derivative to a carboxylic acid at the C-28 position, (iii) an enzyme capable of oxidizing β -balsamic alcohol or its oxidized derivative to an alcohol at the C-16 α position, and (iv) an enzyme capable of oxidizing β -balsamic alcohol or its oxidized derivative to an aldehyde at the C-23 position.)

代谢工程

技术领域

本发明总体上涉及用于在宿主细胞中工程化或修饰皂皮酸产生或水解的基因和多肽。本发明进一步涉及系统、方法和采用所述系统、方法的产物。

背景技术

植物产生多种环状三萜烯，如甾醇和三萜类(triterpenoid)，所述环状三萜烯是甲羟戊酸(MVA)途径的主要产物。

QS-21是通过智利树皂皮树(Quillaja saponaria)(豆目)合成的复杂三萜类皂苷。

核心QS-21三萜烯骨架是皂皮酸(“QA”)；此骨架用存在于C-3位置处的支链三糖和存在于C-28位置处的直链四糖修饰。所述C-28直链四糖还以复杂的阿拉伯糖基化酰基链为特征(图1)。

QS-21用作免疫刺激佐剂。然而，QS-21的生物学来源是有限的，并且由于其结构和QA的复杂性，化学合成是具有挑战的。

因此，可以看出，用于合成QA的新颖系统，尤其用于制备QS-21，将对本领域做出贡献。

发明内容

QS-21(皂皮酸)的核心糖苷配基(aglycone)是简单三萜烯β-香树脂醇的衍生物，而所述β-香树脂醇是通过氧化鲨烯环化酶(OSC)使通用线性前体2,3-氧化鲨烯(OS)环化而合成的(图2)。

所述β-香树脂醇骨架进一步分别在C-16α、C-23和C-28位置处用醇、醛和羧酸氧化以形成皂皮酸。为此，在图2中给出了一个建议的线性生物合成途径，但应理解，这些氧化反应可以经由不同的中间体以不同的顺序发生(参见图11)。

因此，来自OS的QA生物合成包括至少四个不同的酶促步骤。所涉及的酶包括：

·氧化鲨烯环化酶；

·能够在C-28位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为羧酸的酶；

·能够在C-16α位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如齐墩果酸)氧化为醇的酶；

·能够在C-23位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如刺囊酸)氧化为醛的酶。

图11中示出了由这些酶的连续氧化作用所产生的β-香树脂醇的氧化衍生物，并且总结于下表中：

举例来说，使用图2的说明性方案，这些酶可以分别是：

·β-香树脂醇合酶；

·能够将β-香树脂醇氧化为齐墩果酸的酶；

·能够将齐墩果酸氧化为刺囊酸的酶；

·能够将刺囊酸氧化为QA的酶。

诸位发明人已经成功地将整个QA生物合成途径工程化到异源生物中，所述异源生物原本不是QA产生者。具体地，诸位发明人通过将根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株共渗入本氏烟草(N.benthamiana)中来证明了本发明。在此首次描述了通过生物合成基因的共表达实现了皂皮酸的异源生产，并且代表了对本领域的主要贡献。

更具体地，诸位发明人证明了至少四个另外的基因(bAS和3个CYP450)足以用于QA生物合成。这些有利地与任选的HMG-CoA还原酶组合以增加产物水平。

此外，在对本领域的进一步贡献中，诸位发明人已经鉴定出皂皮树中编码影响QA生物合成的多肽的基因。

尤其是本文所述的方法和材料可用于产生可产生QA的重组宿主生物(例如植物或微生物)，尽管所述QA不是由野生型宿主天然产生的。

根据本发明的皂皮酸的从头工程化可以产生包含大量QA的植物或微生物，而所述QA可用于例如QS-21的进一步化学合成[18]。

因此，在本发明的一方面提供了一种将宿主从其中宿主无法从OS进行QA生物合成的表型转化为其中宿主能够进行所述QA生物合成的表型的方法，

所述方法包括在将异源核酸引入所述宿主或其祖先的较早步骤之后，在所述宿主或其一种或多种细胞中表达所述异源核酸的步骤，

其中所述异源核酸包含多种核苷酸序列，所述多种核苷酸序列中的每一种编码一种多肽，所述多肽组合起来具有所述QA生物合成活性。

优选地，所述核酸编码以下酶中的一些或全部(一种、两种、三种或四种)：

·用于将通用线性前体2,3-氧化鲨烯(OS)环化为三萜烯的β-香树脂醇合酶(bAS)；

·能够在C-28位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物氧化为羧酸的CYP450；能够在C-16α位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如齐墩果酸)氧化为醇的CYP450；

·能够在C-23位置处将β-香树脂醇或其氧化衍生物(如刺囊酸)氧化为醛的CYP450。

在某些实施方案中，这些CYP450酶可以是：

·能够在C-28位置处将β-香树脂醇氧化为羧酸从而形成齐墩果酸的CYP450；

·能够在C-16α位置处将齐墩果酸氧化为醇从而形成刺囊酸的CYP450；

·能够在C-23位置处将刺囊酸氧化为醛从而形成QA的CYP450。

根据本文的公开内容以及特别是图11，本领域技术人员将理解其他潜在的中间体。

为简洁起见，这些酶在本文中可以分别称为“bAS”、“C-28氧化酶”、“C-16α氧化酶”和“C-23氧化酶”。

为进一步简洁起见，这些酶在本文中可以统称为“QA多肽”。

在一个实施方案中，QA多肽中的至少一种源自(衍生自)皂皮树(Q.saponaria)。优选地，2种、3种或全部4种QA多肽源自皂皮树。

在一个实施方案中：

所述C-28氧化酶是CYP716

所述C-16α是CYP716或CYP87

所述C-23氧化酶是CYP714、CYP72或CYP94

序列附件中示出了用于本发明实践中的优选基因或多肽。

在优选的实施方案中，对应的多肽中的一种、两种、三种或四种选自表1中列出的皂皮树序列，例如，如下：

β-香树脂醇合酶(bAS)＝SEQ ID:No 2

C-28氧化酶＝SEQ ID:No 4

C-16α氧化酶＝SEQ ID:No 6

C-23氧化酶＝SEQ ID:No 8

或如下所讨论的其变体或其片段。

在其他实施方案中，对应的多肽中的一种、两种或三种选自表2a、2b或2c中列出的非皂皮树序列，例如，如下：

C-28氧化酶＝SEQ ID:No 18

C-16α氧化酶＝SEQ ID:No 10或12

C-23氧化酶＝SEQ ID:No 14或16

或如下所讨论的其变体或其片段。

在某些实施方案中，QA多肽由SEQ ID:No 1、3、5、7、9、11、13、15或17中任一个所示的核苷酸序列编码。

或如下所讨论的其变体或其片段。

在其他实施方案中，C-28氧化酶是由非皂皮树登记表中的一种编码的多肽或是所述多肽的如下所讨论的变体或片段，所述非皂皮树登记表在表2d中列为SEQ ID No 19-28：(VvCYP716A15、VvCYP716A17、PgCYP716A52v2、MlCYP716A75、CqCYP716A78、CqCYP716A79、BvCYP716A80、BvCYP716A81、MdCYP716A175或CrCYP716AL1)。这些核苷酸序列在本文中分别称为SEQ ID NO:19-28。

为简洁起见，表1和2中任一个的核苷酸序列在本文中可以称为“QA基因”。

变体

除了使用这些QA基因(和多肽)外，本发明涵盖了这些基因(和多肽)的变体的使用。

“变体”QA核酸或QA多肽分子与本文所讨论的全部或部分QA基因或多肽享有同源性或相同。

变体多肽享有天然QA多肽的相关生物活性。变体核酸编码相关的变体多肽。

在此上下文中，QA多肽的“生物活性”是催化图2所示和上述的对应反应的能力(即环化酶或氧化酶活性)。可以基于图2所示的反应(或相应的氧化反应，例如根据图11)在体外测定相关生物活性。可替代地，可以如实施例中所述通过体内活性来测定它们，即通过引入多种异源构建体以产生QA，所述QA可以通过LC-MS等测定。

表8示出了本文所述的P450酶的成对比较，所述P450酶是使用Clustal Omega(版本1.2.4-通过https://www.ebi.ac.uk访问)获得的。

本文所公开的序列的变体优选地享有至少50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、65％或70％或80％同一性，更优选地至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。此类变体在本文中可以称为“基本上同源的”。

优选的变体可以是：

(i)天然存在的核酸，如等位基因(其将包括在一个或多个碱基处的多态性或突变)或拟等位基因(其将在与本发明的QA基因紧密连锁的基因座处出现)。还包括与本发明的QA基因属于相同家族的旁系同源物、等基因或其他同源基因。还包括来自其他植物物种的直向同源物或同源物。

表4展示了鉴定的在1KP数据集中发现的基因序列与在本公开文本中的从皂皮树植物中通过PCR获得的测序克隆之间的微小序列差异。这表明即使在a c.1500bp的OQHZ-2012090的情况下，也鉴定了19个变异(超过1％变异)。

本公开文本具体设想了使用包括在对应序列中表4中描述的一种或多种变异的QA基因或多肽。

此外，在本发明的范围内包括编码作为本发明的QA基因的同源物的氨基酸序列的核酸分子。同源性可以是核苷酸序列和/或氨基酸序列水平，如下所讨论。

(ii)人工核酸，其可以根据本公开文本由技术人员制备。可以例如通过定点诱变或随机诱变或通过直接合成来制备此类衍生物。优选地，从具有本发明的QA基因的全部或部分序列的原始核酸直接或间接(例如，经由一个或多个扩增或复制步骤)产生变体核酸。

还包括与上述核酸相对应，但是已经在3'或5'末端延伸的核酸。

如本文所用，术语“QA变体核酸”涵盖所有这些可能性。当用于多肽或蛋白质的背景中时，它指示编码的变体核酸表达产物。

在每种情况下，优选的QA-生物合成修饰核酸是SEQ ID No 1、3、5、7、9、11、13、15和17中的任一个或其基本上同源的变体。

优选的QA-生物合成修饰多肽是SEQ ID No 2、4、6、8、10、12、14、16和18中的任一个或其基本上同源的变体。

其他用于本发明的优选的QA-生物合成修饰核酸是SEQ ID No 19至28中的任一个，或其基本上同源的变体或片段。其他优选的QA-生物合成修饰多肽是由这些序列或变体或片段中的任一个编码的多肽。

补充基因

在本发明的实施方案中，除了本文所述的本发明的QA基因和变体核酸之外，可优选引入可影响QA产生通量的其他基因。

例如MVA是三萜类合成中重要的中间体。因此，可能需要将限速MVA途径基因表达到宿主中，以最大化QA的产量。

认为HMG-CoA还原酶(HMGR)是MVA途径中的限速酶。

已经证实重组反馈不敏感的截短HMGR形式(tHMGR)的使用增加了在本氏烟草中瞬时表达后的三萜烯(β-香树脂醇)含量[5]，也参见图10。

因此，本发明的一个实施方案包含本文所述的异源HMGR(例如反馈不敏感的HMGR)连同QA基因的使用。HMGR编码序列或多肽序列的例子包括SEQ ID No 29至32或它们的变体或片段。如上文所述，如关于QA基因或多肽所讨论的，变体可以是同源物、等位基因或人工衍生物等。例如，对所用宿主为天然的HMGR可能是优选的-例如酵母宿主中的酵母HMGR等。HMGR基因是本领域已知的并且可以根据本公开文本适当地选择。

还报道了鲨烯合酶(SQS；参见图10)是潜在的限速步骤[5]。

因此，本发明的一个实施方案包含本文所述的异源SQS连同QA基因和任选地HMGR的使用。

SQS编码序列或多肽序列的例子包括SEQ ID No 33至34或它们的变体或片段。如上文所述，如关于QA基因或多肽所讨论的，变体可以是同源物、等位基因或人工衍生物等。例如，对所用宿主为天然的SQS可能是优选的-例如酵母宿主中的酵母SQS等。SQS基因是本领域已知的并且可以根据本公开文本适当地选择。

当使用某些宿主(例如酵母)时，可能需要引入其他基因以改善QA产生通量。例子可包括一种或多种植物细胞色素P450还原酶(CPR)，其用作所引入P450的氧化还原伴侣。因此，本发明的一个实施方案包含本文所述的异源细胞色素P450还原酶(如AtATR2(拟南芥细胞色素P450还原酶2))连同QA基因的使用。HAtATR2编码序列或多肽序列的例子包括SEQ IDNo 35至36或它们的变体或片段。如上文所述，如关于QA基因或多肽所讨论的，变体可以是同源物、等位基因或人工衍生物等。

根据本公开文本，本领域技术人员将理解，在本发明的实践中可以使用另外的基因，以提供另外的活性和/或改善表达或活性。这些包括表达辅因子或辅助蛋白或其他因子的那些。例子可包括参与由QA合成QS-21的基因。

为简洁起见，这些核酸序列(“本发明的QA基因”和“QA变体核酸”，加上实现QA合成或对QA的二次修饰的其他基因)中的任一种在本文中可以称为“QA核酸”或“QA-生物合成修饰核酸”。同样地，编码的多肽在本文中可以称为“QA多肽”或“QA-生物合成修饰多肽”。

应当理解，在关于任何方面或实施方案使用这些通用术语的情况下，含义将被单独地应用于这些序列中的任一种。

载体

作为本发明的一个方面，公开了一种方法，所述方法采用多种根癌土壤杆菌菌株的共渗入，每种菌株携带上文讨论的QA核酸中的一种或多种，以用于其在上文讨论的生物合成途径中协同表达。

在一些实施方案中，至少3种或4种不同的根癌土壤杆菌菌株是共渗入的，例如每种菌株携带一种QA核酸。

所述基因可以存在于瞬时表达载体中。

一种优选的表达系统使用了所谓的“‘超可翻译'豇豆花叶病毒(‘CPMV-HT')系统，所述系统描述于WO 2009/087391中，其披露内容被特定地并入本文以支持使用CPMV-HT系统(例如基于pEAQ-HT表达质粒的载体)的实施方案。

因此，用于本发明的载体(通常为二元载体)通常将包含表达盒，所述表达盒包含：

(i)启动子，所述启动子可操作地连接至

(ii)增强子序列，所述增强子序列衍生自二分体RNA病毒的RNA-2基因组区段，其中所述RNA-2基因组区段中的靶起始位点已经发生突变；

(iii)如上所述的QA核酸序列；

(iv)终止子序列；以及任选地

(v)3’UTR，所述3’UTR位于所述终止子序列的上游。

在下文中更详细地描述了可用于本发明的实践中的载体和表达系统的其他例子。

宿主

在本发明的方面，可以将宿主从其中宿主无法从OS进行有效的QA生物合成的表型转化为其中宿主能够进行所述QA生物合成的表型，从而能够从体内回收QA或在体内使用QA，以合成下游产物。宿主的例子包括植物(如本氏烟草(Nicotiana benthamiana))和微生物(如酵母)。以下更详细地讨论了这些。

本发明可以包括通过以下方式用如上所述的异源核酸转化宿主：经由载体将QA核酸引入宿主细胞，并且引起或允许载体与宿主细胞基因组之间的重组以将根据本发明的核酸引入所述基因组。

在本发明的另一方面，提供了一种用异源核酸转化的宿主细胞，所述异源核酸包含多种核苷酸序列，所述核苷酸序列中的每一种编码一种多肽，所述多肽组合起来具有所述QA生物合成活性，

其中所述核酸的表达赋予所转化的宿主从OS进行QA生物合成的能力，或改善宿主中的所述能力。

本发明进一步涵盖用如上所述的核酸或载体(例如包含QA-生物合成修饰核苷酸序列)转化的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。在转基因宿主细胞(即对所讨论的核酸为转基因的)中，所述转基因可以在基因组外载体上或可以优选稳定地掺入基因组中。每个单倍体基因组可能有多于一个的异源核苷酸序列。

本文所述的方法和材料尤其可以用于产生积累QA的稳定作物植物。

还提供了包括根据本发明的植物细胞的植物。

产物的产生

上述方法可用于在异源宿主中产生QA。QA通常在引入了它们的物种中是非天然存在的。

来自本发明的植物或方法的QA可以被分离并且可以被商业利用。

上述方法可以构成在宿主中产生QS-21的方法的一部分，可能是其中的一个步骤。所述方法可以包括以下步骤：培养宿主(其中，所述宿主是微生物)或使宿主生长(其中，所述宿主是植物)，并且然后收获所述宿主并且从中纯化QA或QS-21产物。因此，所产生的产物形成本发明的另一方面。QA或QS-21产物的实用性如上所述。

可替代地，可以回收QA，以允许QS-21的进一步化学合成[18]。

本发明的新颖基因

为了支持本发明，诸位发明人具有来自皂皮树的新表征序列，认为所述序列参与了该物种中QA的合成(参见SEQ.ID:No 1-8)

在优选的实施方案中，本发明的方法将包括使用本发明的这些新表征的QA核酸中的一种或多种(例如一种、两种、三种或四种此类QA核酸)，任选地连同操纵影响本领域已知的QA生物合成的其他基因。

这些来自皂皮树的新表征的QA序列(SEQ.ID:No 1-8)形成本发明本身的方面，这些序列的衍生的变体和材料和使用它们的方法也形成本发明本身的方面。

现在将更详细地描述本发明的一些方面和实施方案。

具体实施方式

在不同的实施方案中，本发明提供了操纵宿主细胞(如微生物或植物)中QA总水平的手段。

在本发明的一方面，上文所述的QA-生物合成修饰核酸处于重组和优选可复制的载体的形式。

将“载体”定义为尤其包括双链或单链线性或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或土壤杆菌属二元载体，所述载体可以是或可以不是自我传送或可移动的，并且可以通过整合入细胞基因组转化原核或真核宿主，或所述载体存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)。

如本领域技术人员所熟知的，“二元载体”系统包括(a)允许将所需核苷酸序列转移到植物细胞基因组中的边界序列；(b)所需的核苷酸序列本身，其通常将包含具有以下的表达盒：(i)植物活性启动子，其可操作地连接至(ii)靶序列和/或适当的增强子。所需的核苷酸序列位于边界序列之间，并且能够在适当条件下插入植物基因组中。二元载体系统通常将需要其他序列(衍生自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens))以实现整合。通常，这可以通过利用使用了土壤杆菌属介导的瞬时转化的所谓“土壤杆菌渗入”来实现。简言之，此技术基于根癌土壤杆菌将其DNA的一部分(“T-DNA”)转移到宿主细胞中的特性，在所述宿主细胞中所述“T-DNA”可整合到核DNA中。T-DNA由长度约为21-23个核苷酸的左右边界序列定义。可以例如通过注射器(在叶中)或真空(整个植物)来实现渗入。在本发明中，通常将边界序列包括在所需核苷酸序列(T-DNA)周围，并且通过土壤杆菌渗入将一种或多种载体引入植物材料中。

一般而言，本领域技术人员能够很好地构建载体并且设计用于重组基因表达的方案。可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调节序列，所述调节序列包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。关于进一步的细节，参见例如，Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版、Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in MolecularBiology,第2版、Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,1992。

具体包括穿梭载体，所述穿梭载体意指能够天然或通过设计在两种不同的宿主生物中复制的DNA媒介物，所述宿主生物可以选自放线菌和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、藓类植物、酵母或真菌细胞)。

包括根据本发明的核酸的载体不需要包括启动子或其他调节序列，特别是如果所述载体用于将所述核酸引入细胞以重组进入基因组中时。

优选地，载体中的核酸在适当的启动子或其他调节元件的控制下并且与其可操作地连接，以用于在宿主细胞中转录，所述宿主细胞如微生物(例如酵母和细菌)、或植物细胞。所述载体可以是在多个宿主中起作用的双功能表达载体。对于基因组DNA，其可以包含其自身的启动子或其他调节元件(任选地与异源增强子如在以下实施例中讨论的35S增强子组合)。使用天然启动子的优点是这样可以避免多效性反应。对于cDNA，这可处于适当的启动子或其他调节元件的控制下，以用于在宿主细胞中表达

“启动子”意指如下核苷酸序列，从其起始可操作地连接到下游(即，在双链DNA的有义链上的3'方向上)的DNA的转录。

“可操作地连接”意指连接为相同核酸分子的一部分，其位置和取向适于从启动子起始转录。与启动子可操作地连接的DNA是在启动子的“转录起始调节下”。

在优选的实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。

应用于启动子的术语“诱导型”是本领域技术人员很好理解的。实质上，在诱导型启动子控制下的表达响应于所应用的刺激被“开启”或增加。所述刺激的性质在启动子之间变化。在没有适当的刺激的情况下，一些诱导型启动子引起很少表达或引起不可检测水平的表达(或不表达)。在没有刺激的情况下，其他诱导型启动子引起可检测的组成型表达。无论在没有刺激的情况下的表达水平如何，在正确刺激的存在下，来自任何诱导型启动子的表达都会增加。

因此，可以将根据本发明的核酸置于外部可诱导基因启动子的控制下，以使表达处于使用者的控制下。为了能够影响基因表达并根据偏好进行QA生物合成，将异源基因引入植物细胞，特别是当所述细胞包含在植物中时的优势，是能够将基因的表达置于选择的启动子的控制下。此外，例如具有比野生-型更高或更低的活性的野生-型基因的突变体和衍生物可用于代替内源基因。

因此，本发明的此方面提供了一种基因构建体，优选地是可复制的载体，其包含与本发明提供的核苷酸序列可操作地连接的启动子(任选地可诱导的)，如QA-生物合成修饰基因，最优选是以下所述的Qs QA核酸之一或其衍生物。

在本上下文中特别感兴趣的是充当植物载体的核酸构建体。Guerineau和Mullineaux(1993)描述了以前在植物上获得广泛成功的特定程序和载体(Planttransformation and expression vectors.Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD编辑)Oxford,BIOS Scientific Publishers,第121-148页)。合适的载体可以包括植物病毒衍生的载体(参见例如，EP-A-194809)。

优选地，用于植物中的本发明的载体包含边界序列，其允许表达盒转移和整合到植物基因组中。优选地，所述构建体是植物二元载体。优选地，所述二元转化载体是基于pPZP(Hajdukiewicz,等人1994)。其他示例构建体包括pBin19(参见Frisch,D.A.,L.W.Harris-Haller,等人(1995).“Complete Sequence of the binary vector Bin 19.”Plant Molecular Biology 27:405-409)。

在植物中起作用的合适的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)。其他例子公开在Lindsey&Jones(1989)“Plant Biotechnology in Agriculture”Pub.OU Press,Milton Keynes,UK的第120页。可以选择启动子以包括赋予表达的发育和/或组织特异性调节控制的一种或多种序列基序或元件。可诱导的植物启动子包括Caddick等人(1998)Nature Biotechnology 16:177-180的乙醇诱导的启动子。

如果需要，可以在构建体中包括选择性遗传标记物，如赋予选择性表型的那些标记物，如对抗生素或除草剂的抗性(例如卡那霉素、潮霉素、草丁膦、氯磺隆、甲氨蝶呤、庆大霉素、壮观霉素、咪唑啉酮和草甘膦)。阳性选择系统，如由Haldrup等人1998Plantmolecular Biology 37,287-296所描述的，可用于制造不依赖抗生素的构建体。

如上所解释的，优选的载体是如WO2009/087391中所述的‘CPMV-HT'载体。以下例子展示了这些pEAQ-HT表达质粒的使用。

用于本发明的这些载体(通常为二元载体)通常将包含表达盒，所述表达盒包含：

(i)启动子，所述启动子可操作地连接至

(ii)增强子序列，所述增强子序列衍生自二分体RNA病毒的RNA-2基因组区段，其中所述RNA-2基因组区段中的靶起始位点已经发生突变；

(iii)如上所述的QA核酸序列；

(iv)终止子序列；以及任选地

(v)3’UTR，所述3’UTR位于所述终止子序列的上游。

如本文所引用的，“增强子”序列(或增强子元件)是衍生自二分体RNA病毒(如，豇豆花叶病毒)的RNA-2基因组区段(或与其享有同源性)的序列，其中靶起始位点已突变。此类序列可以增强与它们所附接的异源ORF的下游表达。不受限制地，认为此类序列当存在于转录的RNA中时，可以增强与它们所附接的异源ORF的翻译。

如本文所引用的，“靶起始位点”是二分体病毒(例如，豇豆花叶病毒)的野生型RNA-2基因组区段中衍生出所讨论增强子序列的起始位点(起始密码子)，所述起始位点作为产生(翻译)由野生型RNA-2基因组区段编码的两个羧基共末端蛋白中较长的一个的起始位点。

通常，RNA病毒将是如前所述的豇豆花叶病毒。

最优选的载体是WO 2009/087391的pEAQ载体，其允许通过使用表达盒的5'前导序列和3'UTR之间的多接头进行的直接克隆形式，所述表达盒包括本发明的翻译增强子，所述表达盒位于还含有基因沉默阻遏物和NPTII盒的T-DNA上。

在这种基因表达系统中存在基因沉默阻遏物是优选的，但不是必需的。基因沉默阻遏物是本领域已知的并且描述于WO/2007/135480中。它们包括来自马铃薯病毒Y的HcPro、来自TEV的He-Pro、来自TBSV的P19、rgsCam、来自FHV的B2蛋白、CPMV的小外壳蛋白和来自TCV的外壳蛋白。当产生稳定的转基因植物时，优选的阻遏物是掺入R43W突变的P19阻遏物。

本发明还提供了一种方法，所述方法包括通过应用合适的刺激例如有效的外源诱导剂，将这种构建体引入植物细胞或微生物(例如细菌、酵母或真菌)细胞和/或在植物细胞内诱导构建体的表达。

作为微生物的替代物，可以在发酵罐中培养产生QA的植物物种(还包括藓类植物小立碗藓)的细胞悬浮培养物(参见例如，Grotewold等人(Engineering SecondaryMetabolites in Maize Cells by Ectopic Expression of Transcription Factors,Plant Cell,10,721-740,1998)。

在本发明的另外的方面，公开了一种宿主细胞(尤其是植物或微生物细胞)，其含有根据本发明的异源构建体。

上述与异源生物中QA生物合成重建有关的宿主细胞的讨论在细节上作必要的修改后应用于此。

因此，本发明的另外的方面提供了一种转化植物细胞的方法，其涉及将如上所述的构建体引入植物细胞，并且引起或允许载体与植物细胞基因组之间的重组以将根据本发明的核酸引入基因组中。

本发明进一步涵盖用根据本发明的核酸或载体(例如包含QA-生物合成修饰核苷酸序列)转化的宿主细胞，尤其是植物或微生物细胞。在转基因植物细胞中(即对所讨论的核酸为转基因的)，所述转基因可以在基因组外载体上或可以优选稳定地掺入基因组中。每个单倍体基因组可能有多于一个的异源核苷酸序列。

酵母已经被广泛用作三萜烯产生宿主[6-8，19-22]，并且因此很可能非常适合QA生物合成。

因此在一个实施方案中，所述宿主是酵母。对于此类宿主，如上所述，可能需要引入另外的基因以改善QA产生的通量。例子可包括一种或多种植物细胞色素P450还原酶(CPR)，其用作所引入P450的氧化还原伴侣[6]；以及HMGR。

包括如上所述转化的植物细胞的植物形成本发明的另外的方面。

如果需要，在转化植物细胞后，可以例如从单细胞、愈伤组织或叶盘中将植物再生(如本领域中的标准)。几乎任何植物都可以从植物的细胞、组织和器官中完全再生。可用的技术综述于在Vasil等人,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol I,II and III,Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press,1984以及Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989。

除了再生的植物，本发明还包含以下中的全部：这种植物、种子、自交或杂交子代和后代(例如F1和F2后代)的克隆。本发明还提供了来自此类植物的植物繁殖体，所述繁殖体是可用于有性或无性生殖或繁殖的任何部分，包括插条、种子等。还提供了这些植物的任何部分，其在所有情况下都包括上述植物细胞或异源QA-生物合成修饰DNA。

本发明还涵盖所公开的任何编码QA-生物合成修饰核酸序列的表达产物，以及因此通过在合适的条件下(其可以在合适的宿主细胞中)从编码核酸的表达来制造表达产物的方法。

如下所述，例如，针对一种或多种其他与QA生物合成相关或以其他方式影响此表型或性状的基因，植物背景(如以上那些)可以是天然的或转基因的。

在修饰宿主表型中，本文所述的QA核酸可以与任何其他基因组合使用，所述其他基因例如为影响QA的速率或产量或其修饰或任何其他表型性状或所需特性的转基因。

通过使用基因的组合，可以定制植物或微生物(例如细菌、酵母或真菌)，以增强所需前体的产生或减少非必需代谢。

作为替代方案，可能需要下调在宿主中的基因，例如，以减少可能影响QA产量的非必需代谢或通量。

可以通过本领域已知的方法(例如使用反义技术)来实现这种下调。

在使用反义基因或部分基因序列以下-调基因表达时，将核苷酸序列以“反向”置于启动子的控制下，从而使得转录产生与从靶基因的“有义”链转录的正常mRNA互补的RNA。参见例如，Rothstein等人,1987；Smith等人,(1988)Nature 334,724-726；Zhang等人,(1992)The Plant Cell 4,1575-1588,English等人,(1996)The Plant Cell 8,179-188。反义技术还在Bourque,(1995),Plant Science 105,125-149和Flavell,(1994)PNAS USA91,3490-3496中综述。

反义的替代方案是使用以靶基因的有义(即相同)取向插入的全部或部分靶基因的拷贝，以通过共阻遏来减少靶基因的表达。参见例如，van der Krol等人,(1990)ThePlant Cell 2,291-299；Napoli等人,(1990)The Plant Cell 2,279-289；Zhang等人,(1992)The Plant Cell 4,1575-1588和US-A-5,231,020。基因沉默或共阻遏技术的进一步改进可以在以下中发现：WO 95/34668(Biosource)；Angell&Baulcombe(1997)The EMBOJournal 16,12:3675-3684；和Voinnet&Baulcombe(1997)Nature 389:第553页。

已经发现双链RNA(dsRNA)在基因沉默方面比单独的有义或反义链更有效(FireA.等人Nature,第391卷,(1998))。介导沉默的dsRNA是基因特异性的，并且通常称为RNA干扰(RNAi)(还参见Fire(1999)Trends Genet.15:358-363、Sharp(2001)Genes Dev.15:485-490、Hammond等人(2001)Nature Rev.Genes 2:1110-1119和Tuschl(2001)Chem.Biochem.2:239-245)。

RNA干扰是两步过程。首先，将dsRNA在细胞内切割，以产生约21-23nt长度的短干扰RNA(siRNA)，具有5'末端磷酸酯和3'短突出端(约2nt)。所述siRNA靶向特异性用于破坏的相应mRNA序列(Zamore P.D.Nature Structural Biology,8,9,746-750,(2001)

本领域已知的下调靶序列的其他方法是使用“microRNA”(miRNA)，例如如Schwab等人2006,Plant Cell 18,1121-1133中所述。此技术采用人工miRNA，其可以由掺入合适的寡核苷酸序列的茎环前体编码，所述合适的寡核苷酸序列可以根据本文的公开内容使用明确定义的规则来产生。

本发明的方法包括一种或多种QA的体外和体内产生或操纵。例如，QA多肽可以经由在微生物(如例如大肠杆菌(E.coli)、酵母和丝状真菌等)中表达而用于发酵中。在一个实施方案中，本发明的一种或多种新表征的Qs QA序列可以与一种或多种其他生物合成基因一起用于这些生物。

体内方法在上面进行了广泛描述，并且通常涉及引起或允许编码QA多肽的重组核酸分子的转录然后从其翻译的步骤。

在本发明的其他方面，QA多肽(酶)可以例如以分离的、纯化的或半纯化的形式在体外使用。任选地，它们可以是重组核酸分子表达的产物。

如上所解释的，QS-21是一种纯化的植物提取物，其增强免疫系统对疫苗抗原的应答能力。

QS-21可用作免疫佐剂，认为其可增强体液和细胞介导的免疫。QS-21已经在临床评价中作为各种试验疫苗(包括针对HIV、疟疾和癌症的那些疫苗)的添加剂。它是FDA批准的Shingrix带状疱疹疫苗的组分。

新表征的来自皂皮树的序列

如上所述，为支持本发明，诸位发明人已经鉴定了来自皂皮树的基因，认为所述基因编码影响QA生物合成的多肽(参见表1中的SEQ.ID:No 1-8)。

在本发明的某些方面，QA核酸衍生自皂皮树(SEQ.ID:No 1-8)。尽管认为本文所述的用于QA产生的关键步骤(三萜烯的合成和氧化)可能发生在内质网的胞质面上，但是此类基因可能是优选的，特别用在制备稳定的转基因植物宿主中，因为这些天然植物基因可以在这些宿主的适当区室中最有效地被加工并且发挥作用。

以上新表征了来自皂皮树的QA生物合成基因。

因此，以其本身形成本发明的多个方面。

在本发明的另外的方面，公开了核酸，所述核酸是QA核酸的变体，所述QA核酸衍生自上文讨论的皂皮树。

此类变体，与本文所讨论的天然QA基因一样，可用于改变植物的QA含量，如通过本文所公开的方法所评估的。例如，变体核酸可以包括编码变体QA多肽的序列，所述变体QA多肽享有天然QA多肽的相关生物学活性，如上所讨论的。例子包括SEQ ID No 2、4、6或8中的任一个的变体。

衍生物

本文描述了产生衍生核酸的方法，所述方法包括修饰以上公开的本发明的任何QA基因，特别是来自皂皮树的QA序列的步骤。

由于多种原因，可能需要进行改变。例如，它们可以引入或除去限制性核酸内切酶位点或改变密码子使用。当Qs基因要在可替代的宿主(例如微生物宿主，如酵母)中表达时，这可能是特别理想的。出于此目的，密码子优化基因的方法是本领域已知的(参见例如，Elena,Claudia,等人“Expression of codon optimized genes in microbial systems:current industrial applications and perspectives.”Frontiers in microbiology 5(2014))。因此，包括密码子修饰以最大化酵母表达的本文所述的序列代表了本发明的特定实施方案。

可替代地，对序列的改变可以通过在核酸中进行一个或多个核苷酸的一个或多个(例如若干个)添加、插入、缺失或取代的方式产生衍生物，从而导致在编码的多肽中一个或多个(例如若干个)氨基酸的添加、插入、缺失或取代。

此类改变可以修饰在翻译后修饰中所需的位点，所述位点如在编码的多肽中的切割位点；在编码的多肽中用于磷酸化的基序等。如果需要将所表达的蛋白质从微生物系统分离，可以将前导序列或其他靶向序列(例如膜或高尔基体定位序列)添加到表达的蛋白质中，以确定其在表达后的位置。

为了改变编码的多肽的活性(例如特异性)或稳定性，其他期望的突变可以是随机或定点诱变。可以通过保守性变化的方式进行改变，即用一个疏水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代另一个疏水性残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，如用精氨酸取代赖氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。如本领域技术人员所熟知的，通过保守性取代来改变多肽的一级结构可能不会显著改变所述肽的活性，因为插入到序列中的氨基酸的侧-链可能能够形成与已被取代的氨基酸侧链类似的键和接触。即使当取代处于在确定肽构象中关键的区域中时也是如此。还包括具有非-保守性取代的变体。如本领域技术人员所熟知的，对在确定肽构象中不关键的肽区域的取代可能不会极大地影响其活性，因为它们不会显著改变肽的三维结构。在对确定肽构象或活性关键的区域中，此类改变可以赋予多肽有利特性。确实，所述改变(如以上所述的那些)可以赋予肽稍微有利的特性，例如改变的稳定性或特异性。

片段

本发明可以使用编码以上公开的本发明的QA基因(特别是来自皂皮树的QA序列)的多肽的片段。

因此，本发明提供了本文公开的本发明的全长QA多肽的片段(特别是其活性部分)的产生和用途。多肽的“活性部分”意指小于所述全长多肽但是保留其必需生物学活性的肽。

多肽的“片段”意指至少约五至七个连续氨基酸，通常至少约七个至九个连续氨基酸、通常至少约九个至13个连续氨基酸、最优选至少约20个至30个或更多个连续氨基酸的氨基酸残基延伸段。多肽的片段可以包括一个或多个表位，所述一个或多个表位可用于产生针对本文公开的任何氨基酸序列的一部分的抗体。优选的表位是抗体能够特异性结合的表位，所述表位可以用于以相对于其他多肽至少约1000倍的亲和力结合本发明的多肽或其片段。

本文公开的特异性片段是CYP716-2012090的较短亚型，其在SEQ ID No6中显示，即缺少序列附件中加下划线的N末端21个氨基酸。

为简洁起见，这些来自皂皮树的QA序列或变体(例如衍生物，如其片段)可以称为“Qs QA序列(或核酸，或多肽)”。这些Qs QA多肽和编码它们的核酸形成了本发明的一方面。

应当理解，通常使用此术语时，它也单独适用于这些序列中的任一个。

因此，在本发明的一方面中公开了编码这些多肽(2、4、6或8)中任一个的分离的核酸。优选地，这可能具有1、3、5或7的序列。本发明的其他核酸包括与所述核酸因简并性等同的那些核酸，或这些核酸的同源性变体(例如衍生物)。

本发明的方面进一步包含分离的核酸，所述分离的核酸包含与下文讨论的任何序列互补的序列。

使用Qs QA序列以催化其对应的生物学活性(如图1所述)形成了本发明的另一方面。为简洁起见，这些序列中的任一个可以称为“Qs QA序列”。

因此，本发明进一步提供了一种在宿主(如植物)中影响或累及QA生物合成的方法，所述方法包括在植物的细胞内引起或允许如上所述的异源Qs QA核酸的转录。所述步骤之前可以是将Qs QA核酸引入植物或其祖先的细胞中的较早步骤。

此类方法通常将构成在宿主(如植物)中产生QA的方法的一部分，可能是其中的一个步骤。优选地，所述方法将采用如上所述的本发明的QA修饰多肽(例如表1中)或其衍生物，或编码其中任一者的核酸。

在另外的实施方案中，提供了针对本发明的Qs QA多肽或肽产生的抗体。

由于本发明的一些方面与上文讨论的生物合成途径的异源重构相关，现在将更详细地讨论这些方面。

根据本发明的“核酸”可以包括cDNA、RNA、基因组DNA和修饰的核酸或核酸类似物(例如肽核酸)。在指定DNA序列的情况下，例如参考附图，除非上下文另有要求，否则涵盖RNA等效物，其中在这种情况下用U取代T。可以将根据本发明的核酸分子提供为：从其天然环境中分离的和/或纯化的形式(基本上纯的或同质的形式或不含或基本上不含原始物种的其他核酸)，以及双链或单链的。在本文中使用时，术语“分离的”涵盖所有这些可能性。所述核酸分子可以是全部或部分合成的。特别地，它们可以是重组的，其中自然界中并未发现在一起(不连续存在)的核酸序列已经被人工连接或以其他方式组合。核酸可以包含以下讨论的序列中的任一个、由其组成或基本上由其组成。

术语“异源”在本文中广泛地用于指示，使用基因工程，即通过人为干预，已将所讨论的核苷酸的基因/序列(例如，编码QA-生物合成修饰多肽)引入所述宿主或其祖先的细胞中。在所述类型、种类或物种的细胞中，与宿主细胞异源的核酸将是非天然存在的。因此，所述异源核酸可以包括置于植物的不同类型或物种或品种的植物细胞的背景中的特定类型的植物细胞或植物物种或品种的编码序列，或由所述特定类型的植物细胞或植物物种或品种衍生的编码序列。另外的可能性是对于置于细胞内的核酸序列(其中所述核酸序列或同源物是天然发现的)，但是其中在植物的类型或物种或品种的一种或多种细胞内所述核酸序列与不天然存在的核酸连接或相邻，如可操作地连接到一种或多种调节序列(如启动子序列)以控制表达。

在本文背景中，“转化的”意指异源核酸的核苷酸序列改变例如关于QA生物合成的一种或多种细胞特征，并且从而改变表型。此类转化可以是瞬时的或稳定的。

“无法进行QA生物合成”意指在转化之前，在该宿主的正常代谢环境下，所述宿主不会或不被认为会天然产生可检测或可恢复水平的QA。

本文提供的核苷酸序列信息可用于设计用于探测或扩增的探针和引物。用于探测或PCR的寡核苷酸的长度可以是约30个或更少(例如18、21或24个)核苷酸。通常，具体的引物长度是多于14个核苷酸。为了最佳的特异性和成本效益，长度为16-24个核苷酸的引物可能是优选的。本领域技术人员精通用在如PCR的方法中的引物的设计。如果需要，可以用本文公开的基因的完整限制性片段进行探测，所述基因的完整限制性片段的长度可以是100个或甚至1000个核苷酸。如果需要，可以将小的变异引入所述序列中以产生“共有”或“简并”引物。

探测可以采用标准的DNA印迹技术。例如，可以将DNA从细胞中提取并且用不同的限制酶消化。然后可以在变性之前，通过在琼脂糖凝胶上电泳来分离限制性片段，并且转移到硝酸纤维素过滤器上。标记的探针可以与过滤器上的单链DNA片段杂交并且确定结合。可以从来自细胞的RNA制剂中制备用于探测的DNA。可以任选地通过所谓的“核酸芯片”的手段进行探测(关于综述，参见Marshall&Hodgson(1998)Nature Biotechnology 16:27-31)。

在一个实施方案中，根据本发明的编码QA-生物合成修饰多肽的变体可以通过包括以下的方法的手段获得：

(a)提供例如来自植物细胞的核酸的制剂。可以将测试核酸作为基因组DNA、cDNA或RNA或它们的任何混合物，优选地作为合适载体中的文库从细胞中提供。如果使用基因组DNA，所述探针可用于鉴定基因的非转录区(例如启动子等)，如下文所述，

(b)提供作为如上文讨论的探针或引物的核酸分子，

(c)在使所述核酸分子与所述制剂中任何所述基因或同源物杂交的条件下，使所述制剂中的核酸与所述核酸分子接触，以及，

(d)通过与所述核酸分子杂交来鉴定所述基因或同源物(如果存在)。可以使用本领域技术人员所掌握的多种技术中的任一种来测量探针与靶核酸(例如DNA)的结合。例如，探针可以是放射性、荧光或酶标记的。其他不采用探针标记的方法包括使用PCR的扩增(参见下文)、RNA酶切割和等位基因特异性寡核苷酸探测。鉴定成功的杂交，然后分离已经杂交的核酸，这可能涉及一个或多个PCR步骤或在合适的宿主中扩增载体。

可以通过在低严格条件下杂交来进行初步实验。为了进行探测，优选的条件是足够严格到存在具有少量杂交被鉴定为阳性(其可被进一步研究)的简单模式的那些条件。

例如，可以使用杂交溶液，根据Sambrook等人的方法(以下)进行杂交，所述杂交溶液包含：5X SSC(其中‘SSC’＝0.15M氯化钠；0.15M柠檬酸钠；pH 7)、5X Denhardt试剂、0.5％-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑鱼精DNA、0.05％焦磷酸钠和至多50％的甲酰胺。在37℃-42℃下进行杂交，持续至少六小时。杂交后，如下洗涤过滤器：(1)在2X SSC和1％SDS中，在室温下5分钟；(2)在2X SSC和0.1％SDS中，在室温下15分钟；(3)在1X SSC和1％SDS中，在37℃下30分钟-1小时；(4)在1X SSC和1％SDS中，在42℃-65℃下2小时，每30分钟更换溶液。

一种用于计算严格条件(所述严格条件为获得特定序列同源物的核酸分子之间的杂交所需)的通用公式是(Sambrook等人,1989)：双链体中的T_m＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp。

为了说明上式，使用[Na+]＝[0.368]和50％甲酰胺，GC含量为42％，平均探针大小为200个碱基，T_m为57℃。同源性每降低1％，DNA双链体的T_m降低1℃-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度将观察到具有大于约75％序列同一性的靶标。将认为这种序列与本发明的核酸序列基本上同源。

如本领域中所熟知的，逐渐增加杂交的严格性直到仅剩几个阳性克隆。例如用于检测约80％-90％相同的序列的其他合适的条件包括，在0.25M Na₂HPO₄，pH 7.2，6.5％SDS，10％硫酸葡聚糖中，在42℃下杂交过夜，以及在0.1X SSC，0.1％SDS中，在55℃下最终洗涤。为了检测大于约90％相同的序列，合适的条件包括在0.25M Na₂HPO₄，pH 7.2，6.5％SDS，10％硫酸葡聚糖中，在65℃下杂交过夜，以及在0.1X SSC，0.1％SDS中，在60℃下最终洗涤。

在另外的实施方案中，例如，使用核酸扩增反应，特别是聚合酶链反应(PCR)，可以间接地确定或鉴定核酸分子与变体的杂交。PCR需要使用两种引物来特异性地扩增靶核酸，因此优选地采用具有本发明的QA基因的序列特征的两个核酸分子。使用RACE PCR，可能仅需要一个此类引物(参见“PCRprotocols；A Guide to Methods and Applications”,编辑Innis等人,Academic Press,New York,(1990))。

因此，根据本发明在获得核酸中涉及使用PCR的方法可以包括：

(a)提供植物核酸的制剂，例如来自种子或其他适当的组织或器官，

(b)提供可用于(即适用于)PCR的一对核酸分子引物，至少一个所述引物是如上所讨论的根据本发明的引物，

(c)在进行PCR的条件下使在所述制剂中的核酸与所述引物接触，

(d)进行PCR并且确定扩增的PCR产物的存在或不存在。扩增的PCR产物的存在可以指示变体的鉴定。

在上述所有情况下，如果需要，可以扩展在搜索中鉴定的克隆或片段。例如，如果怀疑它们不完整，则例如基于已经获得的部分，使用序列、探针或引物以鉴定含有重叠序列的其他克隆，可以重访原始DNA来源(例如克隆文库，mRNA制剂等)以分离缺失的部分。

根据本发明的纯化的蛋白质或其片段、突变体、衍生物或变体(例如通过从编码核酸表达以重组方式产生的)可用于采用本领域标准技术产生抗体。抗体和包含抗体的抗原结合片段的多肽可以用于鉴定来自如下文进一步讨论的其他物种的同源物。

产生抗体的方法包括用蛋白质或其片段免疫哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴)。可以使用本领域已知的多种技术中的任一种从免疫的动物中获得抗体，并且可优选地使用抗体与目的抗原的结合进行筛选。例如，可以使用蛋白质印迹技术或免疫沉淀(Armitage等人,1992,Nature 357:80-82)。抗体可以是多克隆的或单克隆的。

作为对哺乳动物进行免疫的可替代方案或补充方案，例如使用在其表面展示功能性免疫球蛋白结合结构域的λ噬菌体或丝状噬菌体，可以从重组产生的所表达的免疫球蛋白可变结构域的文库中获得具有适当的结合特异性的抗体；例如，参见WO92/01047。

针对多肽或肽产生的抗体可用于鉴定和/或分离同源多肽、以及然后是编码基因。

可以以多种方式修饰抗体。实际上，术语“抗体”应解释为覆盖具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合物质。因此，此术语覆盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成的。

***

本文引用了许多专利和出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现状。这些参考文献中的每一个以引用的方式整体并入本文的公开内容中，其程度如同每个单独的参考文献被具体和单独地指出以引用的方式并入。

贯穿本说明书，包括其后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括(comprise)”以及变型如“包含/包括(comprises)”或“包含/包括(comprising)”应当被理解为意指包含一个提及的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者多个整体或步骤的组。

必须指出，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如，提到“一种药物载体”包括两种或更多种这此类载体的混合物等。

范围在本文中通常表达为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。

本文中的任何子标题仅为了方便而包括，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容。

现在将参考以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。根据这些，本领域技术人员将想到本发明的其他实施方案。

本文引用的所有参考文献的公开内容，因为本领域技术人员可以使用它们来实施本发明，因此通过交叉引用特此具体地并入本文。

附图说明

图1：QS-21。

图2：经由β-香树脂醇，从常见的通用前体中产生皂皮酸。从β-香树脂醇的途径需要在三个位置(C-16α、C-23和C-28)进行氧化。这些氧化步骤仅以简化的线性方式示出，尽管如上所述，但它们原则上可以按其他顺序进行(参见图11)。

图3：皂皮树的叶(L)和根(R)组织中的候选基因的PCR扩增。在两种组织中可能得到大多数候选物的产物。

图4：在本氏烟草中，皂皮树β-香树脂醇合酶(QsbAS)的表达。叶提取物的GC-MS分析揭示了仅在表达克隆的β-香树脂醇合酶的叶中产生了β-香树脂醇，而在对照(GFP)叶中没有产生。

图5：β-香树脂醇通过来自皂皮树的P450的转化。发现在CYP716家族中的两种P450氧化β-香树脂醇。左侧：本氏烟草叶提取物的GC-MS分析显示，CYP716-2073932将大多数β-香树脂醇转化为在12.08min处鉴定为齐墩果酸的新产物。此产物与真正的齐墩果酸标准品的质谱示于右侧。CYP716-2012090(长和短亚型二者)转化了小量的β-香树脂醇，推定被鉴定为16α-羟基-β-香树脂醇(用*标记)。在图5s中给出此产物的质谱。

图5S：推定的16α-羟基-β-香树脂醇的EI质谱。在QsbAS和CYP716-2012090的共表达后，形成了痕量的此产物。

图6A：通过CYP716-2012090，齐墩果酸向刺囊酸的转化。左侧：本氏烟草叶提取物的GC-MS分析显示，来自皂皮树的两个CYP716成员与QsbAS和CYP716-2073932的共表达导致在12.42min处鉴定为刺囊酸的产物的积累。此化合物与真实的刺囊酸标准品的质谱示于右侧。

图6B：通过OQHZ-2018687，齐墩果酸向常春藤皂甙元的转化。筛选齐墩果酸氧化活性的C-23氧化酶候选物。揭示了在表达候选物#6和#7(携带相同的酶，本文也称为CYP714-7)的样品中观察到新产物。此新产物与23-羟基-齐墩果酸(常春藤皂甙元)标准品具有相同的保留时间和质谱，并且表明所述酶是C-23氧化酶。

图7：表达来自皂皮树的QsbAS和C-28(CYP716-2073932)、C-16α(CYP716-2012090)和C-23(CYP714-7)氧化酶的组合的本氏烟草叶提取物的LC-MS分析。在表达所有三种P450的样品中，仅观察到皂皮酸(19.886min)。以下示出了在19.886min处的多种样品连同皂皮酸标准品的质谱。

图8：在表达不同C-23氧化酶的植物样品之间皂皮酸产物的比较。所有样品衍生自表达tHMGR、QsbAS和皂皮树C-28(CYP716-2073932)和C-16α(CYP716-2012090)氧化酶的叶。所述C-23氧化酶衍生自皂皮树(CYP714-7，顶部)、蒺藜苜蓿(M.truncatula)(CYP72A68，下方第2个)或糙伏毛燕麦(A.strigosa)(CYP94D65，下方第3个)。

顶部显示了CAD色谱图。下方显示了目的质谱(负模式)。

皂皮酸标准品和tHMGR/QsbAS/CYP716-2073932/CYP716-2012090/CYP94D65样品的新峰共同具有m/z 485(以红色显示)的共同离子。此离子符合预期的皂皮酸分子质量(减H⁺)。*发现第二种化合物的m/z 487丰度很高，推定被鉴定为儿茶酚(cauphyllogenin)(如在皂皮酸中所见，具有C-23醇而不是醛的特征)。图8s中示出了这些产物的质谱。

在皂皮树C-23表达样品中发现了较少的可替代的C-23氧化的副产物，包括C-23醇(儿茶酚(cauphylogenin))和酸(16α-羟基-丝石竹酸(16OH-GA))，这表明醛的产生具有更大的特异性。

图9：皂皮树基因在酵母中的表达。顶部给出了不同菌株的GC-MS迹线，下方给出了目的峰的质谱。

图10：A)三萜烯生物合成所需的甲羟戊酸(MVA)途径和潜在限速酶的简化概图。B)通过tHMGR或SQS与燕麦β-香树脂醇合酶(AsbAS)的共表达可以改善本氏烟草中的β-香树脂醇含量。C)相对于仅tHMGR，SQS与tHMGR的共表达进一步改善了β-香树脂醇。

图11：β-香树脂醇的氧化衍生物。

图12：从2,3-氧化鲨烯和来自皂皮树的相关酶进行皂皮酸的生物合成。氧化步骤可能不完全以此顺序进行。

图13：表达制造皂皮酸所需的来自皂皮树的四种表征的酶的代表性叶的LC-CAD分析(上图)。作为对照，排除C-16α氧化酶(下图)并且代替地积累前体丝石竹皂甙元(参见图12)。

图14：皂皮酸标准品与从本氏烟草分离的产物的LC分析。A)示出了分离产物(中图)和皂皮酸标准品(下图)的分析的LC-CAD迹线。两种样品均示出了在19.5分钟处的主峰。在顶部迹线中示出了仅甲醇空白运行。B)在正(上图)和负(下图)模式中19.5分钟处的产物的MS(ESI/APC)分析。分离的产物示于左侧，皂皮酸标准品示于右侧。

图15：皂皮酸标准品与从本氏烟草分离的产物的GC-MS分析。A)下图迹线中示出了标准品，上图痕迹中示出了分离的产物。两种样品均示出了在15.3分钟处的主峰。B)在15.3min处两种产物的EI质谱的比较。以上示出了分离的产物，以下示出了皂皮酸标准品。

图16：皂皮酸标准品(底部)与从本氏烟草分离的产物(顶部)的¹H NMR(甲醇d₄)比较。

实施例实施例1-在皂皮树转录组中挖掘候选皂皮酸生物合成基因。

最近，通过1KP项目提供了来自皂皮树的转录组数据集[1]。此数据集衍生自皂皮树叶组织的HiSeq测序(Illumina)。

尽管QS-21的商业来源通常衍生自树皮，叶组织也已经显示是QS-21和其他皂苷的实质来源[2]，因此我们有理由认为相关的生物合成基因可能存在于此数据库中。挖掘潜在的生物合成基因的转录组数据集。

β-香树脂醇合酶

搜索的第一候选物是β-香树脂醇合酶(bAS)OSC。表征了许多bAS酶，包括来自相关豆目物种的这些酶。

将来自光果甘草(Glycyrrhiza glabra)(Genbank ID Q9MB42.1)的bAS酶用作鉴定OSC序列的查询。这返回了预测为三萜烯合酶(下文称为QsbAS)的单一全长序列(OQHZ-2074321)。

还在此数据集中鉴定了其他部分OSC序列，然而预测这些为甾醇(环阿屯醇)合酶并且忽视。

序列附录A中给出作为SEQ ID NO:1和2的QsbAS的全核苷酸和预测的蛋白质序列。

β-香树脂醇氧化酶

我们推测负责β-香树脂醇的氧化的可能的一类酶是细胞色素P450(P450)。这些酶由非常大的基因超家族编码，通常在单个植物基因组中有多于200个代表基因。

尽管基于序列同源性通常难以预测功能，但是近年来，CYP716家族已经作为三萜烯氧化酶的卓越家族出现[3]。先前已经将11种CYP716表征为β-香树脂醇C-28氧化酶(序列附录B)。这些P450是从分类学上不同的物种(包括豆目物种)分离出来的，这表明皂皮树中的C-28β-香树脂醇氧化酶可能被此家族的成员催化。

此外，CYP716酶也已经显示出能够催化在β-香树脂醇骨架周围的其他(非-C-28)位置处的氧化，所述酶包括来自柴胡(Bupleurum falcatum)的C-16α氧化酶(CYP716Y1)(序列附录B)。使用蒺藜苜蓿C-28氧化酶CYP716A12作为搜索查询，在转录组数据集中鉴定了两种全长CYP716。这些是OQHZ-2073932和OQHZ-2012090(在本文中可称为CYP716-2073932和CYP716-2012090)。

(注意，CYP716-2073932已经由P450命名委员会正式指定为CYP716A224[3])。序列附录A中给出作为SEQ ID NO:3和4的CYP716的全核苷酸和预测的蛋白质序列。

实施例2-从皂皮树克隆候选基因

皂皮树来自英国的苗圃(Burncoose Nurseries，康沃尔)。使用Qiagen RNeasy植物RNA提取试剂盒，从单一树的叶和根提取RNA，其修饰方案如[26]所述。根据制造商的说明，将此RNA进一步用作使用Superscript III(Invitrogen)进行cDNA合成的模板。

为了扩增靶基因，针对上述四种基因(SEQ ID NO:1、3、5和7)的每一个设计引物。对于CYP716-2012090，设计了两组引物，以允许克隆蛋白质的长和短亚型二者，这二者在N末端处有21个氨基酸的差别。这是由于此区与其他表征的CYP716的比对差。

每种引物均在5'端掺入了attB衔接子，以允许定向的基于的克隆。这些衔接子在5'端以斜体显示，在5'->3'方向上后随基因特异性序列。

使用叶或根cDNA作为模板，对每种基因进行两次PCR反应。如上所述，使用不同的正向引物，为CYP716-2012090分开的反应设置了两组PCR。按照制造商的说明，使用带HF缓冲液的iProof(BioRad)，以50μL的总体积进行PCR。为了扩增QsbAS和CYP716酶，PCR热循环涉及在98℃下(30秒)的初始变性步骤，然后进行变性(98℃，10秒)、退火(50℃，10秒)循环和延伸(72℃，3分钟)的30个循环，最后在72℃下延伸(5分钟)。这些参数对于CYP714的扩增是相同的，除了在30个循环期间的延伸时间减少到2分钟。

使用来自根和叶组织的cDNA作为PCR模板，观察到了所有基因的成功扩增(图3)。如前所述，将衍生自叶cDNA的PCR产物进行进一步纯化，并且重组到pDONR207 Entry载体中[5]。通过Eurofins Genomics对所得质粒进行测序，以验证插入基因的存在和序列。在转化为如前所述的感受态根癌土壤杆菌之前[5]，选择用于每个基因的单一代表性质粒，并且重组到二元载体pEAQ-HT-DEST1中[4]。如前所述，为了在本氏烟草中瞬时表达，使根癌土壤杆菌菌株生长并且制备好以进行渗入[5，27]。

实施例3-在本氏烟草中皂皮树基因的瞬时表达

QsbAS是单功能的β-香树脂醇合酶

在本氏烟草中进行多种克隆基因的瞬时表达。所有组合包括携带糙伏毛燕麦HMG-CoA还原酶(tHMGR)的反馈不敏感截短形式的菌株的共渗入。已经证明此酶在本氏烟草中瞬时表达后，可增加三萜烯含量[5]。所用序列示为SEQ ID No 29-32。

如前所述，将叶收获、提取并且通过GC-MS分析[5]。对表达QsbAS的叶的GC-MS分析揭示了存在通过比较β-香树脂醇标准品的保留时间和质谱鉴定为β-香树脂醇的化合物(图4)。色谱图中未发现其他新产物，这表明QsbAS是单功能β-香树脂醇合酶。

C-28和C-16α氧化酶的发现。

接下来，将QsbAS与各种P450的组合进行测试。这揭示两种CYP716酶均显示出对β-香树脂醇的活性。发现CYP716-2073932是C-28氧化酶，并且将大部分β-香树脂醇转化为齐墩果酸。CYP716-2012090将少量的β-香树脂醇转化为推定被鉴定为16α-羟基-β-香树脂醇的产物(基于与先前公开的质谱的比较[6，7](图5；图5s)。

当将这两种CYP716酶合并，用与刺囊酸相同的保留时间和质谱鉴定第三产物，所述刺囊酸是由β-香树脂醇加C-28羧酸和C-16α醇组成的到皂皮酸的中间体(图6A)。

实施例4-来自皂皮树的C-23氧化酶的发现

在发现了C-28和C-16α氧化酶之后，将注意力集中在杰出的皂皮树C-23氧化酶上。通过对已知的氧化三萜烯的P450进行基于同源性的搜索，有助于C-28和C-16α氧化酶的鉴定。基于与已知三萜烯氧化酶的同源性，考虑了其他候选物，包括两个CYP72家族成员(OQHZ-2012357和OQHZ-2019977)，对此在相关的豆科物种蒺藜苜蓿中已经鉴定了C-23氧化酶。然而，在原位进行克隆和测试后，这些候选物均未显示出对β-香树脂醇或其C-28/C-16α氧化衍生物的明显活性(数据未显示)。

因此，可以推断出杰出的皂皮树C-23氧化酶可能处于先前未涉及三萜烯氧化的P450家族中。

因此，搜索了所有推定的细胞色素P450的1KP转录组数据。

在数据集中发现了大约150个P450编码重叠群。其中，35个显现编码全长酶(约1500bp，参见表5)。

表5：皂皮树1KP数据集中代表的所有35种全长细胞色素P450的列表。基于GenbankBLAST搜索分配推定的家族/亲族。不会进一步考虑预期涉及初级代谢的候选物。这导致25种最终的候选物(“快速参考”列)。注意，此处使用的候选物的名称衍生自独立组装的转录组的重叠群号。因此，此数字导致与先前用于CYP716/CYP72酶的命名系统不同的命名系统。

这些全长重叠群包括上述的C-28和C-16α氧化酶。因此有理由认为，杰出的C-23氧化酶也可能在这些序列中表示。

将35种P450候选物基于它们与来自其他物种的命名的P450的同源性，进一步分配为推定的亲族和家族(表5)。预期许多候选物将涉及初级代谢(并且与来自不相关物种(如拟南芥属)的酶享有高度的序列保守性)，并且随后将所述候选物从列表中消除。

这给出了25个候选物的最终列表，并且为所述候选物订购了克隆引物。为了便于引用，这些在表5中编号为1-25，并且本文使用这些编号进行了描述。

接下来尝试了25种候选物的PCR扩增。与先前的候选物一样，使用分别衍生自叶(L)和根(R)的cDNA模板，为每种候选物进行两次PCR。25种候选物中有20种成功产生了强PCR产物(数据未显示)。随后将这些产物纯化(从叶cDNA模板样品中纯化)并且克隆到Entry载体pDONR207中。

对候选物进行测序以验证已经克隆了正确的基因。在大多数情况下，克隆的序列与预期序列紧密匹配。在克隆之间发现了一些冗余；发现#6和#7的序列相同，#16和#17也相同。检查在原始转录组数据中的预测序列后，意识到这些对的重叠群高度相似，并且尚未设计引物来区分它们。无论如何，在转化根癌土壤杆菌之前，将所述克隆分开处理并且克隆到pEAQ-HT-DEST1二元载体中。

接下来在本氏烟草中瞬时表达了15种候选物。首先通过与皂皮树β-香树脂醇合酶(QsbAS)共表达，评估候选物氧化β-香树脂醇的潜力。通过GC-MS分析，在这些样品中未检测到新产物。因此，通过与QsbAS和C-28氧化酶(CYP716-2073932)共表达，进一步评估了候选物氧化齐墩果酸的能力。这次，可以在表达候选物#6和#7(如上所述，6和7编码相同的酶)的叶提取物中检测到不同的新产物。所述新产物具有与23-羟基-齐墩果酸(又名常春藤皂甙元)相同的保留时间和质谱。预期由候选物#7编码的酶是CYP714家族成员(尚未正式命名)。认为在本文要求的优先权日之前，此家族的成员均未报道为是三萜烯氧化酶。从优先权日起，还报道了其他例子(参见例如Kim等人(2018).“A Novel Multifunctional C-23Oxidase,CYP714E19,Is Involved in Asiaticoside Biosynthesis”.Plant CellPhysiol.)1200-1213。

附录A中包括作为SEQ ID No 7和8的序列。

由于C-23候选物衍生自我们自己的数据汇编，因此通过BLASTn(https://db.cngb.org/blast4onekp/)搜索了1KP数据集中的相应序列。令人惊讶的是，在此数据库中，#7没有用全长序列表示，但是返回了一些较小的重叠群(表6)。这些中最高的命中是OHQZ-2018687，其为821bp的重叠群。

表6：来自1KP数据集的重叠群的列表，是从C-23氧化酶的BLASTn查询返回的。得分最高的命中是OQHZ-2018687。

实施例5-在本氏烟草中允许皂皮酸合成的采用皂皮树酶的组合生物合成

上述的皂皮树的β-香树脂醇合酶和C-28、C-16α和C-23氧化酶当一起表达时，应足以产生皂皮酸(参见图2)。

在测试来自皂皮树的C-23氧化酶之前，将来自皂皮树的其他候选基因与由其他物种(即蒺藜本氏烟蓿(桶苜蓿(barrel medic)的CYP72A68v2)和糙伏毛燕麦(黑燕麦)的CYP94D65)表征的C-23β-香树脂醇氧化酶(SEQ ID No 13-16)组合。

在此第一个实验中，在本氏烟草中，使用瞬时表达将来自皂皮树的QsbAS和两种CYP716酶与蒺藜苜蓿和糙伏毛燕麦C-23氧化酶组合，以确定是否能在这些样品中观察到皂皮酸。LC-MS-CAD分析揭示了两组组合

·tHMGR/QsbAS/CYP716-2073932/CYP716-2012090/CYP72A68v2

·tHMGR/QsbAS/CYP716-2073932/CYP716-2012090/CYP94D65

导致新产物的出现，所述新产物与皂皮酸标准品的保留时间和质谱匹配(结果未显示)。

在表达CYP72A68v2的样品中，皂皮酸的丰度显现最高。

还在这些样品中观察到其他相关产物：在表达燕麦C-23氧化酶(CYP94D65)的组合中，将最丰富的新峰鉴定为儿茶酚(cauphyllogenin)(在皂皮酸中看到C-23醇，而不是醛)，而苜蓿C-23氧化酶(CYP72A68v2)引起16α-羟基丝石竹皂甙元(在皂皮酸中看到C-23羧酸而不是醛)的大量积累。

为了验证在仅使用皂皮树酶的情况下，可以在本氏烟草中产生皂皮酸，将QsbAS酶与P450的各种组合一起瞬时表达。如预期的那样，对共表达QsbAS与所有P450的叶的分析导致出现与皂皮酸标准品的保留时间和质谱相匹配的峰。在表达小于完整途径的任何者的叶片样品中此峰不存在(图7)。

此外，在表达酶的完整皂皮树组分的本样品与其等效(储存的)样品之间进行了比较，其中使用了来自蒺藜苜蓿和燕麦的C-23氧化酶。这揭示了在表达皂皮树C-23氧化酶的样品中，皂皮酸的量显现最高(图8)。表达皂皮树C-23氧化酶的样品显现还含有显著更少的不希望的推定副产物儿茶酚(cauphyllogenin)和16α-羟基丝石竹酸(图8)。这些代谢物反映了燕麦酶和苜蓿酶的不同的C-23氧化酶特异性，它们分别主要产生C-23醇和酸。因此，皂皮树C-23氧化酶显现对C-23醛具有更高的特异性，这反映了其在QS-21生物合成中的预期功能。

实施例6-在酵母中表达皂皮树基因

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可被用作商业QA生产的宿主底盘(chassis)。

因此，我们证明了克隆的皂皮树基因在此宿主中具有活性。使用衍生自S288C的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(基因型：MATa/MATα；ura3Δ0/ura3Δ0；leu2Δ0/leu2Δ0；his3Δ1/his3Δ1；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；YHR072w/YHR072w::kanM)，所述菌株含有营养缺陷型选择标记物(-URA/-HIS/-LEU)，以允许基因从多达三种质粒中表达。

采用了三种关口相容的酵母表达载体，包括pYES-DEST52(尿嘧啶选择)、pAG423(组氨酸选择)和pAG435(亮氨酸选择)。

将皂皮树酶重组到这些如表7所述的载体中。简言之，将β-香树脂醇合酶(QsbAS)重组到pYES-DEST52载体中，同时将C-28氧化酶(CYP716-2073932)和C-16α氧化酶(长(L)和短(S)亚型)重组到pAG423中。

为了提高细胞色素P450发挥功能的效率，将第三种质粒(pAG435)用于表达拟南芥细胞色素P450还原酶2(AtATR2)酶。将其用作辅酶，以用于在底物氧化后将植物P450还原回活性状态。所有载体均含有半乳糖诱导型启动子，以用于表达插入的基因。

表7：产生的酵母菌株列表。

将酵母菌株在具有半乳糖的合成的酵母培养基中进行培养，并且在30℃下培养2天。将菌株通过离心沉淀、皂化，并且用乙酸乙酯提取代谢物。GC-MS分析揭示了，所有菌株在10.6分钟处聚集成峰，所述峰鉴定为β-香树脂醇(图9)。发现菌株63(表达C-28氧化酶)聚集为小量的另外的产物，所述产物被鉴定为C-28氧化的β-香树脂醇衍生物，包括齐墩果酸(12.01min)和中间体C-28醇高根二醇(11.51min)(图9，下方第2个迹线)。在菌株64或65(表达C-16α氧化酶亚型)中未鉴定出产物，所述产物很容易被鉴定为16-羟基-β-香树脂醇，表明这可能不是此酶的最佳底物。

以上数据证明，可以对酵母进行工程化以产生皂皮酸前体。

实施例7-通过稳定转化产生QA

以前使用工程化的转基因植物品系(例如拟南芥、小麦)生产三萜烯。已经报道了允许构建多基因载体并且允许将整个途径整合到单一基因座中的一系列金门(GoldenGate)[23]载体。根据本文的公开内容，可以将这些类似地应用到本发明。

实施例8-实施例1至7的结论

皂皮酸是三萜类，并且是由皂皮树产生皂苷QS-21的关键前体。

在这里，鉴定了来自皂皮树的四种酶(β-香树脂醇合酶和C-16α、C-23和C-28氧化酶)，所述酶能够在本氏烟草中瞬时表达时生产皂皮酸。预测这些酶涉及产生皂皮酸骨架所需要的QS-21生物合成途径的早期步骤(图1)。

本文所述的产物的身份通过使用真实的标准品进行验证，给出了在这些结果中的高置信度。

图12中示意性示出了在皂皮酸的生物合成中，β-香树脂醇合酶(QsbAS)和三种在C-28、C-23和C-16α位置处氧化β-香树脂醇的细胞色素P450单加氧酶的活性(本文分别称为CYP716-2073932、CYP714-7和CYP716-2012090)。

实施例9--估计在本氏烟草中皂皮酸的产生

为了估计在瞬时表达后，在本氏烟草中皂皮酸的产生，通过LC-CAD进行分析。如前所述，使用皂皮树β-香树脂醇合酶和C-16α、C-23和C-28氧化酶进行土壤杆菌渗入。作为对照，使用仅两种氧化酶(C-23和C-28)渗入的叶子并累积丝石竹皂甙元而非皂皮酸(图12)。

还在所有的渗入中包括了燕麦HMG-CoA还原酶(tHMGR)，因为它增加β-香树脂醇的产生。图13示出了来自这些样品的代表性色谱图。将来自不同植物的三片叶子用于每种测试条件，作为生物学重复。

为了估计这些叶子中皂皮酸的产生，将皂皮酸的峰面积与内标(包括在1.1mg/g干叶重量)的峰面积进行比较。发现三个重复的平均值为1.44mg/g。

实施例10-从本氏烟草纯化皂皮酸

为了明白地确定在本氏烟草中获得皂皮酸的产生，进行产物的纯化。

将总共209株本氏烟草植物用携带pEAQ-HT-DEST1构建体的根癌土壤杆菌真空渗入，所述构建体包含皂皮树β-香树脂醇合酶、C-16α、C-23和C-28氧化酶。还包括燕麦tHMGR以提高产量。渗入后四天收获叶子，冻干后产生150.3g干材料。将代谢物使用Büchi SpeedExtractor E-914用乙醇提取，并且使用几轮的硅胶快速色谱以分离总共30mg的产物。通过LC-MS(图14)和GC-MS(图15)发现分离的产物与真正的皂皮酸标准品(Extrasynthese)具有相同的保留时间和质谱。此外，分离产物的¹H NMR光谱分析也与皂皮酸标准品一致(图16)。

这证实了，可以通过瞬时表达皂皮树酶，通过在本氏烟草中瞬时表达来产生皂皮酸。产物的分离产率在0.2mg/g干重的区域内，尽管在样品中检测到一些很少的杂质。此产率低于实施例9中LC-CAD的估计产率，这表明在此分离过程中产物损失。然而，这证明使用当前表征的酶可以从本氏烟草产生和分离实践量的皂皮酸。

方法

渗入

如前(Reed等人,2017)所述，使用无针注射器进行土壤杆菌渗入。在根癌土壤杆菌LBA4404中从pEAQ-HT-DEST1二元表达载体(Sainsbury等人,2009)表达所有基因。所有植物共表达燕麦tHMGR、皂皮树β-香树脂醇合酶(QsbAS)和β-香树脂醇C-28(CYP716-2073932)和C-16α(CYP716-2012090S)氧化酶。对于皂皮酸生产，还共表达C-23(CYP714-7)氧化酶，而使用绿色荧光蛋白(GFP)用作对照。如(Reed等人,2017)中所述进行细菌和植物的培养。每个测试条件渗入三株植物，并且作为生物学重复分别进行分析。

LC-MS分析

土壤杆菌渗入后5天收获叶子并且冻干。将冻干的叶材料(10mg/样品)在1000rpm下研磨1min(Geno/Grinder 2010，Spex SamplePrep)。在40℃下，用20μg/mL的洋地黄毒苷(内标；Sigma)在550μL 80％甲醇中进行提取20min，同时在1400rpm下振动(ThermomixerComfort，Eppendorf)。将样品用400μL己烷分配两次。将水相在40℃下在真空下干燥(EZ-2Series Evaporator，Genevac)。将干燥的材料重悬于75μL的100％甲醇中，并且在12,500g下过滤30秒(0.2μm，Spin-X，Costar)。将过滤的样品转移到玻璃小瓶中，并且如下详述进行分析。

本氏烟草叶提取物的制备

使用具有单四极质谱仪LCMS-2020(Shimadzu)和Corona Veo RS带电气溶胶检测器(CAD)(Dionex)的Prominence HPLC系统进行分析。检测：MS(双重ESI/APCI电离，DL温度250℃，雾化(neb)气流15L.min-1，热块温度400℃，喷雾电压Pos 4.5kV，Neg-3.5kV)CAD：数据收集率10Hz，过滤器常数3.6s，925蒸发器温度35℃，离子阱电压20.5V。方法：溶剂A：[H₂O+0.1％甲酸]溶剂B：[乙腈(CH₃CN)+0.1％甲酸。进样体积：10μL。梯度：从0到1.5min 15％[B]，从1.5到26min 15％至60％[B]，从26到26.5min60％至100％[B]，从26.5至28.5min100％[B]，从28.5至29min 100％至15％[B]，从29至30min 35％[B]。使用0.3mL.min-1的流速和Kinetex柱2.6μm XB-C18 50x 2.1mm(Phenomenex)进行所述方法。

本氏烟草叶提取物的分析

使用LabSolutions软件(Shimadzu)进行分析。为了提供产物产率的估计，将皂皮酸(如通过CAD确定的)的峰面积除以内标(洋地黄毒苷，1.1μg/mg干叶组织)的峰面积。将三个重复的结果取平均值。在对照中观察到，内源性本氏烟草产物的小峰与皂皮酸具有相同的保留时间(计算的平均值0.25μg/mg)。因此，从估计的皂皮酸产率中减去它的值。

大规模渗入

如上详述，使用tHMGR、QsbAS、CYP716-2073932、CYP716-2012090S和CYP714-7氧化酶，进行土壤杆菌渗入。如前所述(Reed等人,2017)，通过真空渗入总共209株植物，并且在四天后收获。

从本氏烟草纯化皂皮酸

如(Reed等人,2017)中详述将来自大规模渗入的叶子进行收获、冻干，并使用SpeedExtractor E-914(Büchi)进行提取，但具有涉及四个循环的程序(100℃和130巴压力)。循环一(己烷)具有0保持时间，以及循环二至四(乙醇)具有5min的保持时间。用2min的溶剂冲洗和6min的N₂冲洗完成运行。弃去提取物中的己烷部分，并且将乙醇部分用于后续的快速色谱，所述色谱使用Isolera One(Biotage)进行，以下给出了各个色谱柱的详细信息。如(Reed等人,2017)中祥述，每个柱之后通过GC-MS和薄层色谱(TLC)检查皂皮酸级分。在每个阶段，将最纯的级分合并并且在硅胶60(材料收获)上干燥，以加载到后续的色谱柱上。柱1：SNAP Ultra 50g(Biotage)，流速：100mL/min，具有以下梯度的90mL级分：溶剂A：[己烷]溶剂B：[乙酸乙酯]；梯度：5％[B]至100％[B]经10个柱体积，并且保持在100％[B]下持续另外的5个柱体积。柱2：SNAP Ultra 50g柱(Biotage)，流速100mL/min，具有以下梯度的90mL级分：溶剂A：[二氯甲烷]溶剂B：[乙酸乙酯]；10％[B]至60％[B]经10个柱体积，并且保持在100％[B]下持续另外的2个柱体积。柱3：SNAP Ultra 10g(Biotage)，流速：36mL/min，与柱2具有相同梯度的17mL级分。在柱3之后，将级分用活性炭处理以除去有色杂质并且加载到柱4中。柱4：SNAP Ultra10g柱(Biotage)(36mL/min，17mL级分)，在二氯甲烷中15％乙酸乙酯的无梯度流动相经20个柱体积。将合并的级分用小量的HCl(在约40mL乙醇中400μL的浓HCl)处理，所述小量的HCl有助于减少在TLC板上的拖尾。柱5：SNAP Ultra 10g柱(Biotage)(36mL/min，17mL级分)，在二氯甲烷中15％乙酸乙酯的无梯度流动相经30个柱体积，100％乙酸乙酯经5个柱体积进行最终冲洗。合并最纯的级分，并且干燥以产生30mg带有小量黄色杂质的白色粉末。如下通过GC-MS、LC-MS和NMR进行分析。

纯化的皂皮酸的GC-MS、LC-MS和NMR分析。

如(Reed等人,2017)所述进行GC-MS分析。如上所述进行LC-MS分析以进行皂皮酸定量。对于在氘代甲醇中的¹H NMR，在400MHz的标称频率处以傅里叶变换模式记录NMR光谱记录。对于分析的每种方法，将皂皮酸标准品(Extrasynthese)用于比较。

材料和方法的参考文献

Reed J,Stephenson MJ,Miettinen K,Brouwer B,Leveau A,Brett P,Goss RJM,Goossens A,O'Connell MA,Osbourn A.2017.A translational synthetic biologyplatform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-likemolecules.Metab Eng 42:185-193。

Sainsbury F,Thuenemann EC,Lomonossoff GP.2009.pEAQ:versatileexpression vectors for easy and quick transient expression of heterologousproteins in plants.Plant Biotechnol J 7(7):682-693。

其他参考文献

1.Johnson,M.T.J.,et al.,Evaluating Methods for Isolating Total RNAand Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse PlantTranscriptomes.PLOS ONE,2012.7(11):p.e50226.

2.Schlotterbeck,T.,et al.,The Use of Leaves from Young Trees ofQuillaja saponaria(Molina)Plantations as a New Source of Saponins.EconomicBotany,2015.69(3):p.262-272.

3.Miettinen,K.,et al.,The ancient CYP716 family is a majorcontributor to the diversification of eudicot triterpenoid biosynthesis.NatCommun,2017.8:p.14153.

4.Sainsbury,F.,E.C.Thuenemann,and G.P.Lomonossoff,pEAQ:versatileexpression vectors for easy and quick transient expression of heterologousproteins in plants.Plant Biotechnol J,2009.7(7):p.682-93.

5.Reed,J.,et al.,A translational synthetic biology platform for rapidaccess to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.Metab Eng,2017.

6.Moses,T.,et al.,Combinatorial biosynthesis of sapogenins andsaponins in Saccharomyces cerevisiae using a C-16αhydroxylase from Bupleurumfalcatum.Proc Natl Acad Sci U S A,2014.111(4):p.1634-39.

7.Moses,T.,et al.,Unravelling the Triterpenoid Saponin Biosynthesisof the African Shrub Maesa lanceolata.Mol Plant,2014.8:p.122-35.

8.Fukushima,E.O.,et al.,Combinatorial biosynthesis of legume naturaland rare triterpenoids in engineered yeast.Plant Cell Physiol,2013.54(5):p.740-9.

9.Fukushima,E.O.,et al.,CYP716A subfamily members are multifunctionaloxidases in triterpenoid biosynthesis.Plant Cell Physiol,2011.52(12):p.2050-61.

10.Carelli,M.,et al.,Medicago truncatula CYP716A12 is amultifunctional oxidase involved in the biosynthesis of hemolyticsaponins.Plant Cell,2011.23(8):p.3070-81.

11.Han,J.Y.,et al.,The involvement ofβ-amyrin 28-oxidase(CYP716A52v2)in oleanane-type ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng.Plant CellPhysiol,2013.54(12):p.2034-46.

12.Fiallos-Jurado,J.,et al.,Saponin determination,expression analysisand functional characterization of saponin biosynthetic genes in Chenopodiumquinoa leaves.Plant Sci,2016.250:p.188-97.

13.Khakimov,B.,et al.,Identification and genome organization ofsaponin pathway genes from a wild crucifer,and their use for transientproduction of saponins in Nicotiana benthamiana.Plant J,2015.84(3):p.478-90.

14.Andre,C.M.,et al.,Multifunctional oxidosqualene cyclases andcytochrome P450 involved in the biosynthesis of apple fruit triterpenicacids.New Phytol,2016.211(4):p.1279-94.

15.Huang,L.,et al.,Molecular characterization of the pentacyclictriterpenoid biosynthetic pathway in Catharanthus roseus.Planta,2012.236(5):p.1571-81.

16.Xu,G.,et al.,A novel glucuronosyltransferase has an unprecedentedability to catalyse continuous two-step glucuronosylation of glycyrrhetinicacid to yield glycyrrhizin.New Phytologist,2016.212(1):p.123-135.

17.Shibuya,M.,et al.,Identification and characterization ofglycosyltransferases involved in the biosynthesis ofsoyasaponin I in Glycinemax.FEBS Lett,2010.584(11):p.2258-64.

18.Wang,P.,et al.,Synthesis of the potent immunostimulatory adjuvantQS-21A.J Am Chem Soc,2005.127(10):p.3256-7.

19.Moses,T.,et al.,Comparative analysis of CYP93E proteins forimproved microbial synthesis of plant triterpenoids.Phytochemistry,2014.108:p.47-56.

20.Dai,Z.,et al.,Producing aglycons of ginsenosides in bakers'yeast.Sci Rep,2014.4:p.3698.

21.Dai,Z.,et al.,Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiaefor production of ginsenosides.Metab Eng,2013.20(0):p.146-56.

22.Salmon,M.,et al.,A conserved amino acid residue critical forproduct and substrate specificity in plant triterpene synthases.Proc NatlAcad Sci U S A,2016.113(30):p.E4407-14.

23.Engler,C.,et al.,A golden gate modular cloning toolbox forplants.ACS Synth Biol,2014.3(11):p.839-43.

24.Mugford,S.T.,et al.,Modularity of plant metabolic gene clusters:atrio of linked genes that are collectively required for acylation oftriterpenes in oat.Plant Cell,2013.25(3):p.1078-92.

25.Paddon,C.J.,et al.,High-level semi-synthetic production of thepotent antimalarial artemisinin.Nature,2013.496(7446):p.528-32.

26.MacKenzie,D.J.,et al.,Improved RNA Extraction from Woody Plantsfor the Detection of Viral Pathogens by Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction.Plant Disease,1997.81(2):p.222-226.

27.Sainsbury,F.and G.P.Lomonossoff,Transient expressions of syntheticbiology in plants.Current Opinion in Plant Biology,2014.19(0):p.1-7.

附录A：序列表和序列

表1-皂皮树序列

克隆号是指来自原始1KP转录组组装的重叠群号

(https://db.cngb.org/blast4onekp/)

***

表2-非皂皮树序列

在皂皮酸中发现的相关位置(16α、28、23)处氧化β-香树脂醇(或其衍生物)的细胞色素P450。已经通过在本氏烟草中的瞬时表达测试了以粗体表示名称的酶，并且发现所述酶产生与参考研究报道的相一致的产物。

基因名称前面的首字母缩写代表如下的物种：As-糙伏毛燕麦(Avena strigosa)、At-拟南芥(Arabidopsis thaliana)、Bf-柴胡(Bupleurum falcatum)、Bv-欧洲山芥(Barbarea vulgaris)、Cq-昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)、Cr-长春花(Catharanthusroseus)、Md-苹果(Malus domestica)、Ml-长叶杜茎山(Maesa lanceolata)、Mt-蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Pg-人参(Panax ginseng)、Vv-葡萄(Vitis vinifera)。

表2a

表2b

表2c

表2d

表3-辅助酶

表4-在1KP数据集中发现的基因序列与在本公开文本中的从皂皮树植物中通过 PCR获得的测序克隆之间的比较

SEQ ID NO:1-皂皮树β-香树脂醇合酶，QsbAS(OQHZ-2074321)编码序列(2277bp)：

ATGTGGAGGCTGAAGATAGCAGAAGGTGGTTCCGATCCATATCTGTTCAGCACAAACAACTTCGTGGGTCGCCAGACATGGGAGTTCGAACCGGAGGCCGGCACACCTGAGGAGCGAGCAGAGGTCGAAGCTGCCCGCCAAAACTTTTACAACAACCGTTACCAGGTCAAGCCCTGTGACGACCTCCTTTGGAGATATCAGTTCCTGAGAGAGAAGAATTTCAAACAAACAATACCGCCTGTCAAGGTTGAAGATGGCCAAGAAATTACTTATGAGATGGCCACAACCTCAATGCAGAGGGCGGCCCGTCACCTATCAGCCTTGCAGGCCAGCGATGGCCATTGGCCAGCTCAAATTGCTGGCCCCTTGTTCTTCATGCCACCCTTGGTCTTTTGTGTGTACATTACTGGGCATCTTAATACAGTATTCCCATCTGAACATCGCAAAGAAATCCTTCGTTACATGTACTATCACCAGAACGAAGATGGTGGGTGGGGACTGCACATAGAGGGTCACAGCACCATGTTTTGCACAGCACTCAACTACATTTGTATGCGTATCCTTGGGGAAGGACCAGAGGGGGGTCAAGACAATGCTTGTGCCAGAGCACGAATGTGGATTCTTGATCATGGTGGTGTAACACATATTCCATCTTGGGGAAAGACCTGGCTTTCGATACTTGGTCTATTTGAGTGGTCTGGAAGCAATCCAATGCCTCCAGAGTTTTGGATCCTTCCTTCATTTCTTCCTATGCATCCAGCAAAAATGTGGTGCTATTGCCGGATGGTTTACATGCCCATGTCTTATTTATATGGGAAAAGGTTTGTTGGCCCAATCACGCCTCTCATTGTTCAGTTAAGAGAGGAAATACACACTCAAAATTACCATGAAATCAACTGGAAGTCAGTCCGCCATCTATGTGCAAAGGAGGATATCTACTATCCCCATCCACTCATCCAAGATTTGATTTGGGACAGTTTGTACATACTAACGGAGCCTCTTCTCACTCGCTGGCCCTTGAACAAGTTGGTGCGGGAGAGGGCTCTCCAAGTAACAATGAAGCATATCCACTATGAAGATGAAAATAGTCGATACATAACCATTGGATGTGTGGAAAAGGTGTTATGTATGCTTGCTTGTTGGGTTGATGATCCAAATGGAGATGCTTTCAAGAAGCACCTTGCTCGAGTCCCAGATTACGTATGGGTCTCTGAAGATGGAATTACTATGCAGAGTTTTGGTAGTCAAGAATGGGATGCTGGCTTTGCCGTCCAGGCTCTGCTTGCTTCTAATCTTACCGAGGAACTTGGCCCTGCTCTTGCCAAAGGACATGACTTCATAAAGCAATCTCAGGTTAAGGACAATCCTTCAGGTGACTTCAAAAGCATGTATCGTCACATTTCTAGAGGATCATGGACCTTCTCTGACCAAGATCATGGATGGCAAGTTTCTGATTGCACTGCAGAAGGTCTGAAGTGTTGCCTGCTTTTGTCGATGTTGCCACCAGAAATTGTTGGTGAAAAAATGGAACCACAAAGGCTATTTGATTCTGTCAATGTGCTGCTCTCTCTACAGAGCAAAAAAGGTGGTTTAGCTGCCTGGGAGCCAGCAGGGGCGCAAGATTGGTTGGAATTACTCAATCCCACAGAATTTTTTGCGGACATTGTCGTTGAGCATGAATATGTTGAATGTACTGGATCAGCAATTCAGGCATTAGTTTTGTTCAAGAAGCTGTATCCGGGGCACAGGAAAAAAGAGATTGACAGTTTCATTACAAATGCTGTCCGGTTCCTTGAGAATACACAAACGGCAGATGGCTCTTGGTATGGAAACTGGGGAGTTTGCTTCACCTATGGTTGTTGGTTCGCACTGGGAGGGCTAGCAGCAGCTGGCAAGACTTACAACAACTGTCCTGCAATACGCAAAGCTGTTAATTTCCTACTTACAACACAAAGAGAAGACGGTGGTTGGGGAGAAAGCTATCTTTCAAGCCCAAAAAAGATATATGTACCCCTGGAAGGAAGCCGATCAAATGTGGTACATACTGCATGGGCTATGATGGGTCTAATTCATGCTGGGCAGGCTGAAAGAGACTCAACTCCTCTTCATCGTGCAGCAAAGTTGATCATCAATTATCAACTAGAAAATGGCGATTGGCCGCAACAGGAAATCACTGGAGTATTCATGAAAAACTGCATGTTACATTACCCTATGTACAGAAACATCTACCCAATGTGGGCTCTTGCAGAATACCGGAGGCGGGTTCCATTGCCTTAA

SEQ ID NO:2-QsbAS(OQHZ-2074321)翻译的核苷酸序列(758aa)：

MWRLKIAEGGSDPYLFSTNNFVGRQTWEFEPEAGTPEERAEVEAARQNFYNNRYQVKPCDDLLWRYQFLREKNFKQTIPPVKVEDGQEITYEMATTSMQRAARHLSALQASDGHWPAQIAGPLFFMPPLVFCVYITGHLNTVFPSEHRKEILRYMYYHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTALNYICMRILGEGPEGGQDNACARARMWILDHGGVTHIPSWGKTWLSILGLFEWSGSNPMPPEFWILPSFLPMHPAKMWCYCRMVYMPMSYLYGKRFVGPITPLIVQLREEIHTQNYHEINWKSVRHLCAKEDIYYPHPLIQDLIWDSLYILTEPLLTRWPLNKLVRERALQVTMKHIHYEDENSRYITIGCVEKVLCMLACWVDDPNGDAFKKHLARVPDYVWVSEDGITMQSFGSQEWDAGFAVQALLASNLTEELGPALAKGHDFIKQSQVKDNPSGDFKSMYRHISRGSWTFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSMLPPEIVGEKMEPQRLFDSVNVLLSLQSKKGGLAAWEPAGAQDWLELLNPTEFFADIVVEHEYVECTGSAIQALVLFKKLYPGHRKKEIDSFITNAVRFLENTQTADGSWYGNWGVCFTYGCWFALGGLAAAGKTYNNCPAIRKAVNFLLTTQREDGGWGESYLSSPKKIYVPLEGSRSNVVHTAWAMMGLIHAGQAERDSTPLHRAAKLIINYQLENGDWPQQEITGVFMKNCMLHYPMYRNIYPMWALAEYRRRVPLP*

SEQ ID NO:3-QsCYP716_2073932(OQHZ-2073932)(C-28氧化酶，先前称为CYP716A224[3])编码序列(1443bp)：

ATGGAGCACTTGTATCTCTCCCTTGTGCTCCTGTTTGTTTCCTCAATCTCCCTCTCCCTCTTCTTCCTGTTCTACAAACACAAATCTATGTTCACCGGGGCCAACCTACCACCTGGTAAAATCGGTTACCCATTGATCGGAGAGAGCTTGGAGTTCTTGTCCACGGGATGGAAGGGCCACCCGGAGAAATTCATCTTCGATCGCATGAGCAAGTACTCATCCCAAATCTTCAAGACCTCGATTTTAGGGGAACCAACGGCGGTGTTCCCGGGAGCCGTATGCAACAAGTTCCTCTTCTCCAACGAGAACAAGCTGGTGAATGCATGGTGGCCTGCCTCCGTGGACAAGATCTTTCCTTCCTCACTCCAGACATCCTCCAAAGAAGAGGCCAAGAAGATGAGGAAGTTGCTTCCTCAGTTTCTCAAGCCCGAAGCTCTGCACCGCTACATTGGTATTATGGATTCTATTGCCCAGAGACACTTTGCCGATAGCTGGGAAAACAAAAACCAAGTCATTGTCTTTCCTCTAGCAAAGAGGTATACTTTCTGGCTGGCTTGCCGTTTGTTCATTAGCGTCGAGGATCCGACCCACGTATCCAGATTTGCTGACCCGTTCCAACTTTTGGCCGCCGGAATCATATCAATCCCAATCGACTTGCCAGGGACACCGTTCCGCAAGGCAATCAATGCGTCCCAGTTCATCAGGAAGGAATTGTTGGCCATCATCAGGCAGAGAAAGATCGATTTGGGTGAAGGGAAGGCATCTCCGACGCAGGACATACTGTCTCACATGTTGCTCACATGCGACGAGAACGGACAATACATGAATGAATTGGACATTGCCGACAAGATTCTTGGCTTGTTGGTCGGCGGACATGACACTGCCAGTGCCGCTTGCACTTTCATTGTCAAGTTCCTCGCTGAGCTTCCCCACATTTATGAACAAGTCTACAAGGAGCAAATGGAGATTGCAAAATCAAAAGTGCCAGGAGAGTTGTTGAATTGGGAGGACATCCAAAAGATGAAATATTCGTGGAACGTAGCTTGTGAAGTGATGAGACTTGCCCCTCCACTCCAAGGAGCTTTCAGGGAAGCCATTACTGACTTCGTCTTCAACGGTTTCTCCATTCCAAAAGGCTGGAAGTTGTACTGGAGCGCAAATTCCACCCACAAAAGTCCGGATTATTTCCCTGAGCCCGACAAGTTCGACCCAACTAGATTCGAAGGAAATGGACCTGCGCCTTACACCTTTGTTCCATTTGGGGGAGGACCCAGGATGTGCCCGGGCAAAGAGTATGCCCGATTGGAAATACTTGTGTTCATGCATAACTTGGTGAAGAGGTTCAAGTGGGAGAAATTGGTTCCTGATGAAAAGATTGTGGTTGATCCAATGCCCATTCCAGCAAAGGGTCTTCCTGTTCGCCTTTATCCTCACAAAGCTTGA

SEQ ID NO:4-QsCYP716_2073932(OQHZ-2073932)翻译的核苷酸序列(480aa)：

MEHLYLSLVLLFVSSISLSLFFLFYKHKSMFTGANLPPGKIGYPLIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRMSKYSSQIFKTSILGEPTAVFPGAVCNKFLFSNENKLVNAWWPASVDKIFPSSLQTSSKEEAKKMRKLLPQFLKPEALHRYIGIMDSIAQRHFADSWENKNQVIVFPLAKRYTFWLACRLFISVEDPTHVSRFADPFQLLAAGIISIPIDLPGTPFRKAINASQFIRKELLAIIRQRKIDLGEGKASPTQDILSHMLLTCDENGQYMNELDIADKILGLLVGGHDTASAACTFIVKFLAELPHIYEQVYKEQMEIAKSKVPGELLNWEDIQKMKYSWNVACEVMRLAPPLQGAFREAITDFVFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKSPDYFPEPDKFDPTRFEGNGPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKLVPDEKIVVDPMPIPAKGLPVRLYPHKA*

SEQ ID NO:5-QsCYP716_2012090(OQHZ-2012090)(C-16α氧化酶)编码序列(1506bp/1443bp)：

如本文所述，通过在以下序列中画下划线的前63个核苷酸(21个氨基酸)的存在区分NB长和短亚型。

ATGATATATAATAATGATAGTAATGATAATGAATTAGTAATCAGCTCAGTTCAGCAACCATCCATGGATCCTTTCTTCATTTTTGGCTTACTTCTCTTGGCTCTCTTTCTCTCTGTTTCTTTTCTTCTCTACCTTTCCCGTAGAGCCTATGCTTCTCTCCCCAACCCTCCGCCGGGGAAGCTCGGCTTCCCCGTCGTCGGCGAGAGTCTCGAATTTCTCTCCACCCGACGCAAAGGTGTTCCTGAGAAATTCGTCTTCGACAGAATGGCCAAATACTGTCGGGATGTCTTTAAGACATCAATATTGGGAGCAACCACCGCCGTCATGTGCGGCACCGCCGGTAACAAATTCTTGTTCTCCAACGAGAAAAAACACGTCACTGGTTGGTGGCCGAAATCTGTAGAGCTGATTTTCCCAACCTCACTTGAGAAATCATCCAACGAAGAATCCATCATGATGAAACAATTCCTTCCCAACTTCTTGAAACCAGAACCTTTGCAGAAGTACATACCCGTTATGGACATAATTACCCAAAGACACTTCAATACAAGCTGGGAAGGACGCAACGTGGTCAAAGTGTTTCCTACGGCTGCCGAATTCACCACGTTGCTGGCTTGTCGGGTATTCCTCAGTGTTGAGGATCCCATTGAAGTAGCCAAGATTTCAGAGCCATTTGAAATCTTAGCTGCTGGGTTTCTTTCAATACCCATAAATCTTCCGGGTACCAAATTAAATAAAGCGGTTAAGGCAGCGGATCAGATTAGAGACGCAATTGTACAGATTTTGAAACGGAGAAGGGTTGAAATTGCGGAGAATAAAGCAAATGGAATGCAAGATATAGCGTCCATGTTGTTGACGACACCAACTAATGCTGGGTTTTATATGACCGAGGCTCACATTTCTGAGAAAATTTTGGGTATGATTGTTGGTGGCCGTGATACTGCTAGTACTGTTATCACCTTCATCATCAAGTATTTGGCAGAGAATCCTGAAATTTATAATAAGGTCTATGAGGAGCAAATGGAAGTGGTAAAGTCAAAGAAACCAGGTGAGTTGCTGAACTGGGAAGATGTGCAGAAAATGAAGTACTCTTGGTGCGTAGCATGTGAAGCTATGCGACTTGCTCCTCCTGTTCAAGGTGGTTTCAAGGTGGCCATTAATGACTTTGTGTATTCTGGGTTCAACATTCGCAAGGGTTGGAAGTTATATTGGAGTGCCATTGCAACACACATGAATCCAGAATATTTCCCAGAACCTGAGAAATTCAACCCCTCAAGGTTTGAAGGGAAGGGACCAGTACCTTACAGCTTCGTACCCTTCGGAGGCGGACCTCGGATGTGTCCCGGGAAAGAGTATTCCCGGCTGGAAACACTTGTTTTCATGCATCATTTGGTGACGAGGTACAATTGGGAGAAAGTGTATCCCACAGAGAAGATAACAGTGGATCCAATGCCATTCCCTGTCAACGGCCTCCCCATTCGCCTTATTCCTCACAAGCACCAATGA

SEQ ID NO:6-QsCYP716_2073932翻译的核苷酸序列(501aa/480aa)：

MIYNNDSNDNELVISSVQQPSMDPFFIFGLLLLALFLSVSFLLYLSRRAYASLPNPPPGKLGFPVVGESLEFLSTRRKGVPEKFVFDRMAKYCRDVFKTSILGATTAVMCGTAGNKFLFSNEKKHVTGWWPKSVELIFPTSLEKSSNEESIMMKQFLPNFLKPEPLQKYIPVMDIITQRHFNTSWEGRNVVKVFPTAAEFTTLLACRVFLSVEDPIEVAKISEPFEILAAGFLSIPINLPGTKLNKAVKAADQIRDAIVQILKRRRVEIAENKANGMQDIASMLLTTPTNAGFYMTEAHISEKILGMIVGGRDTASTVITFIIKYLAENPEIYNKVYEEQMEVVKSKKPGELLNWEDVQKMKYSWCVACEAMRLAPPVQGGFKVAINDFVYSGFNIRKGWKLYWSAIATHMNPEYFPEPEKFNPSRFEGKGPVPYSFVPFGGGPRMCPGKEYSRLETLVFMHHLVTRYNWEKVYPTEKITVDPMPFPVNGLPIRLIPHKHQ*

SEQ ID NO:7-QsCYP714_c36368(C-23候选物#7)编码序列(1524bp)：

ATGTGGTTCACAGTAGGATTGGTCTTGGTTTTCGCCCTATTCATACGTCTCTACAGCAGTCTGTGGTTGAAGCCTCGTGCAACTCGGATTAAGCTTAGCAATCAAGGAATTAAAGGTCCAAAACCAGCATTTCTTCTGGGTAATGTTGCAGAGATGAGAAGATTTCAATCTAAGCTTCCAAAATCTGAACTCAAACAAGGCCAAGTTTCTCATGATTGGGCTTCTAAATCTCTGTTTCCATTTTTCAGTCTTTGGTCCCAGAAATACGGAAATACGTTCGTGTTCTCATTGGGGAACATACAGGTGCTCTATGTTTCTGATCATGAGTTGGTGAAAGAAATTAATCAGAATACCTCTTTAGATTTGGGCAAACCCAAGTACCTGCAGAAGGAGCGTGGCCCTTTGCTGGGACAAGGTATTTTGACCTCCAATGGACAGCTTTGGGCGTACCAGAGAAAAATCATGACTCCTGAACTCTACAAGGAGAAAATCAAGGGCATGTGCGAGTTGATGGTGGAATCTGTAGCTTGGTTGGTTGAGGAATGGGGAACGAAGATCCAAGCTGAGGGTGGGGCAGCAGACATTAGAATAGACGAGGATCTTAGAAGCTTCTCTGGTGATGTAATTTCAAAAGCTTGTTTTGGGAGCTGCTATGCCGGAGGGAGGGAAATCTTTCTTAGGCTCAGAGCTCTTCAACACCAAATTGCTTCCAAAGCCTTACTCATGGGCTTCCCTGGATTAAAGTACCTGCCCATTAAGAGCAACAGAGAGATATGGAGATTGGAGAAGGAGATCTTCCAGCTGATTATGAAGCTGGCTGAAGATAGAAAAAAAGAACAACATGAGAGAGACCTATTACAGATTATAATTGAGGGAGCTAAAAGTAGTGATCTGAGTTCGGAAGCAATGGCAAAATTCATTGTGGACAACTGCAAGAATGTCTACTTGGCTGGCCATGAAACTACTGCAATGTCTGCTGGTTGGACTTTGCTTCTCTTGGCTAATCATCCTGAGTGGCAAGCCCGTGTCCGTGATGAGATTTTACAAGTCACCGAGGGCCGCAATCCTGATTTTGACATGCTGCACAAGATGAAACTGTTAACAATGGTAATTCAGGAGGCACTGCGACTCTACCCAACAGTCATATTCATGTCAAGAGAAGCATTGGAAGATATTAATGTTGGAAACATCCAAGTTCCAAAAGGTGTTAACATATGGATACCTGTGGTAAATCTTCAAAGGGACACAACGGTATGGGGTGCAGACGCAAACGAGTTTAATCCTGAAAGGTTTGCCAATGGAGTTAACAATTCATGCAAGGTTCCACAACTTTACCTACCATTTGGAGCTGGACCTCGCATTTGTCCTGGAATTAATCTGGCCATGACTGAGATCAAGATACTTCTGTGTATCCTGCTCACCAAGTTTTCGTTTTCAGTTTCACCCAACTATCGCCACTCACCGGTGTTTAAATTGGTGCTTGAGCCTGAAAATGGAATCAATGTCATCATGAAGAAGCTCTAA

SEQ ID NO:8-QsCYP714_c36368(C-23候选物#7)翻译的核苷酸序列(507aa)：

MWFTVGLVLVFALFIRLYSSLWLKPRATRIKLSNQGIKGPKPAFLLGNVAEMRRFQSKLPKSELKQGQVSHDWASKSLFPFFSLWSQKYGNTFVFSLGNIQVLYVSDHELVKEINQNTSLDLGKPKYLQKERGPLLGQGILTSNGQLWAYQRKIMTPELYKEKIKGMCELMVESVAWLVEEWGTKIQAEGGAADIRIDEDLRSFSGDVISKACFGSCYAGGREIFLRLRALQHQIASKALLMGFPGLKYLPIKSNREIWRLEKEIFQLIMKLAEDRKKEQHERDLLQIIIEGAKSSDLSSEAMAKFIVDNCKNVYLAGHETTAMSAGWTLLLLANHPEWQARVRDEILQVTEGRNPDFDMLHKMKLLTMVIQEALRLYPTVIFMSREALEDINVGNIQVPKGVNIWIPVVNLQRDTTVWGADANEFNPERFANGVNNSCKVPQLYLPFGAGPRICPGINLAMTEIKILLCILLTKFSFSVSPNYRHSPVFKLVLEPENGINVIMKKL*

***

SEQ ID NO:9；BfCYP716Y1(柴胡C-16α氧化酶)编码序列1437bp)：

ATGGAACTTTCTATCACTCTGATGCTTATTTTCTCAACAACCATCTTCTTTATATTTCGTAATGTGTACAACCATCTCATCTCTAAACACAAAAACTATCCCCCTGGAAGTATGGGCTTGCCTTACATTGGCGAAACACTTAGTTTCGCGAGATACATCACCAAAGGAGTCCCTGAAAAATTCGTAATAGAAAGACAAAAGAAATATTCAACAACAATATTTAAGACCTCCTTGTTCGGAGAAAACATGGTGGTGTTGGGCAGTGCAGAGGGCAACAAATTTATTTTTGGAAGCGAGGAGAAGTATTTACGAGTGTGGTTTCCAAGTTCTGTGGACAAAGTGTTCAAAAAATCTCATAAGAGAACGTCGCAGGAAGAAGCTATTAGGTTGCGCAAAAACATGGTGCCATTTCTCAAAGCAGATTTGTTGAGAAGTTATGTACCAATAATGGACACATTTATGAAACAACATGTGAACTCGCATTGGAATTGCGAGACCTTGAAGGCTTGTCCTGTGATCAAGGATTTTACGTTTACTTTAGCTTGTAAACTTTTTTTTAGTGTAGACAATCCTTTGGAGCTAGAGAAGTTAATCAAGCTATTTGTGAATATAGTGAATGGCCTCCTTACGGTCCCTATTGATCTCCCGGGGACAAAATTTAGAGGAGTTATAAAGAGTGTCAAGACTATTCGCCATGCGCTTAAAGTGTTGATCAGGCAACGAAAGGTGGATATTAGAGAGAAAAGAGCCACACCTACGCAAGATATATTGTCGATAATGCTGGCACAGGCTGAGGACGAGAACTATGAAATGAATGATGAAGATGTGGCCAATGACTTTCTTGCAGTTTTGCTTGCTAGTTATGATTCTGCCAATACTACACTCACCATGATTATGAAATATCTTGCTGAATATCCCGAAATGTATGATCGAGTTTTCAGAGAACAAATGGAGGTGGCAAAGACGAAAGGAAAAGATGAATTACTCAACTTGGACGACTTGCAAAAGATGAATTATACTTGGAATGTAGCTTGTGAAGTACTGAGAATTGCAACACCAACGTTCGGAGCATTCAGAGAGGTTATTGCAGATTGTACATACGAAGGGTACACCATACCAAAAGGCTGGAAGCTATATTATGCCCCGCGTTTTACCCATGGAAGTGCAAAATACTTTCAAGATCCAGAGAAATTTGATCCATCGCGATTTGAAGGTGATGGTGCGCCTCCTTATACATTCGTTCCATTCGGAGGAGGGCTCCGGATGTGCCCTGGATACAAGTATGCAAAGATTATAGTACTAGTGTTCATGCACAATATAGTTACAAAGTTCAAATGGGAGAAAGTTAACCCTAATGAGAAAATGACAGTAGGAATCGTATCAGCGCCAAGTCAAGGACTTCCACTGCGTCTCCATCCCCACAAATCTCCATCTTAA

SEQ ID NO:10；BfCYP716Y1(柴胡C-16α氧化酶)编码序列(478aa)：

MELSITLMLIFSTTIFFIFRNVYNHLISKHKNYPPGSMGLPYIGETLSFARYITKGVPEKFVIERQKKYSTTIFKTSLFGENMVVLGSAEGNKFIFGSEEKYLRVWFPSSVDKVFKKSHKRTSQEEAIRLRKNMVPFLKADLLRSYVPIMDTFMKQHVNSHWNCETLKACPVIKDFTFTLACKLFFSVDNPLELEKLIKLFVNIVNGLLTVPIDLPGTKFRGVIKSVKTIRHALKVLIRQRKVDIREKRATPTQDILSIMLAQAEDENYEMNDEDVANDFLAVLLASYDSANTTLTMIMKYLAEYPEMYDRVFREQMEVAKTKGKDELLNLDDLQKMNYTWNVACEVLRIATPTFGAFREVIADCTYEGYTIPKGWKLYYAPRFTHGSAKYFQDPEKFDPSRFEGDGAPPYTFVPFGGGLRMCPGYKYAKIIVLVFMHNIVTKFKWEKVNPNEKMTVGIVSAPSQGLPLRLHPHKSPS*

SEQ ID NO:11；MlCYP87D16(长叶杜茎山(Maesa lanceolata)C-16α氧化酶)编码序列1428bp)：

ATGTGGGTAGTGGGATTAATTGGTGTGGCTGTGGTAACAATATTGATAACTCAGTATGTATACAAATGGAGAAATCCAAAGACTGTGGGTGTTCTGCCACCTGGTTCAATGGGTCTGCCTTTGATCGGGGAGACTCTTCAACTTCTCAGCCGTAATCCATCCTTGGATCTTCATCCTTTCATCAAGAGCAGAATCCAAAGATATGGGCAGATATTCGCGACCAATATCGTAGGTCGACCCATAATAGTAACCGCTGATCCGCAGCTCAATAATTACCTTTTCCAACAAGAAGGAAGAGCAGTAGAACTGTGGTACTTGGACAGCTTTCAAAAGCTATTTAACTTAGAAGGTGCAAACAGGCCGAACGCAGTTGGTCACATTCACAAGTACGTTAGAAGTGTATACTTGAGTCTCTTTGGCGTCGAGAGCCTTAAAACAAAGTTGCTTGCCGATATTGAGAAAACAGTCCGCAAAAATCTTATTGGTGGGACAACCAAAGGCACCTTTGATGCAAAACATGCTTCTGCCAATATGGTTGCTGTTTTTGCTGCAAAATACTTGTTCGGACATGATTACGAGAAATCGAAAGAAGATGTAGGCAGCATAATCGACAACTTCGTACAAGGACTTCTCGCATTCCCATTGAATGTTCCCGGTACAAAGTTCCACAAATGTATGAAGGACAAGAAAAGGCTGGAATCAATGATCACTAACAAGCTAAAGGAGAGAATAGCTGATCCGAACAGCGGACAAGGGGATTTCCTTGATCAAGCAGTGAAAGACTTGAATAGCGAATTCTTCATAACAGAGACTTTTATCGTTTCGGTGACGATGGGAGCTTTATTTGCGACGGTTGAATCGGTTTCGACAGCAATTGGACTAGCTTTCAAGTTTTTTGCAGAGCACCCCTGGGTTTTGGATGACCTCAAGGCTGAGCATGAGGCTGTCCTTAGCAAAAGAGAGGATAGAAATTCACCTCTCACGTGGGACGAATATAGATCGATGACACACACGATGCACTTTATCAATGAAGTCGTCCGTTTGGGAAATGTTTTTCCTGGAATTTTGAGGAAAGCACTGAAAGATATTCCATATAATGGTTATACAATTCCGTCCGGTTGGACCATTATGATTGTGACCTCTACCCTTGCGATGAACCCTGAGATATTCAAGGATCCTCTTGCATTCAATCCGAAACGTTGGCGGGATATTGATCCCGAAACTCAAACTAAAAACTTTATGCCTTTCGGTGGTGGGACGAGACAATGCGCAGGTGCAGAGCTAGCCAAGGCATTCTTTGCTACCTTCCTCCATGTTTTAATCAGCGAATATAGCTGGAAGAAAGTGAAGGGAGGAAGCGTTGCTCGGACACCTATGTTAAGTTTTGAAGATGGCATATTTATTGAGGTCACCAAGAAAAACAAGTGA

SEQ ID NO:12；MlCYP87D16(长叶杜茎山C-16α氧化酶)编码序列(475aa)：

MWVVGLIGVAVVTILITQYVYKWRNPKTVGVLPPGSMGLPLIGETLQLLSRNPSLDLHPFIKSRIQRYGQIFATNIVGRPIIVTADPQLNNYLFQQEGRAVELWYLDSFQKLFNLEGANRPNAVGHIHKYVRSVYLSLFGVESLKTKLLADIEKTVRKNLIGGTTKGTFDAKHASANMVAVFAAKYLFGHDYEKSKEDVGSIIDNFVQGLLAFPLNVPGTKFHKCMKDKKRLESMITNKLKERIADPNSGQGDFLDQAVKDLNSEFFITETFIVSVTMGALFATVESVSTAIGLAFKFFAEHPWVLDDLKAEHEAVLSKREDRNSPLTWDEYRSMTHTMHFINEVVRLGNVFPGILRKALKDIPYNGYTIPSGWTIMIVTSTLAMNPEIFKDPLAFNPKRWRDIDPETQTKNFMPFGGGTRQCAGAELAKAFFATFLHVLISEYSWKKVKGGSVARTPMLSFEDGIFIEVTKKNK*

SEQ ID NO:13；MtCYP72A68v2(蒺藜苜蓿C-23氧化酶)编码序列(1563bp)：

ATGGAATTATCTTGGGAAACAAAATCAGCCATAATTCTCATCACTGTGACATTTGGTTTGGTATACGCATGGAGGGTATTGAATTGGATGTGGCTGAAGCCAAAGAAGATAGAGAAGCTTTTAAGAGAACAAGGCCTTCAAGGGAACCCTTATAGACTTTTGCTTGGAGATGCAAAGGATTATTTTGTGATGCAAAAGAAAGTTCAATCCAAACCCATGAATCTATCTGATGATATTGCGCCACGTGTCGCTCCTTACATTCATCATGCTGTTCAAACTCATGGGAAAAAGTCTTTTATTTGGTTTGGAATGAAACCATGGGTGATTCTCAATGAACCTGAACAAATAAGAGAAGTATTCAACAAGATGTCTGAGTTCCCAAAGGTTCAATATAAGTTTATGAAGTTAATAACTCGCGGTCTTGTTAAACTAGAAGGAGAAAAGTGGAGCAAGCATAGAAGAATAATCAACCCTGCGTTTCACATGGAAAAATTGAAGATTATGACACCAACATTCTTGAAAAGCTGCAATGATTTGATTAGCAATTGGGAAAAAATGTTGTCTTCAAATGGATCATGTGAAATGGACGTATGGCCTTCCCTTCAGAGCTTGACAAGTGATGTTATCGCTCGTTCGTCATTTGGAAGTAGTTATGAAGAAGGAAGAAAAGTATTTCAACTTCAAATAGAGCAAGGTGAACTTATAATGAAAAATCTAATGAAATCTTTAATCCCTTTATGGAGGTTTTTACCTACCGCTGATCATAGAAAGATAAATGAAAATGAAAAACAAATAGAAACTACTCTTAAGAATATAATTAACAAGAGGGAAAAAGCAATTAAGGCAGGTGAAGCCACTGAGAATGACTTATTAGGTCTCCTCCTAGAGTCGAACCACAGAGAAATTAAAGAACATGGAAACGTCAAGAATATGGGATTGAGTCTTGAAGAAGTAGTCGGGGAATGCAGGTTATTCCATGTTGCAGGGCAAGAGACTACTTCAGATTTGCTTGTTTGGACGATGGTGTTGTTGAGTAGGTACCCTGATTGGCAAGAACGTGCAAGGAAGGAAGTATTAGAGATATTTGGCAATGAAAAACCCGACTTTGATGGACTAAATAAACTTAAGATTATGGCCATGATTTTGTATGAGGTTTTGAGGTTGTACCCTCCTGTAACCGGCGTTGCTCGAAAAGTTGAGAATGATATAAAACTTGGAGACTTGACATTATATGCTGGAATGGAGGTTTACATGCCAATTGTTTTGATTCACCATGATTGTGAACTATGGGGTGATGATGCTAAGATTTTCAATCCTGAGAGATTTTCTGGTGGAATTTCCAAAGCAACAAACGGTAGATTTTCATATTTTCCGTTTGGAGCGGGTCCTAGAATCTGCATTGGACAAAACTTTTCCCTGTTGGAAGCAAAGATGGCAATGGCATTGATTTTAAAGAATTTTTCATTTGAACTTTCTCAAACATATGCTCATGCTCCATCTGTGGTGCTTTCTGTTCAGCCACAACATGGTGCTCATGTTATTCTACGCAAAATCAAAACATAA

SEQ ID NO:14；MtCYP72A68v2(蒺藜苜蓿C-23氧化酶)翻译的核苷酸序列520aa)：

MELSWETKSAIILITVTFGLVYAWRVLNWMWLKPKKIEKLLREQGLQGNPYRLLLGDAKDYFVMQKKVQSKPMNLSDDIAPRVAPYIHHAVQTHGKKSFIWFGMKPWVILNEPEQIREVFNKMSEFPKVQYKFMKLITRGLVKLEGEKWSKHRRIINPAFHMEKLKIMTPTFLKSCNDLISNWEKMLSSNGSCEMDVWPSLQSLTSDVIARSSFGSSYEEGRKVFQLQIEQGELIMKNLMKSLIPLWRFLPTADHRKINENEKQIETTLKNIINKREKAIKAGEATENDLLGLLLESNHREIKEHGNVKNMGLSLEEVVGECRLFHVAGQETTSDLLVWTMVLLSRYPDWQERARKEVLEIFGNEKPDFDGLNKLKIMAMILYEVLRLYPPVTGVARKVENDIKLGDLTLYAGMEVYMPIVLIHHDCELWGDDAKIFNPERFSGGISKATNGRFSYFPFGAGPRICIGQNFSLLEAKMAMALILKNFSFELSQTYAHAPSVVLSVQPQHGAHVILRKIKT*

SEQ ID NO:15；AsCYP94D65(糙伏毛燕麦C-23氧化酶)编码序列1551bp)：

ATGGAGCCGGCGCCCTTGAGCTCATCGCCGGTGCTTATCTGCCTCCTACTCCTACTCCTACCCATCGTCCTCTATTTTGTGTACCGGAAAAATAATCTGAAGAGGAAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGAATGGGCCGCGGGAGCTGCGGGCGTACCCGATCGTGGGCACGCTTCCACACTTCATCAAGAACGGGCGGCGCTTCCTGGAGTGGTCGTCGGCCGTCATGCAGCGCAGCCCGACGCACACCATGATCCTCAAGGTGCTGGGCCTGTCGGGCACCGTGTTCACGGCGAGCCCGGCCAGCGTGGAACACGTGCTGAAGACGCGCTTCGCGAACTACCCGAAAGGCGGTCTGGTCGATATCCAGACCGACTTCCTTGGGCACGGCATCTTCAACTCGGACGGCGAGGAGTGGCAGCAGCAGCGCAAGATGGCCAGCTACGAGTTCAACCAGCGGTCGCTCAGGAGCTTCGTGGTGCACGCCGTCCGTTTCGAGGTGGTGGAGCGCCTGCTGCCGCTGCTGGAGCGGGCCGCCGGGGCTGGAGCGGCCGTCGACCTGCAGGACGTGCTGGAGCGCTTCGCCTTCGACAACATCTGCCGCGTGGCTTTCGGCCAGGACCCGGCATGCCTCACGGAGGAGAGCATGGGCGCGAGGCAGAGCGTGGAGTTGATGCACGCCTTCGATGTGGCAAGCACCATCGTCATTACCAGGTTCGTGTCTCCGACGTGGTTGTGGCGCCTGATGAAGCTGCTCAACGTGGGGCCGGAGCGGCGGATGCGGAAGGCACTGGCATCCATCCACGGCTACGCCGACAACATCATCCGGGAGAGGAAGAAGAAGAAGAAGACATCAGGGAAGGACGACGACCTCCTGTCGCGCTTCGCCGATTCCGGCGAGCACAGCGACGAGAGCCTCCGCTACGTGATCACCAACTTCATACTCGCCGGCCGCGACTCCAGCTCCGCCGCGCTCACATGGTTTTTCTGGCTCGTCTCCACCAGGCCCGAGGTACAGGACAGGATCTCCAAGGAGATCCGAGCGGCGCGCCAGGCAAGCGCAACGACGACGGGGCCCTTCGGCCTGGAGGAGCTGCGCGAGATGCACTACATCCACGCCGCCATCACGGAGTCCATGCGGCTCTACCCGCCGGTGCCCATCAACGCGCGCACCTCCACCGAGGACGATGTCCTTCCAGACGGCACCGTGGTCGGGAAAGGCTGGCGGGTGATCTACTCCGCCTACGCCATGGGGCGGATGGAGGACGCCTGGGGAAAGGACGGGGACGAGTTCCGGCCGGAGAGGTGGCTGGACGCGGAGACAGGGGTGTTCAGGCCGGAGGCACCCTGCAAGTACCCGGTGTTCCACGTCGGCCCAAGAATGTGCCTCGGCAAAGAGATGGCCTACATACAGATGAAGTCCATCGTGGCGTCCGTGTTTGAGAGGTTCAGCTTGCGCTACCTCGGCGGGGACGCCCATCCCGGCCTCCAGCTCGCTGGAACTCTGCGCATGGAAGGCGGCTTGCCGATGCACCTAGAAATCAGTACTAACTAG

SEQ ID NO:16；AsCYP94D65(糙伏毛燕麦C-23氧化酶)翻译的核苷酸序列516aa)：

MEPAPLSSSPVLICLLLLLLPIVLYFVYRKNNLKRKQQQQQQNGPRELRAYPIVGTLPHFIKNGRRFLEWSSAVMQRSPTHTMILKVLGLSGTVFTASPASVEHVLKTRFANYPKGGLVDIQTDFLGHGIFNSDGEEWQQQRKMASYEFNQRSLRSFVVHAVRFEVVERLLPLLERAAGAGAAVDLQDVLERFAFDNICRVAFGQDPACLTEESMGARQSVELMHAFDVASTIVITRFVSPTWLWRLMKLLNVGPERRMRKALASIHGYADNIIRERKKKKKTSGKDDDLLSRFADSGEHSDESLRYVITNFILAGRDSSSAALTWFFWLVSTRPEVQDRISKEIRAARQASATTTGPFGLEELREMHYIHAAITESMRLYPPVPINARTSTEDDVLPDGTVVGKGWRVIYSAYAMGRMEDAWGKDGDEFRPERWLDAETGVFRPEAPCKYPVFHVGPRMCLGKEMAYIQMKSIVASVFERFSLRYLGGDAHPGLQLAGTLRMEGGLPMHLEISTN*

SEQ ID NO:17；MtCYP716A12(蒺藜苜蓿C-28氧化酶)编码序列1440bp)：

ATGGAGCCTAATTTCTATCTCTCCCTTCTCCTTCTCTTTGTCACTTTCATATCTCTCTCTCTTTTTTTCATATTCTACAAACAGAAATCTCCATTAAATTTGCCACCTGGTAAAATGGGTTACCCAATCATAGGTGAAAGCCTTGAGTTCTTATCAACAGGATGGAAAGGACATCCTGAAAAATTCATTTTCGACCGTATGCGTAAATATTCCTCAGAACTCTTTAAAACATCAATCGTAGGAGAATCTACGGTGGTTTGTTGCGGAGCAGCAAGTAACAAGTTTTTGTTTTCAAACGAGAATAAACTTGTGACTGCATGGTGGCCAGATAGTGTAAACAAAATCTTCCCTACTACTTCTCTTGACTCTAACTTGAAGGAAGAATCCATCAAGATGAGAAAATTGCTTCCACAATTCTTTAAACCCGAAGCTCTACAACGTTATGTTGGTGTCATGGATGTTATTGCTCAAAGACATTTTGTTACTCATTGGGATAATAAAAATGAAATCACCGTCTACCCCTTGGCCAAGAGGTACACCTTTTTGTTAGCTTGTCGGTTGTTCATGAGCGTTGAAGACGAGAATCATGTAGCAAAATTTAGTGATCCATTTCAGTTAATTGCGGCCGGAATCATATCTCTACCAATTGATTTGCCAGGAACACCATTCAACAAAGCTATAAAGGCCTCAAACTTTATAAGAAAGGAGTTGATTAAGATCATAAAGCAAAGGAGGGTAGATTTGGCAGAAGGGACAGCATCACCAACACAAGATATATTGTCTCACATGTTGTTGACAAGTGATGAAAATGGAAAGAGTATGAATGAACTTAATATTGCTGATAAGATTCTTGGCCTTTTGATCGGAGGACATGACACTGCTAGCGTCGCATGCACTTTCCTTGTCAAATATCTCGGCGAGTTACCTCACATTTATGATAAAGTCTATCAAGAGCAAATGGAAATTGCAAAATCGAAACCAGCAGGAGAATTGTTGAATTGGGATGACCTGAAGAAAATGAAATACTCTTGGAACGTAGCTTGTGAAGTAATGAGACTTTCCCCTCCACTCCAAGGAGGTTTCAGGGAAGCCATCACTGACTTTATGTTCAATGGATTCTCAATTCCTAAGGGATGGAAGCTTTATTGGAGTGCAAATTCAACACATAAGAACGCAGAATGTTTTCCCATGCCAGAGAAATTTGACCCAACAAGATTTGAAGGAAATGGACCAGCTCCTTATACTTTTGTTCCCTTTGGTGGAGGACCAAGGATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCAAGATTAGAAATACTTGTTTTCATGCACAATTTGGTGAAAAGGTTTAAGTGGGAAAAGGTGATTCCAGATGAGAAGATTATTGTTGATCCATTCCCCATCCCTGCAAAGGATCTTCCAATTCGCCTTTATCCACACAAAGCTTAA

SEQ ID NO:18；MtCYP716A12(蒺藜苜蓿C-28氧化酶)编码序列(479aa)：

MEPNFYLSLLLLFVTFISLSLFFIFYKQKSPLNLPPGKMGYPIIGESLEFLSTGWKGHPEKFIFDRMRKYSSELFKTSIVGESTVVCCGAASNKFLFSNENKLVTAWWPDSVNKIFPTTSLDSNLKEESIKMRKLLPQFFKPEALQRYVGVMDVIAQRHFVTHWDNKNEITVYPLAKRYTFLLACRLFMSVEDENHVAKFSDPFQLIAAGIISLPIDLPGTPFNKAIKASNFIRKELIKIIKQRRVDLAEGTASPTQDILSHMLLTSDENGKSMNELNIADKILGLLIGGHDTASVACTFLVKYLGELPHIYDKVYQEQMEIAKSKPAGELLNWDDLKKMKYSWNVACEVMRLSPPLQGGFREAITDFMFNGFSIPKGWKLYWSANSTHKNAECFPMPEKFDPTRFEGNGPAPYTFVPFGGGPRMCPGKEYARLEILVFMHNLVKRFKWEKVIPDEKIIVDPFPIPAKDLPIRLYPHKA*

***

SEQ ID NO:29；AsHMGR(糙伏毛燕麦HMG-CoA还原酶)编码序列(1689bp)：

NB：以下提供了全长HMGR序列。可以除去5’区(画下划线)以产生截短的反馈不敏感的形式(tHMGR)。以下还分别给出了tHMGR的序列。

ATGGCTGTGGAGGTTCACCGCCGGGCTCCCGCGCCCCATGGCCGGGGCACCGGGGAGAAGGGCCGCGTG CAGGCCGGGGACGCGCTGCCGCTGCCGATCCGCCACACCAACCTCATCTTCTCGGCGCTCTTCGCCGCCTCCCTCGC ATACCTCATGCGCCGCTGGAGGGAGAAGATCCGCAACTCCACGCCGCTCCACGTCGTGGGGCTCACCGAGATCTTCG CCATCTGCGGCCTCGTCGCCTCCCTCATCTACCTCCTCAGCTTCTTCGGCATCGCCTTCGTGCAGTCCGTCGTATCC AACAGCGACGACGAGGACGAGGACTTCCTCATCGCGGCTGCAGCATCCCAGGCCCCCCCGCCGCCCTCCTCCAAGCC CGCGCCGCAGCAGTGCGCCCTGCTGCAGAGCGCCGGAGTCGCGCCCGAGAAAATGCCCGAGGAGGACGAGGAAATCGTCGCCGGGGTCGTCGCAGGGAAGATCCCCTCCTACGTGCTCGAGACCAGGCTAGGCGACTGCCGCAGGGCAGCCGGGATCCGCCGCGAGGCGCTGCGCCGGATCACCGGCAGGGAGATCGACGGCCTTCCCCTCGACGGCTTCGACTACGACTCGATTCTCGGACAGTGCTGCGAGATGCCCGTCGGGTACGTGCAGCTGCCGGTCGGCGTCGCGGGGCCGCTCGTCCTCGACGGCCGCCGCATATACGTCCCGATGGCCACCACGGAGGGCTGCCTAATCGCCAGCACCAACCGCGGATGCAAGGCCATTGCCGAGTCCGGAGGCGCATCCAGCGTCGTGTACCGCGACGGGATGACCCGCGCCCCCGTAGCCCGCTTCCCCTCCGCACGACGCGCCGCAGAGCTCAAGGGCTTCCTGGAGAATCCGGCCAACTACGACACCCTGTCCGTGGTCTTTAACAGATCAAGCAGATTTGCAAGGCTGCAGGGGGTCAAGTGCGCCATGGCTGGGAGGAACTTGTACATGAGGTTCACCTGCAGCACCGGGGATGCCATGGGGATGAACATGGTCTCCAAGGGCGTCCAAAATGTGCTCGACTATCTGCAGGAGGACTTCCCTGACATGGACGTTGTCAGCATCTCAGGCAACTTTTGTTCCGACAAGAAATCAGCTGCTGTAAACTGGATTGAAGGCCGTGGAAAGTCCGTGGTTTGTGAGGCAGTAATCAGAGAGGAAGTTGTCCACAAGGTTCTCAAGACCAACGTTCAGTCACTCGTGGAGTTGAATGTGATCAAGAACCTTGCTGGCTCAGCAGTTGCTGGTGCTCTTGGGGGTTTCAACGCCCACGCAAGCAACATCGTAACGGCTATCTTCATTGCCACTGGTCAGGATCCTGCACAGAATGTGGAGAGCTCACAGTGTATCACTATGTTGGAAGCTGTAAATGATGGCAGAGACCTTCACATCTCCGTTACAATGCCATCTATCGAGGTGGGCACAGTTGGTGGAGGCACGCAGCTGGCCTCACAGTCGGCCTGCTTGGACCTACTGGGCGTCAAAGGCGCCAACAGGGAATCTCCGGGGTCGAACGCTAGGCTGCTGGCCACGGTGGTGGCTGGTGCCGTCCTAGCTGGGGAGCTGTCCCTCATCTCCGCCCAAGCTGCCGGCCATCTGGTCCAGAGCCACATGAAATACAACAGATCCAGCAAGGACATGTCCAAGATCGCCTGCTGA

SEQ ID NO:30；AsHMGR(糙伏毛燕麦HMG-CoA还原酶)翻译的核苷酸序列(562aa)：

MAVEVHRRAPAPHGRGTGEKGRVQAGDALPLPIRHTNLIFSALFAASLAYLMRRWREKIRNSTPLHVV GLTEIFAICGLVASLIYLLSFFGIAFVQSVVSNSDDEDEDFLIAAAASQAPPPPSSKPAPQQCALLQSAGVAPEKMPEEDEEIVAGVVAGKIPSYVLETRLGDCRRAAGIRREALRRITGREIDGLPLDGFDYDSILGQCCEMPVGYVQLPVGVAGPLVLDGRRIYVPMATTEGCLIASTNRGCKAIAESGGASSVVYRDGMTRAPVARFPSARRAAELKGFLENPANYDTLSVVFNRSSRFARLQGVKCAMAGRNLYMRFTCSTGDAMGMNMVSKGVQNVLDYLQEDFPDMDVVSISGNFCSDKKSAAVNWIEGRGKSVVCEAVIREEVVHKVLKTNVQSLVELNVIKNLAGSAVAGALGGFNAHASNIVTAIFIATGQDPAQNVESSQCITMLEAVNDGRDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLDLLGVKGANRESPGSNARLLATVVAGAVLAGELSLISAQAAGHLVQSHMKYNRSSKDMSKIAC*

SEQ ID NO:31；AstHMGR(糙伏毛燕麦截短的HMG-CoA还原酶)编码序列(1275bp)：

ATGGCGCCCGAGAAAATGCCCGAGGAGGACGAGGAAATCGTCGCCGGGGTCGTCGCAGGGAAGATCCCCTCCTACGTGCTCGAGACCAGGCTAGGCGACTGCCGCAGGGCAGCCGGGATCCGCCGCGAGGCGCTGCGCCGGATCACCGGCAGGGAGATCGACGGCCTTCCCCTCGACGGCTTCGACTACGACTCGATTCTCGGACAGTGCTGCGAGATGCCCGTCGGGTACGTGCAGCTGCCGGTCGGCGTCGCGGGGCCGCTCGTCCTCGACGGCCGCCGCATATACGTCCCGATGGCCACCACGGAGGGCTGCCTAATCGCCAGCACCAACCGCGGATGCAAGGCCATTGCCGAGTCCGGAGGCGCATCCAGCGTCGTGTACCGCGACGGGATGACCCGCGCCCCCGTAGCCCGCTTCCCCTCCGCACGACGCGCCGCAGAGCTCAAGGGCTTCCTGGAGAATCCGGCCAACTACGACACCCTGTCCGTGGTCTTTAACAGATCAAGCAGATTTGCAAGGCTGCAGGGGGTCAAGTGCGCCATGGCTGGGAGGAACTTGTACATGAGGTTCACCTGCAGCACCGGGGATGCCATGGGGATGAACATGGTCTCCAAGGGCGTCCAAAATGTGCTCGACTATCTGCAGGAGGACTTCCCTGACATGGACGTTGTCAGCATCTCAGGCAACTTTTGTTCCGACAAGAAATCAGCTGCTGTAAACTGGATTGAAGGCCGTGGAAAGTCCGTGGTTTGTGAGGCAGTAATCAGAGAGGAAGTTGTCCACAAGGTTCTCAAGACCAACGTTCAGTCACTCGTGGAGTTGAATGTGATCAAGAACCTTGCTGGCTCAGCAGTTGCTGGTGCTCTTGGGGGTTTCAACGCCCACGCAAGCAACATCGTAACGGCTATCTTCATTGCCACTGGTCAGGATCCTGCACAGAATGTGGAGAGCTCACAGTGTATCACTATGTTGGAAGCTGTAAATGATGGCAGAGACCTTCACATCTCCGTTACAATGCCATCTATCGAGGTGGGCACAGTTGGTGGAGGCACGCAGCTGGCCTCACAGTCGGCCTGCTTGGACCTACTGGGCGTCAAAGGCGCCAACAGGGAATCTCCGGGGTCGAACGCTAGGCTGCTGGCCACGGTGGTGGCTGGTGCCGTCCTAGCTGGGGAGCTGTCCCTCATCTCCGCCCAAGCTGCCGGCCATCTGGTCCAGAGCCACATGAAATACAACAGATCCAGCAAGGACATGTCCAAGATCGCCTGCTGA

SEQ ID NO:32；AstHMGR(糙伏毛燕麦截短的HMG-CoA还原酶)翻译的核苷酸序列(424aa)：

MAPEKMPEEDEEIVAGVVAGKIPSYVLETRLGDCRRAAGIRREALRRITGREIDGLPLDGFDYDSILGQCCEMPVGYVQLPVGVAGPLVLDGRRIYVPMATTEGCLIASTNRGCKAIAESGGASSVVYRDGMTRAPVARFPSARRAAELKGFLENPANYDTLSVVFNRSSRFARLQGVKCAMAGRNLYMRFTCSTGDAMGMNMVSKGVQNVLDYLQEDFPDMDVVSISGNFCSDKKSAAVNWIEGRGKSVVCEAVIREEVVHKVLKTNVQSLVELNVIKNLAGSAVAGALGGFNAHASNIVTAIFIATGQDPAQNVESSQCITMLEAVNDGRDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLDLLGVKGANRESPGSNARLLATVVAGAVLAGELSLISAQAAGHLVQSHMKYNRSSKDMSKIAC*

***

SEQ ID NO:33；AsSQS(糙伏毛燕麦鲨烯合酶)编码序列(1212bp)：

ATGGGGGCGCTGTCGCGGCCGGAGGAGGTGGTGGCGCTGGTCAAGCTGAGGGTGGCGGCGGGGCAGATCAAGCGCCAGATCCCGGCCGAGGAACACTGGGCCTTCGCCTACGACATGCTCCAGAAGGTCTCCCGCAGCTTCGCGCTCGTCATCCAGCAGCTCGGACCCGAACTCCGCAATGCCGTGTGCATCTTCTACCTCGTGCTCCGGGCCCTGGACACCGTCGAGGACGACACCAGCATCCCCAACGACGTGAAGCTGCCCATCCTTCGGGATTTCTACCGCCATGTCTACAACCCCGACTGGCGTTATTCATGTGGAACAAACCACTACAAGGTGCTGATGGATAAGTTCAGACTCGTCTCCACGGCTTTCCTGGAGCTAGGCGAAGGATATCAAAAGGCAATTGAAGAAATCACTAGGCGAATGGGAGCAGGAATGGCAAAATTTATATGCCAGGAGGTTGAAACGATTGATGACTATAATGAGTACTGCCACTATGTAGCAGGGCTAGTAGGCTATGGACTTTCCAGGCTCTTTCATGCTGCTGGGACAGAAGATCTGGCTTCAGATCAACTTTCGAATTCAATGGGTTTGTTTCTTCAGAAAACCAATATAATAAGGGATTATTTGGAGGATATAAATGAGATACCAAAGTGCCGTATGTTTTGGCCTCGAGAAATATGGAGTAAATATGCAGATAAACTTGAGGACCTCAAGTATGAGGAAAATTCAGAAAAAGCAGTGCAATGCTTGAATGATATGGTGACTAATGCTTTGGTCCACGCCGAAGACTGTCTTCAATACATGTCTGCGTTGAAGGATAATACTAATTTTCGGTTTTGTGCAATACCTCAGATAATGGCAATTGGGACATGTGCTATTTGCTACAATAATGTGAAAGTCTTTAGAGGAGTTGTTAAGATGAGGCGTGGGCTCACTGCACGAATAATTGATGAGACAAAATCAATGTCAGATGTCTATTCTGCTTTCTATGAGTTCTCTTCATTGCTAGAGTCAAAGATTGACGATAACGACCCAAGTTCTGCACTAACACGGAAGCGTGTAGAGGCAATAAAGAGGACTTGCAAGTCATCCGGTTTACTAAAGAGAAGGGGATACGACCTGGAAAAGTCAAAGTATAGGCATATGTTGATCATGCTTGCACTTCTGTTGGTGGCTATTATCTTCGGTGTACTGTACGCCAAGTGA

SEQ ID NO:34；AsSQS(糙伏毛燕麦鲨烯合酶)翻译的核苷酸序列(403aa)：

MGALSRPEEVVALVKLRVAAGQIKRQIPAEEHWAFAYDMLQKVSRSFALVIQQLGPELRNAVCIFYLVLRALDTVEDDTSIPNDVKLPILRDFYRHVYNPDWRYSCGTNHYKVLMDKFRLVSTAFLELGEGYQKAIEEITRRMGAGMAKFICQEVETIDDYNEYCHYVAGLVGYGLSRLFHAAGTEDLASDQLSNSMGLFLQKTNIIRDYLEDINEIPKCRMFWPREIWSKYADKLEDLKYEENSEKAVQCLNDMVTNALVHAEDCLQYMSALKDNTNFRFCAIPQIMAIGTCAICYNNVKVFRGVVKMRRGLTARIIDETKSMSDVYSAFYEFSSLLESKIDDNDPSSALTRKRVEAIKRTCKSSGLLKRRGYDLEKSKYRHMLIMLALLLVAIIFGVLYAK*

SEQ ID NO:35；AtATR2(拟南芥细胞色素P450还原酶2)编码序列(2325bp)：

atgaaaaacatgatgaattataaattaaaactctgttctgtctcaaaaaactcaaaaggagtctctctctcacctacaccacacctaaccaaaccccctacgattcacacagagagagatcttcttcttccttcttcttccttcttctttcttcttctttcttcttctagctacaacatctacaacgccatgtcctcttcttcttcttcgtcaacctccatgatcgatctcatggcagcaatcatcaaaggagagcctgtaattgtctccgacccagctaatgcctccgcttacgagtccgtagctgctgaattatcctctatgcttatagagaatcgtcaattcgccatgattgttaccacttccattgctgttcttattggttgcatcgttatgctcgtttggaggagatccggttctgggaattcaaaacgtgtcgagcctcttaagcctttggttattaagcctcgtgaggaagagattgatgatgggcgtaagaaagttaccatctttttcggtacacaaactggtactgctgaaggttttgcaaaggctttaggagaagaagctaaagcaagatatgaaaagaccagattcaaaatcgttgatttggatgattacgcggctgatgatgatgagtatgaggagaaattgaagaaagaggatgtggctttcttcttcttagccacatatggagatggtgagcctaccgacaatgcagcgagattctacaaatggttcaccgaggggaatgacagaggagaatggcttaagaacttgaagtatggagtgtttggattaggaaacagacaatatgagcattttaataaggttgccaaagttgtagatgacattcttgtcgaacaaggtgcacagcgtcttgtacaagttggtcttggagatgatgaccagtgtattgaagatgactttaccgcttggcgagaagcattgtggcccgagcttgatacaatactgagggaagaaggggatacagctgttgccacaccatacactgcagctgtgttagaatacagagtttctattcacgactctgaagatgccaaattcaatgatataaacatggcaaatgggaatggttacactgtgtttgatgctcaacatccttacaaagcaaatgtcgctgttaaaagggagcttcatactcccgagtctgatcgttcttgtatccatttggaatttgacattgctggaagtggacttacgtatgaaactggagatcatgttggtgtactttgtgataacttaagtgaaactgtagatgaagctcttagattgctggatatgtcacctgatacttatttctcacttcacgctgaaaaagaagacggcacaccaatcagcagctcactgcctcctcccttcccaccttgcaacttgagaacagcgcttacacgatatgcatgtcttttgagttctccaaagaagtctgctttagttgcgttggctgctcatgcatctgatcctaccgaagcagaacgattaaaacaccttgcttcacctgctggaaaggatgaatattcaaagtgggtagtagagagtcaaagaagtctacttgaggtgatggccgagtttccttcagccaagccaccacttggtgtcttcttcgctggagttgctccaaggttgcagcctaggttctattcgatatcatcatcgcccaagattgctgaaactagaattcacgtcacatgtgcactggtttatgagaaaatgccaactggcaggattcataagggagtgtgttccacttggatgaagaatgctgtgccttacgagaagagtgaaaactgttcctcggcgccgatatttgttaggcaatccaacttcaagcttccttctgattctaaggtaccgatcatcatgatcggtccagggactggattagctccattcagaggattccttcaggaaagactagcgttggtagaatctggtgttgaacttgggccatcagttttgttctttggatgcagaaaccgtagaatggatttcatctacgaggaagagctccagcgatttgttgagagtggtgctctcgcagagctaagtgtcgccttctctcgtgaaggacccaccaaagaatacgtacagcacaagatgatggacaaggcttctgatatctggaatatgatctctcaaggagcttatttatatgtttgtggtgacgccaaaggcatggcaagagatgttcacagatctctccacacaatagctcaagaacaggggtcaatggattcaactaaagcagagggcttcgtgaagaatctgcaaacgagtggaagatatcttagagatgtatggtaa

SEQ ID NO:36；AtATR2(拟南芥细胞色素P450还原酶2)翻译的核苷酸序列(774aa)：

MKNMMNYKLKLCSVSKNSKGVSLSPTPHLTKPPTIHTERDLLLPSSSFFFLLLSSSSYNIYNAMSSSSSSSTSMIDLMAAIIKGEPVIVSDPANASAYESVAAELSSMLIENRQFAMIVTTSIAVLIGCIVMLVWRRSGSGNSKRVEPLKPLVIKPREEEIDDGRKKVTIFFGTQTGTAEGFAKALGEEAKARYEKTRFKIVDLDDYAADDDEYEEKLKKEDVAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGNDRGEWLKNLKYGVFGLGNRQYEHFNKVAKVVDDILVEQGAQRLVQVGLGDDDQCIEDDFTAWREALWPELDTILREEGDTAVATPYTAAVLEYRVSIHDSEDAKFNDINMANGNGYTVFDAQHPYKANVAVKRELHTPESDRSCIHLEFDIAGSGLTYETGDHVGVLCDNLSETVDEALRLLDMSPDTYFSLHAEKEDGTPISSSLPPPFPPCNLRTALTRYACLLSSPKKSALVALAAHASDPTEAERLKHLASPAGKDEYSKWVVESQRSLLEVMAEFPSAKPPLGVFFAGVAPRLQPRFYSISSSPKIAETRIHVTCALVYEKMPTGRIHKGVCSTWMKNAVPYEKSENCSSAPIFVRQSNFKLPSDSKVPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALVESGVELGPSVLFFGCRNRRMDFIYEEELQRFVESGALAELSVAFSREGPTKEYVQHKMMDKASDIWNMISQGAYLYVCGDAKGMARDVHRSLHTIAQEQGSMDSTKAEGFVKNLQTSGRYLRDVW*